针对冠状病毒的疫苗及其使用方法

相关申请的交叉引用

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本申请进一步涉及2022年4月13日提交的美国申请号17/720,025；2022年4月13日提交的国际申请号PCT/US2022/071691；2021年4月13日提交的美国临时申请号63/174,375；2021年6月25日提交的美国临时申请号63/215,172；2021年9月23日提交的美国临时申请号63/247,707；2022年2月11日提交的美国临时申请号63/309,387；以及2022年2月25日提交的美国临时申请号63/314,074。这些申请中的每个申请的内容通过全文引用的方式并入本文中。

技术领域

本发明涉及一种用于严重急性呼吸系统综合征冠状病毒2(SARS-CoV-2)的疫苗和施用所述疫苗的方法。

背景技术

COVID-19，先前称为2019-nCoV肺炎或疾病，已迅速成为对公共卫生的全球威胁，与严重急性呼吸系统综合征(SARS)和中东呼吸系统综合征(MERS)一起出现在已从动物传播到人的越来越多的冠状病毒相关疾病中。迫切需要如疫苗等医疗对策来对抗此类新兴冠状病毒的传播。存在至少七种经鉴定的感染人类的冠状病毒，包含MERS-CoV和SARS-CoV。

冠状病毒SARS-CoV-2是从感染患者的人气道上皮细胞中分离和测序的(Zhu等人ANovel Coronavirus from Patients with Pneumonia in China,2019.N Engl JMed.2020；Wu等人A new coronavirus associated with human respiratory disease inChina.Nature.2020)。疾病症状范围从轻微的流感样到严重的危及生命的肺炎。全球形势在不断演进，并且2020年1月30日，世界卫生组织宣布COVID-19为国际关注的突发公共卫生事件(PHEIC)。

发明内容

本文提供在有此需要的受试者中诱导针对严重急性呼吸系统综合征冠状病毒2(SARS-CoV-2)的免疫应答的方法。在一些实施例中，诱导免疫应答的方法包括施用有效量的pGX9501、INO-4800、或其生物仿制药。本文还提供保护有此需要的受试者免受SARS-CoV-2感染的方法，该方法包括向受试者施用有效量的pGX9501、INO-4800、或其生物仿制药。进一步提供在有此需要的受试者中治疗SARS-CoV-2感染的方法，该方法包括向受试者施用有效量的pGX9501、INO-4800、或其生物仿制药。在这些方法中的任何方法中，所述施用可以包含电穿孔和注射中的至少一者。根据一些实施例，所述施用包括肠胃外施用，例如通过皮内、肌内或皮下注射，任选地然后是电穿孔。在所公开的方法的一些实施例中，向受试者施用约1.0mg至约2.0mg核酸分子pGX9501或其生物仿制药的初始剂量，任选地该初始剂量为1.0mg或2.0mg核酸分子。该方法可进一步涉及在初始剂量之后约四周，向受试者施用约1.0mg至约2.0mg核酸分子pGX9501或其生物仿制药的后续剂量，任选地其中该后续剂量为1.0mg或2.0mg核酸分子。在再进一步的实施例中，该方法涉及在初始剂量之后至少十二周，向受试者施用约1.0mg至约2.0mg核酸分子pGX9501或其生物仿制药的一个或多个进一步后续剂量，任选地其中该进一步后续剂量为1.0mg或2.0mg核酸分子。本文还提供有效量的pGX9501、INO-4800、或其生物仿制药在一种在有此需要的受试者中诱导针对严重急性呼吸系统综合征冠状病毒2(SARS-CoV-2)的免疫应答的方法中的用途。根据一些实施例中，该用途在针对与SARS-CoV-2感染相关联的疾病或病症进行治疗或保护中有效，该疾病或病症诸如但不限于2019冠状病毒病(COVID-19)、成人多系统炎症综合征(MIS-A)或儿童多系统炎症综合征(MIS-C)。进一步提供有效量的pGX9501、INO-4800、或其生物仿制药在一种保护受试者免受严重急性呼吸系统综合征冠状病毒2(SARS-CoV-2)感染的方法中的用途。根据一些实施例中，该用途在针对与SARS-CoV-2感染相关联的疾病或病症进行治疗或保护中有效，该疾病或病症诸如但不限于2019冠状病毒病(COVID-19)、成人多系统炎症综合征(MIS-A)或儿童多系统炎症综合征(MIS-C)。本文还提供有效量的pGX9501、INO-4800、或其生物仿制药在一种针对SARS-CoV-2感染来对治疗受试者的方法中的用途。根据一些实施例中，该用途在针对与SARS-CoV-2感染相关联的疾病或病症进行治疗或保护中有效，该疾病或病症诸如但不限于2019冠状病毒病(COVID-19)、成人多系统炎症综合征(MIS-A)或儿童多系统炎症综合征(MIS-C)。根据这些用途中的任一者，pGX9501、INO-4800、或其生物仿制药可以通过电穿孔和注射中的至少一者向受试者施用。在一些实施例中，经胃肠外，例如通过皮内、肌肉内或皮下注射，任选地然后进行电穿孔，向受试者施用pGX9501、INO-4800、或其生物仿制药。在所公开的用途的一些实施例中，向受试者施用约1.0mg至约2.0mg核酸分子pGX9501或其生物仿制药的初始剂量，任选地该初始剂量为1.0mg或2.0mg核酸分子。该用途可进一步涉及在初始剂量之后约四周，向受试者施用约1.0mg至约2.0mg pGX9501的核酸分子、INO-4800、或其生物仿制药的后续剂量，任选地其中该后续剂量为1.0mg或2.0mg核酸分子。在再进一步的实施例中，该用途涉及在初始剂量之后至少十二周，向受试者施用约1.0mg至约2.0mg pGX9501的核酸分子、INO-4800、或其生物仿制药的一个或多个进一步后续剂量，任选地其中该进一步后续剂量为1.0mg或2.0mg核酸分子。

本文进一步提供有效量的pGX9501或其生物仿制药在制备药物中的用途，该药物用于针对严重急性呼吸系统综合征冠状病毒2(SARS-CoV-2)感染进行治疗或保护。在一些实施例中，所述药物用于治疗或防范与SARS-CoV-2感染相关的疾病或病症。在一些实施例中，所述药物用于治疗或防范2019冠状病毒病(COVID-19)、成人多系统炎症综合征(MIS-A)或儿童多系统炎症综合征(MIS-C)。

本文另外提供在有此需要的受试者中诱导针对严重急性呼吸系统综合征冠状病毒2(SARS-CoV-2)的免疫应答的方法，该方法包括向受试者施用有效量的：核酸分子，其包含SEQ ID NO:2的核苷酸55至3837的核酸序列、SEQ ID NO:2的核酸序列或SEQ ID NO:3的核酸序列；pGX9501；或INO-4800药品或其生物仿制药，其中该受试者表现出：如通过干扰素-γ(IFN-γ)酶联免疫斑点(ELISpot)测定测量的，抗原特异性细胞免疫应答相对于基线的增加；和/或如通过假病毒中和测定测量的，中和抗体应答相对于基线的增加。

还提供保护有此需要的受试者免受严重急性呼吸系统综合征冠状病毒2(SARS-CoV-2)感染或免受与严重急性呼吸系统综合征冠状病毒2(SARS-CoV-2)感染相关联的疾病或病症的方法，该方法包括向受试者施用有效量的：核酸分子，其包含SEQ ID NO:2的核苷酸55至3837的核酸序列、SEQ ID NO:2的核酸序列或SEQ ID NO:3的核酸序列；pGX9501；或INO-4800药品或其生物仿制药，其中该受试者表现出：如通过干扰素-γ(IFN-γ)酶联免疫斑点(ELISpot)测定测量的，抗原特异性细胞免疫应答相对于基线的增加；和/或如通过假病毒中和测定测量的，中和抗体应答相对于基线的增加。

还提供针对严重急性呼吸系统综合征冠状病毒2(SARS-CoV-2)感染来治疗有此需要的受试者的方法，该方法包括向受试者施用有效量的：核酸分子，其包含SEQ ID NO:2的核苷酸55至3837的核酸序列、SEQ ID NO:2的核酸序列或SEQ ID NO:3的核酸序列；pGX9501；或INO-4800药品或其生物仿制药，其中该受试者表现出：如通过干扰素-γ(IFN-γ)酶联免疫斑点(ELISpot)测定测量的，抗原特异性细胞免疫应答相对于基线的增加；和/或如通过假病毒中和测定测量的，中和抗体应答相对于基线的增加。根据一些实施例，受试者因此对一种或多种SARS-CoV-2毒株具有抗性。

本文提供在有此需要的受试者中诱导严重急性呼吸系统综合征冠状病毒2(SARS-CoV-2)刺突抗原特异性细胞免疫应答的方法，该方法包括向受试者施用有效量的：核酸分子，其包含SEQ ID NO:2的核苷酸55至3837的核酸序列、SEQ ID NO:2的核酸序列或SEQ IDNO:3的核酸序列；pGX9501；或INO-4800药品或其生物仿制药，其中该受试者表现出：如通过干扰素-γ(IFN-γ)酶联免疫斑点(ELISpot)测定测量的，抗原特异性细胞免疫应答相对于基线的增加。

本文还提供在有此需要的受试者中诱导针对严重急性呼吸系统综合征冠状病毒2(SARS-CoV-2)的中和抗体应答的方法，该方法包括向受试者施用有效量的：核酸分子，其包含SEQ ID NO:2的核苷酸55至3837的核酸序列、SEQ ID NO:2的核酸序列或SEQ ID NO:3的核酸序列；pGX9501；或INO-4800药品或其生物仿制药，其中该受试者表现出：如通过假病毒中和测定测量的，中和抗体应答相对于基线的增加。

可以在初始施用之后约6周，测量抗原特异性细胞免疫应答的增加和/或中和抗体应答的增加。

根据该方法的一些实施例，施用包括电穿孔和注射中的至少一者。例如，肠胃外施用后可以进行电穿孔。

根据一些实施例，可以向受试者施用包括约1.0mg至约2.0mg核酸分子pGX9501或其生物仿制药的初始剂量。例如，初始剂量可包括1.0mg或2.0mg核酸。可以在初始剂量之后约四周，向受试者施用包括约1.0mg至约2.0mg核酸分子pGX9501或其生物仿制药的后续剂量。例如，后续剂量可包括1.0mg或2.0mg核酸分子。可以在初始剂量之后至少十二周，向受试者施用包括约1.0mg至约2.0mg核酸分子pGX9501或其生物仿制药的一个或多个进一步剂量，任选地其中该进一步剂量包括1.0mg或2.0mg核酸分子。

根据一些实施例，向受试者施用INO-4800药品。在一些实施例中，可以向受试者施用至少一种用于治疗SARS-CoV-2感染或者治疗或预防与SARS-CoV-2感染相关联的疾病或病症的另外的药剂。可以在该另外的药剂之前、同时或之后，向受试者施用：核酸分子，其包含SEQ ID NO:2的核苷酸55至3837的核酸序列、SEQ ID NO:2的核酸序列或SEQ ID NO:3的核酸序列；pGX9501；INO-4800；或其生物仿制药。

根据一些实施例，该方法在临床上被证明是安全的和/或在临床上被证明是有效的。

附图说明

图1A、1B、1C和1D示出SARS-CoV-2合成DNA疫苗构建体的设计和表达。图1A显示SARS-CoV-2合成DNA疫苗构建体pGX9501(匹配)和pGX9503(离群(OL))的示意图，该构建体含有IgE前导序列和SARS-CoV-2刺突蛋白插入(“Covid-19刺突抗原”或“Covid-19刺突-OL抗原”)。图1B显示来自用pGX9501或pGX9503一式两份转染的COS-7细胞的RNA提取物的RT-PCR测定的结果。使用针对每个靶标和COS-7β-肌动蛋白mRNA设计的PCR测定通过RT-PCR分析提取的RNA，用作内部表达归一化基因。Delta C

图2示出使用来自经INO-4800治疗的小鼠的血清对一组SARS-CoV-2和SARS-CoV抗原进行的IgG结合筛选。如方法中所描述的，在第0天用25μg INO-4800或pVAX-空载体(对照)免疫BALB/c小鼠。在第14天，对来自小鼠的1:50和1:250血清稀释度的IgG进行的蛋白抗原结合。示出的数据表示每组4只小鼠的平均OD450 nm值(平均值+SD)。

图3A、3B、3C和3D展示在INO-4800的单个剂量之后在BALB/c小鼠中对SARS-CoV-2S1+2和S受体结合结构域(RBD)蛋白抗原的体液应答。如实例1中所述，在第0天用指定剂量的INO-4800或pVAX-空载体对BALB/c小鼠进行免疫。显示了在第14天小鼠的连续血清稀释液中的IgG的SARS-CoV-2S1+2(图3A)或SARS-CoV-2RBD(图3B)蛋白抗原结合。所示数据表示每组8只小鼠(图3A和3B)和5只小鼠(图3C和3D)的平均OD450 nm值(平均值+SD)。与SARS-CoV-2S1+2(图3B)和SARS-CoV-2RBD(图3D)蛋白的血清IgG结合端点滴度。数据表示2个独立实验。

图4A和4B示出在用INO-4800免疫之后的中和抗体应答。BALB/c小鼠(每组5只)在第0天和第14天用10μg的INO-4800免疫两次。在第2次免疫后第7天收集血清，并且将连续稀释液与显示SARS-CoV-2刺突的假病毒一起孵育并与ACE2-293T细胞共孵育。图4A显示在原初和经INO-4800免疫的小鼠中的中和ID50(平均值±SD)。图4B显示来自原初小鼠和如方法中所述用INO-4800进行疫苗接种的小鼠的血清的相对发光单位(RLU)。

图5A和5B显示，在INO-4800的单一剂量之后，在哈特利(Hartley)豚鼠中对SARS-CoV-2的体液应答。如实例1中所描述的，在第0天用100μg INO-4800或pVAX-空载体免疫哈特利豚鼠小鼠。图5A显示，在第0天和第14天，连续血清稀释液中的IgG的SARS-CoV-2S蛋白抗原结合。示出的数据表示5只豚鼠的平均OD450 nm值(平均值+SD)。图5B显示，在第14天，与SARS-CoV-2S蛋白的血清IgG结合滴度(平均值±SD)。P值通过曼-惠特尼检验(Mann-Whitney test)确定。

图6A至6F展示经INO-4800免疫的小鼠和豚鼠血清与ACE2受体竞争SARS-CoV-2刺突蛋白结合。图6A展示，可溶性ACE2受体以0.025μg/ml的EC50与CoV-2全长刺突结合。图6B展示，在用INO-4800进行第二次免疫之后，来自BALB/c小鼠(n为5每组)的纯化血清IgG产生了针对ACE2受体的显著竞争。来自动物的血清IgG样品一式三份运行。图6C展示，在用INO-4800进行第二次免疫后第7天，从n＝5只小鼠中纯化的IgG显示针对与SARS-CoV-2S1+2蛋白结合的ACE2受体的显著竞争。用于竞争测定的可溶性ACE2浓度为约0.1μg/ml。条表示AUC的平均值和标准偏差。图6D展示，如方法中所述，在第0天和第14天用100μg INO-4800或pVAX-空载体对哈特利豚鼠进行免疫。在添加ACE2蛋白的连续稀释液之前，将第28天收集的血清(1:20稀释)添加到经SARS-CoV-2涂覆的孔中。测量了对ACE2与SARS-CoV-2S蛋白结合的检测。在此实验中使用从5只经INO-4800处理和3只经pVAX处理的动物中收集的血清。图6E展示，在添加ACE2蛋白之前，将在第21天收集的豚鼠血清的连续稀释液添加到经SARS-CoV-2包被的孔中。测量了对ACE2与SARS-CoV-2S蛋白结合的检测。在此实验中使用从4只经INO-4800治疗和5只经pVAX治疗的豚鼠收集的血清。图6F描绘，与合并的原初小鼠IgG相比，在用INO-4800进行第二次免疫后第14天，从n＝5只小鼠中纯化的IgG显示针对与SARS-CoV-2刺突蛋白结合的ACE2受体的竞争。原初小鼠在单个柱中运行。接种疫苗的小鼠一式两份运行。如果误差条不可见，则误差小于数据点。

图7A至7D示出在经INO-4800免疫的动物的BAL中检测到SARS-CoV-2S蛋白反应性抗体。在第0天和第14天，用INO-4800或pVAX和在第21天收集的BAL对BALB/c小鼠(n为5每组)进行免疫(图7A和7B)。在第0天、第14天和第21天，用INO-4800或pVAX和在第42天收集的BAL对哈特利豚鼠(n为5每组)进行免疫(图7C和7D)。通过ELISA一式两份测定支气管肺泡灌洗液的SARS-CoV-2刺突蛋白特异性IgG抗体。数据呈现为端点滴度(图7A和7C)，以及具有原始OD 450nm值的BAL稀释曲线(图7B和7D)。在图7A和7C中，条表示每组的平均值，并且误差条表示标准偏差。**p<0.01，曼-惠特尼U检验。

图8A至8C显示在施用INO-4800后的BALB/c小鼠中诱导T细胞应答。用2.5或10μgINO-4800免疫BALB/c小鼠(n＝5/组)。在第4、7、10天(图8A和8B)和第14天(图8C)，对动物的T细胞应答进行分析。通过IFN-γELISpot测量在用跨越SARS-CoV-2(图8A)、SARS-CoV(图8B)或MERS-CoV(图8C)刺突蛋白的重叠肽池刺激20小时的脾细胞中的T细胞应答。条形图表示平均值+SD。

图9和10示出在经INO-4800治疗的新西兰白(NZW)兔中测量的细胞免疫应答和体液免疫应答。第0天和第28天皮内递送pDNA。PBMC IFN-γELISpot(图9)；血清IgG结合ELISA(图10)。

图11A至11E示出在经INO-4800治疗的恒河猴中测量的对SARS-CoV-2刺突蛋白的体液免疫应答。第0天和第28天皮内递送pDNA。血清IgG结合ELISA。

图12A至12G示出在经INO-4800治疗的恒河猴中测量的对SARS和MERS刺突蛋白的体液免疫应答。第0天和第28天皮内递送pDNA。血清IgG结合ELISA。(图12A至12G；左图，1mgINO-4800；右图，2mg INO-4800)。

图13A至13C示出在第0天和第28天皮内进行pDNA的皮内递送后，通过PBMC IFN-γELISpot在经INO-4800治疗的恒河猴中测量的细胞免疫应答。结果在图13A(SARS CoV-2刺突肽)；13B(SARS CoV刺突肽)；以及13C(MERS CoV刺突肽)中显示。

图14A和14B显示在向BALB/c小鼠施用INO-4800之后的T细胞表位映射。用SARS-CoV-2肽基质作图池刺激脾细胞20小时。图14A展示用基质映射SARS-CoV-2肽池进行刺激后的T细胞应答。条形图表示5只小鼠的平均值+SD。图14B显示BALB/c小鼠中的SARS-CoV-2刺突蛋白的图谱和对免疫显性肽的鉴定。包含已知的免疫显性SARS-CoV HLA-A2表位用于比较。图14B按出现顺序分别公开了SEQ ID NO:26至35。

图15A至15H描绘在咽区室和鼻区室中进行保护的体液相关性。(图15A至15D)在SARS-CoV-2攻击后第1天(图15A、15B)和第3天(图15C、15D)，咽病毒载量Log10 cDNA拷贝mL-1与微量中和滴度(图15A、15C)和RBD IgG结合端点滴度的相关性(图15B、15D)。(图15E至15H)对鼻病毒载量进行相同的分析。为两侧非参数斯皮尔曼(Spearman)秩相关分析提供的P值和R值。对照动物-红色实心圆圈，INO-4800X1-绿色实心圆圈和INO-4800X2-蓝色实心圆圈。

图16示出I期研究流程图。

图17A、17B、17C和17D示出I期临床研究的体液抗体应答。针对以下项来评定1.0mg剂量组和2.0mg剂量组中的体液应答：中和活病毒的能力(n＝18，1.0mg；n＝19，2.0mg)(图17A)；与RBD区的结合(图17B)；以及与整个刺突蛋白(S1和S2)的结合(图17C)。端点滴度计算为表现出高于基线的OD 3.0SD的滴度，基线滴度设置为1。在图17D中，针对结合整个刺突蛋白(S1和S2)的能力(n＝19，1.0mg；n＝19，2.0mg)，评定1.0mg剂量组和2.0mg剂量组中的体液应答。端点滴度计算为表现出高于基线的OD 3.0SD的滴度，基线滴度设置为1。对活病毒中和的应答是PRNT IC50≥10。在所有图中，水平线表示中值，并且条表示四分位距。

图18A至18G示出I期临床研究细胞免疫应答分析结果。在体外用SARS-CoV-2刺突抗原来刺激从疫苗接种的个体中分离的PBMC。对于1.0mg剂量组和2.0mg剂量组，在标准ELISpot测定中测量能够分泌IFN-γ的细胞数量(图18A)。水平线表示中值，并且条表示四分位距。如图18B所示，跨越整个刺突抗原的肽被分成池，并且在ELISpot中单独地测试，其中池映射到抗原的特定区域。示出了三个受试者，例示了池应答的多样性和跨受试者的相关幅度。饼形图表示整个2.0mg剂量组的多样性。如图18C所示，通过流式细胞术从CD4+和CD8+T细胞测量SARS-CoV-2刺突特异性细胞因子产生。条形图表示平均应答。图18D中使用CCR7和CD45RA将细胞因子产生另外地分解为中枢记忆(CM)、效应记忆(EM)或效应(E)分化状态，其中数据传达了总体细胞因子应答的百分比源自哪个分化组。表示每个剂量队列的CD4+和CD8+T细胞的多功能性的饼形图在图18E中提供。由每个剂量队列的CD4+T细胞产生的IL-4在图18F中示出。水平线表示平均应答。图表示所有可评估的受试者。对所有配对数据集进行统计分析。那些显著的在图中注明，图中没有符号表示缺乏统计学意义。图18G提供2.0mg剂量组中的每个受试者的热图，以及其专门针对覆盖SARS-CoV-2刺突抗原的每个池的ELISpot应答百分比。

图19A(第一剂量后)和图19B(第二剂量后)以轻度(1级)、中度(2级)、重度(3级)和危及生命(4级)的严重程度示出I期相关全身性和局部不良事件。

图20提供体液免疫应答的补充数据。通过ELISpot测定测试的三个康复样品(所有3个有症状但未住院)在第8周示出了比2.0mg剂量组更低的T细胞应答，其中中值为33。

图21提供补充的酶联免疫斑点(ELISpot)数据。

图22A至22F描绘用INO-4800进行疫苗接种的恒河猴的体液应答和细胞应答。研究概述(图22A)。在接受INO-4800的1或2个剂量或未进行疫苗接种(对照)的恒河猴的血清中测量的刺突特异性IgG(图22B)、RBD(图22C)和活病毒中和抗体(图22D)。线表示几何平均值。用INO-4800进行疫苗接种的恒河猴的细胞免疫应答。在接受INO-4800的1或2个剂量或者在攻击前(图22E)和攻击后(图22F)未进行疫苗接种(对照)的恒河猴中测量从PBMC分泌的SARS-CoV-2刺突特异性干扰素γ(IFNγ)。PBMC用5个单独的肽池刺激，所述肽池跨越刺突蛋白和响应于每个池求和而测量的SFU频率。线表示平均值。

图23A至23C示出在研究持续期间动物的体重、温度和血红蛋白的改变。动物接受一个(INO-4800X1)或两个(INO-4800X2)剂量的INO-4800或未接种疫苗(对照)。记录单个动物的体重(图23A)、温度(图23B)和血红蛋白计数(图23C)的百分比变化，并且在攻击前和攻击后的指定时间点作图。线表示每组的平均值(图23A)和几何平均值(图23B和图23C)。

图24A至24F示出用SARS-CoV-2进行攻击后通过RT-qPCR检测到的上呼吸道病毒载量。动物接受一个(INO-4800X1)或两个(INO-4800X2)剂量的INO-4800或未接种疫苗(对照)。对于每只动物，在咽拭子(图24A至24C)和鼻拭子(图24D至24F)中的病毒载量绘制为Log10 cDNA拷贝/ml。(图24A和24D)线表示具有95％ CI的组几何平均值。每个实验组的咽拭子(图24B)和鼻拭子(图24E)的病毒载量曲线下面积(AUC)。在攻击期期间在每只动物的咽拭子(图24C)和鼻拭子(图24F)中测量的峰值病毒载量。LLOQ(定量下限，3.80log拷贝/ml)和LLOD(检测下限，3.47log拷贝/ml)。低于LLOQ检测到的阳性样品被指定为3.80log拷贝/ml。采用曼-惠特尼t检验，*p≤0.05。

图25A至25F示出在用SARS-CoV-2攻击后通过RT-qPCR检测到的上呼吸道亚基因组病毒载量。动物接受一个(INO-4800X1)或两个(INO-4800X2)剂量的INO-4800或未接种疫苗(对照)。对于每只动物，在咽拭子(图25A至25C)和鼻拭子(图25D至25F)中的病毒载量绘制为Log10 cDNA拷贝/ml。(图25A和25D)线表示具有95％ CI的组几何平均值。每个实验组的咽拭子(图25B)和鼻拭子(图25E)的病毒载量曲线下面积(AUC)。在攻击期期间在每只动物的咽拭子(图25C)和鼻拭子(图25F)中测量的峰值病毒载量。LLOQ(4.11log拷贝/mL)和LLOD(3.06log拷贝/mL)。低于LLOQ检测到的阳性样品被指定为3.81log拷贝/ml。

图26A至26D示出在用SARS-CoV-2攻击后通过RT-qPCR检测到的下呼吸道病毒载量。动物接受一个(INO-4800X1)或两个(INO-4800X1)剂量的INO-4800或未接种疫苗(对照)。在支气管肺泡灌洗液(BAL(图26A和26B))和在尸检时(攻击后6至8天)收集的肺组织(图26C和26D)样品中测量了单个动物的SARS-CoV-2基因组和亚基因组病毒载量。条形图表示组中值。方法部分提供了测定LLOQ和LLOD。

图27示出攻击后动物组织中的病毒RNA。动物接受一个(INO-4800X1)或两个(INO-4800X2)剂量的INO-4800或未接种疫苗(对照)。在尸检(6-8DPC)时收集的组织样品中测量个体动物的SARS-CoV-2病毒载量。条形图表示具有95％ CI的组中值。检测到低于4.76log拷贝/ml的定量限(LoQ)的阳性组织样品被指定为5拷贝/μl的值，这相当于4.46log拷贝/g，而未检测到的样品被指定为<2.3拷贝/μl的值，相当于测定的检测下限(LoD)，所述LoD等于4.76log拷贝/g。

图28显示在用1个剂量(上)、2个剂量(中)进行疫苗接种或未进行疫苗接种(下)的动物中的代表性组织病理学(H&E染色)和SARS-CoV-2病毒RNA(ISH RNAScope染色)的存在。用1个剂量进行疫苗接种的动物示出了多病灶最小至轻度肺泡和间质性肺炎(*)，其中动物10A的严重程度更高。来自第1组的其余动物示出了最小/轻度炎症浸润(*)。还观察到轻度的血管周围管现象(箭头)，并且通过ISH示出病变内的病毒RNA(箭头)，在动物10A中大量存在，在动物30A、24A、21A和38A中少量(箭头)。用2个剂量进行疫苗接种的动物示出了多病灶最小至轻度肺泡和间质性肺炎(*)连同最小血管周围管现象(箭头)一起。通过ISH在动物9A、45A、33A和13A(箭头)的病变中观察到少量病毒RNA。未接种疫苗的动物示出了中度多病灶肺泡和间质性肺炎(*)，其中所有动物的病变内均存在丰富的病毒RNA(箭头)。

图29A至29G示出在用SARS-CoV-2攻击后通过组织病理学和CT扫描测量的肺部疾病负担。总组织病理学评分(图29A)，以及对ISH RNAScope标记切片中针对病毒RNA的正染色区域的图像分析(图29B)。图29C提供单个动物的每个参数的组织病理学评分的热图说明。总CT评分(图29E)。单个动物的CT放射学评分(图29D至29G)。图29D：异常程度受影响的肺部所占的百分比。(图29E：基于结节的存在、磨玻璃影和实变进行评分的COVID疾病模式。图29F：区域分类(将肺分为12个区域，并且将每个显示异常的区域归为1分)。图29G：总累积CT评分(模式+区域评分)。图上的线表示组的中值。采用曼-惠特尼t检验，*p≤0.05。

图30示出在从CT扫描构建的图像上鉴定出的肺部异常的代表性实例。图像表示未接受疫苗接种的动物(对照)：8A[A]、25A[B]、28A[C]、14A[D]、50A[E]；接受INO-4800疫苗的单一剂量的动物：10A[F]、21A[G]、38A[H]；接受INO-4800疫苗的两个剂量的动物：21A[I]、33A[J]。箭头指示磨玻璃影区域和实变区域。没有示出来自没有异常特征的猕猴的图像。

图31A至图31F描绘在用SARS-CoV-2和SARS抗原刺激之后，IFN-γ+小鼠脾细胞的ELISpot图像。在第0天对小鼠进行免疫并且在指定的时间点采集脾细胞。通过ELISpot测定对经免疫的动物的脾脏中的分泌IFNγ的细胞进行计数。代表性图像显示，在免疫后第4、7和10天，脾细胞群体中的SARS-CoV-2特异性(图31A至图31C)和SARS-CoV特异性(图31D至图31F)IFNγ斑点形成单位。图像由ImmunoSpot CTL读取器捕获。

图32A和图32B描绘在SARS-CoV-2S蛋白刺激后对产生IFN-γ的T细胞群体的流式细胞术分析。将在pVAX或INO-4800处理之后14天从BALB/c和C57BL/6小鼠中采集的脾细胞制成单细胞悬浮液。用SARS-CoV-2重叠肽池刺激细胞6小时。图32A：CD4+和CD8+T细胞门控策略；单峰在(i)上进行门控，然后是淋巴细胞(ii)，随后是活CD45+细胞(iii)。之后，对CD3+细胞进行门控(iv)，并且从中对CD4+(v)和CD8+(vi)T细胞进行门控。对CD4+(vii)和CD8+(viii)T细胞群体中的每一个中的IFNγ+细胞进行门控。图32B：描绘了产生IFNγ的CD4+和CD8+T细胞的百分比。条表示平均值+SD。此研究中使用了4只BALB/c和4只C57BL/6小鼠。*p<0.05，曼惠特尼检验。

图33A至33H描绘在恒河猴中的体液免疫应答和细胞免疫应答。图33A：显示疫苗接种方案和血液收集时间点的研究概述。图33B：SARS-CoV-2刺突蛋白的示意图。图33C：在第0、2、6、12和15周收集的连续稀释的NHP血清中，SARS-CoV-2S1+S2ECD、S1、RBD和S2蛋白抗原与IgG的结合。数据表示每个单独NHP的平均端点滴度。(图33D和33E)使用NHP血清的假中和测定，其显示存在针对SARS-CoV-2的D614变种(图33D)和G614变种(图33E)的SARS-CoV-2特异性中和抗体。图33F和图33G：在第6周从经INO-4800疫苗接种的NHP中收集的血清抑制ACE2结合。图33F：基于板的ACE2竞争测定。图33G：基于流动的ACE2抑制测定显示在连续稀释的NHP血清中抑制ACE2结合。图33H：在第0、2、6和15周采集的PBMC中通过IFN-γELISpot测量T细胞应答，并用跨越SARS-CoV-2刺突蛋白的重叠肽池刺激20小时。条表示平均值+SD。

图34描绘血清IgG对SARS-CoV和MERS-CoV刺突蛋白的交叉反应性。在经INO-4800疫苗接种的恒河猴的血清中测量了IgG与SARS-CoV S1和MERS-CoV S1蛋白抗原的结合。

图35描绘对SARS-CoV-2S蛋白抗原有反应的支气管肺泡灌洗液(BAL)IgG。评定了从进行疫苗接种的动物收集的BAL样品的SARS-CoV-2反应性IgG与全长SARS-CoV-2刺突蛋白和RBD结构域的结合。

图36A和图36B描绘示例性实验数据，该数据证明了细胞应答对SARS-CoV和MERS-CoV刺突蛋白的交叉反应性。在用跨越SARS-CoV-1刺突蛋白(图36A)和MERS-CoV刺突蛋白(图36B)的重叠肽池刺激之后，通过IFNγELISpot分析PBMC应答。条形图表示平均值+SD。

图37A至图37C描绘示例性实验，该实验证明了在病毒攻击之后对体液免疫应答的召回。图37A：研究概述。图37B：IgG结合ELISA。攻击前、攻击期间和攻击后收集的经稀释的NHP血清中的IgG的SARS-CoV-2S1+S2和SARS-CoV-2RBD蛋白抗原结合。图37C：使用NHP血清进行的假中和测定，其显示在经INO-4800疫苗接种的动物(上图)和原初动物(下图)中进行病毒攻击之前和之后，存在针对SARS-CoV-2的D614和G614变体的SARS-CoV-2特异性中和抗体。

图38描绘示例性实验，该实验证明了在病毒攻击之后对细胞免疫应答的召回。在用跨越SARS-CoV-2刺突蛋白的重叠肽池刺激的PBMC中，通过IFNγELISpot分析T细胞应答。条形图表示平均值+SD。通过IFNγELISpot分析在用SARS-CoV-2病毒攻击前后分离的PBMC中的T细胞应答。左图原初动物，右图经INO-4800疫苗接种的动物。

图39描绘示例性实验，该实验证明了在单个恒河猴中进行病毒攻击之后对细胞免疫应答的召回。在用跨越SARS-CoV-2刺突蛋白的重叠肽池刺激的PBMC中，通过IFNγELISpot分析病毒攻击前后的细胞应答。右图原初动物，左图经INO-4800疫苗接种的动物。

图40A至40F描绘在病毒攻击之后BAL液和鼻拭子中的病毒载量。在第17周，通过鼻内和气管内施用1.1x 10

图41详细描述实例7的2期入组信息。

图42鉴定在剂量1后28天内发生的不良事件。

图43鉴定在剂量2后28天内发生的不良事件。

图44提供实例6中详述的扩展I期临床试验的Consort流程图。

图45详细描述扩展1期临床试验研究参与者人口统计数据。

图46列出了扩展1期临床试验研究的相关全身性和局部不良事件。

图47A至47C提供按年龄、期限和剂量列出的扩展I期临床试验治疗相关不良事件的总结：A)十二名18-50岁参与者(20％)报告；B)五名51-64岁参与者(16.7％)；以及C)一名>65岁的参与者(3.3％)。除2级(中度)嗜睡、腹痛和注射部位瘙痒外，所有AE的严重程度均为1级(轻度)。如果有多次事件，则每个系统器官类别和每个首选术语仅对一名参与者计数一次。

图48A和48B显示INO-4800诱导针对SARS-CoV-2的抗体。如图48A所示，使用假病毒中和测定来评估功能性抗体。绘制发生50％中和(ID50)时的抑制稀释度。左图包括0.5mg剂量组中的n＝40名参与者、1.0mg剂量组中的n＝35名参与者和2.0mg剂量组中的n＝36名参与者。针对每个时间点，显示0.5mg(左)、1.0mg(中)和2.0mg(右)剂量组。右图分别包括0.5mg、1.0mg和2.0mg剂量组的n＝33、n＝26和n＝31名参与者。如图48B所示，使用ELISA来测量与刺突三聚体的结合抗体浓度。左图包括0.5mg剂量组中的n＝40名参与者、1.0mg剂量组中的n＝35名参与者和2.0mg剂量组中的n＝36名参与者。针对每个时间点，显示0.5mg(左)、1.0mg(中)和2.0mg(右)剂量组。右图分别包括0.5mg、1.0mg和2.0mg剂量组的n＝31、n＝29和n＝32名参与者。空心符号表示单个参与者，方框从第25百分位数延伸到第75百分位数，方框内的线为中位数，并且须从最小值延伸到最大值。平均值用“+”号表示。使用配对t检验来评定相对于基线的显著性。剂量组由橙色三角形(0.5mg)、蓝色圆圈(1.0mg)和绿色方块(2.0mg)表示。

图49详细描述来自扩展I期临床试验的样品的假病毒中和测定中的几何平均滴度(GMT)。

图50A和50B证明INO-4800在18-50、51-64和>65岁的所有年龄组中诱导针对SARS-CoV-2的抗体。如图50A所示，使用假病毒中和测定来评估功能性抗体。绘制发生50％中和(ID50)时的抑制稀释度。左图包括0.5mg剂量组的n＝40名参与者(n＝20，18-50岁；n＝10，51-64岁；以及n＝10，>65岁)、1.0mg剂量组的n＝35名参与者(n＝17，18-50岁；n＝9，51-64岁；以及n＝9，>65岁)和2.0mg剂量组的n＝36名参与者(n＝18，18-50岁；n＝8，51-64岁；以及n＝10，>65岁)。右图仅包括具有可用配对数据的参与者，在0.5mg、1.0mg和2.0mg剂量组中分别为n＝26(n＝12，18-50岁；n＝9，51-64岁；以及n＝5，>65岁)、n＝21(n＝11，18-50岁；n＝6，51-64岁；以及n＝4，>65岁)和n＝27(n＝15，18-50岁；n＝5，51-64岁；以及n＝7，>65岁)名参与者。如图50B所示，使用ELISA来测量与刺突三聚体的结合抗体浓度。左图包括0.5mg剂量组的n＝40名参与者(n＝20，18-50岁；n＝10，51-64岁；以及n＝10，>65岁)、1.0mg剂量组的n＝35名参与者(n＝17，18-50岁；n＝9，51-64岁；以及n＝9，>65岁)和2.0mg剂量组的n＝36名参与者(n＝18，18-50岁；n＝8，51-64岁；以及n＝10，>65岁)。右图仅包括具有可用配对数据的参与者，在0.5mg、1.0mg和2.0mg剂量组中分别为n＝31(n＝16，18-50岁；n＝8，51-64岁；以及n＝7，>65岁)、n＝29(n＝13，18-50岁；n＝8，51-64岁；以及n＝8，>65岁)和n＝32(n＝15，18-50岁；n＝7，51-64岁；以及n＝10，>65岁)名参与者。空心符号表示单个参与者，水平线表示GMT，并且须延伸至95％ CI值。使用配对t检验来评定相对于基线的显著性。剂量组由三角形(0.5mg)、圆形(1.0mg)和正方形(2.0mg)表示。

图51详细描述从扩展I期临床试验收集的样品的ELISA中的几何平均滴度(GMT)。

图52A至52C展示，INO-4800诱导细胞对SARS-CoV-2刺突的应答。如图52A所示，绘制IFN-g ELISpot中每10

图53A至53C显示，INO-4800在18-50、51-64和>65岁的所有年龄组中诱导对SARS-CoV-2刺突的细胞应答。如图53A所示，绘制IFN-g ELISpot中每10

图54A至54C展示，INO-4800诱导具有裂解潜力的刺突特异性活化CD8+T细胞。使用裂解颗粒加载流式细胞术测定来表征来自在基线或剂量2后收集的样品的活化标志物CD69和CD137(图54A)、CD38(图54B)以及增殖标志物Ki67(图54C)的表达。在裂解颗粒中发现的蛋白质的表达：颗粒酶A(GrzA)和B(GrzB)、穿孔素(Prf)和颗粒溶素(Gnly)，与活化/增殖子集一起进行评定。该图包括0.5mg剂量组中的n＝4名参与者、1.0mg剂量组中的n＝10名参与者以及2.0mg剂量组中的n＝13名。空心符号表示单个参与者，方框从第25百分位数延伸到第75百分位数，方框内的线为中位数，并且须从最小值延伸到最大值。平均值用“+”号表示。使用Wilcoxon符号秩来评定相对于基线的显著性。剂量组由三角形(0.5mg)、圆形(1.0mg)和正方形(2.0mg)表示。

具体实施方式

定义

除非另有定义，否则本文所使用的所有技术术语和科学术语具有与本领域的普通技术人员通常所理解的含义相同的含义。在有冲突的情况下，将以本文件(包含定义)为准。虽然以下描述了优选的方法和材料，但是与本文所描述的那些类似或相当的方法和材料可以用于本发明的实施或测试中。本文提及的所有出版物、专利申请、专利和其它参考文献通过引用以其整体并入本文。本文所公开的材料、方法和实例仅是说明性的，而不旨在是限制性的。

术语“包含”旨在包括由术语“基本上由……组成”和“由……组成”涵盖的实例；类似地，术语“基本上由……组成”旨在包括由术语“由……组成”涵盖的实例。本公开还设想了“包括”本文所呈现的实施例或元件、“由本文所呈现的实施例或元件组成”和“基本上由本文所呈现的实施例或元件组成”的其他实施例，无论是否明确地阐述。

应理解，为了清楚起见，本文在单独的实施例的上下文中描述的所公开的材料和方法的某些特征还可以在单一实施例中组合提供。相反，为了简洁起见，文中在单个实施例的上下描述的所公开的材料和方法的各种特征还可以单独提供或以任何子组合提供。

单数形式“一(a)”、“一个(an)”和“该(the)”包括复数指代，除非上下文另有明确说明。

术语“约”在参考数字范围、临界值或特定值使用时用于指示所叙述的值可能与所列值相差多达10％。因此，术语“约”用于涵盖与规定值相差±10％或更小的变化、±5％或更小的变化、±1％或更小的变化、±0.5％或更小的变化或±0.1％或更小的变化。在通过使用先行词“约”将值表达为近似值时，应理解，特定值形成另一个实施例。除非上下文另有明确规定，否则对特定数值的引用至少包含所述特定值。

如本文所用，“佐剂”意指添加到本文所描述的疫苗中以增强抗原的免疫原性的任何分子。

如本文所用，“抗体”意指IgG、IgM、IgA、IgD或IgE类的抗体或片段、其片段或衍生物，包含Fab、F(ab′)2、Fd和单链抗体、双抗体、双特异性抗体、双功能抗体和其衍生物。所述抗体可以是从哺乳动物的血清样品中分离的抗体，多克隆抗体，亲合纯化的抗体或其混合物，所述抗体或其混合物对期望的表位或由其衍生的序列表现出足够的结合特异性。

术语“生物仿制药”(经批准的参考产品/生物药物，即参考上市药物)是指与参考产品高度相似的生物产品，尽管临床非活性组分存在微小差异，但生物仿制药与参考产品在安全性、纯度和效力方面没有临床上有意义的差异，其数据基于(a)分析研究得到的数据，证明生物产品与参考产品高度相似，尽管临床非活性组分存在微小差异；(b)动物研究(包括毒性的评估)；和/或(c)一项或多项临床研究(包括免疫原性和药代动力学或药效学的评估)，其足以证明在一种或多种适当的使用条件下的安全性、纯度和效力，对于所述条件，参考产品被许可并意欲使用，且该生物仿制药正在申请许可。生物仿制药可以是可替换的产品，其可以在药房代替参考产品，而无需处方保健专业人员的干预。为了满足“可互换性”的附加标准，预期生物仿制药在任何给定患者中产生与参考产品相同的临床结果，并且如果生物仿制药向个体施用多于一次，则在使用生物仿制药和参考产品之间交替或转换的安全性或效力降低方面的风险不大于使用参考产品而没有这种交替或转换的风险。生物仿制药对于所提出的使用条件利用相同的作用机制，达到对于参考产品已知的机制的程度。生物仿制药标签中规定、推荐或建议的一种或多种使用条件之前已批准用于参考产品。生物仿制药的施用途径、剂型和/或强度与参考产品的相同，并且生物仿制药是在符合标准的设施中生产、加工、包装或保存的，该标准旨在确保该生物仿制药持续安全、纯净和有效。当与参考产品相比时，生物仿制药可以包括氨基酸序列中的微小修饰，例如N-或C-末端截短，其预期不会改变生物仿制药的性能。

本文所用的“编码序列”或“编码核酸”是指包含编码蛋白质的核苷酸序列的核酸(RNA或DNA分子)。编码序列可以进一步包括与调节元件可操作连接的起始和终止信号，该调节元件包括能够指导在施用核酸的个体或哺乳动物的细胞中表达的启动子和聚腺苷酸化信号。

如本文所用，“补体”或“互补”意指核酸在核酸分子的核苷酸或核苷酸类似物之间的沃森-克里克(例如，A-T/U和C-G)或胡斯坦碱基配对。

如本文所用，“共有”或“共有序列”可以意指基于对特定抗原的多个亚型的比对分析而构建的合成核酸序列或对应的多肽序列。所述序列可以用于针对特定抗原的多种亚型、血清型或毒株诱导广泛的免疫力。合成抗原，如融合蛋白，可以被操纵以产生共有序列(或共有抗原)。

如本文可互换使用的“电穿孔”、“电渗透”或“动电增强”(“EP”)意指使用跨膜电场脉冲在生物膜中诱导微观路径(孔)；它们的存在允许生物分子(如质粒、寡核苷酸、siRNA、药物、离子和水)从细胞膜的一侧传递到另一侧。

如本文所用，“片段”意指编码能够引发哺乳动物的免疫应答的多肽的核酸序列或其部分。片段可以是选自编码下述蛋白质片段的各种核苷酸序列中的至少一种的DNA片段。

关于多肽序列的“片段”或“免疫原性片段”意指能够引发哺乳动物的与全长野生型毒株SARS-CoV-2抗原交叉反应的免疫应答的多肽。共有蛋白质的片段可以包含至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或至少95％的共有蛋白质。在一些实施例中，共有蛋白的片段可以包括共有蛋白的至少20个氨基酸或更多、至少30个氨基酸或更多、至少40个氨基酸或更多、至少50个氨基酸或更多、至少60个氨基酸或更多、至少70个氨基酸或更多、至少80个氨基酸或更多、至少90个氨基酸或更多、至少100个氨基酸或更多、至少110个氨基酸或更多、至少120个氨基酸或更多、至少130个氨基酸或更多、至少140个氨基酸或更多、至少150个氨基酸或更多、至少160个氨基酸或更多、至少170个氨基酸或更多、至少180个氨基酸或更多、至少190个氨基酸或更多、至少200个氨基酸或更多、至少210个氨基酸或更多、至少220个氨基酸或更多、至少230个氨基酸或更多或至少240个氨基酸或更多。

如本文所用，术语“遗传构建体”是指包含编码蛋白质的核苷酸序列的DNA或RNA分子。编码序列包括与调节元件可操作连接的起始和终止信号，该调节元件包括能够指导在施用核酸分子的个体的细胞中的表达的启动子和聚腺苷酸化信号。如本文所用，术语“可表达形式”是指含有必需的调节元件的基因构建体，所述必需的调节元件与对蛋白质进行编码的编码序列可操作地连接，使得当存在于个体的细胞中时，将表达编码序列。

如本文在两个或更多个核酸或多肽序列的上下文中使用的“相同”或“同一性”意指该序列具有在指定区域上相同的指定百分比的残基。该百分比可以通过以下方法计算：将两条序列进行最佳比对，将两条序列在指定区域上进行比较，确定两条序列中出现相同残基的位置数目以得到匹配位置的数目，将匹配位置的数目除以指定区域中位置的总数，并将结果乘以100以得到序列同一性百分比。在两个序列具有不同长度或比对产生一个或多个交错末端且特定比较区域仅包括单个序列的情况下，单个序列的残基包括在计算的分母中但不包括在计算的分子中。当比较DNA和RNA时，胸腺嘧啶(T)和尿嘧啶(U)可以被认为是等同的。同一性可以人工进行或通过使用计算机序列算法(如BLAST或BLAST 2.0)进行。

如本文所用，“免疫应答”意指响应于抗原的引入而激活宿主的免疫系统，例如哺乳动物的免疫系统。免疫应答可以是细胞或体液应答或两者的形式。

如本文所用，“核酸”或“寡核苷酸”或“多核苷酸”或“核酸分子”意指共价连接在一起的至少两个核苷酸。单链的描述也定义了互补链的序列。因此，核酸也包括所描述的单链的互补链。核酸的许多变体可用于与给定核酸相同的目的。因此，核酸也包括基本上相同的核酸及其互补物。单链提供可以在严格杂交条件下与靶序列杂交的探针。因此，核酸也包括在严格杂交条件下杂交的探针。

核酸可以是单链或双链的，或者可以含有双链和单链序列的部分。核酸可以是DNA(基因组和cDNA)、RNA或杂交体，其中核酸可以含有脱氧核糖核苷酸和核糖核苷酸的组合，以及碱基的组合，包括尿嘧啶、腺嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶、鸟嘌呤、肌苷、黄嘌呤、次黄嘌呤、异胞嘧啶和异鸟嘌呤。核酸可以通过化学合成方法或通过重组方法获得。

本文所用的“可操作地连接”是指基因的表达受与其空间连接的启动子的控制。启动子可以定位于在其控制下的基因的5'(上游)或3'(下游)处。启动子和基因之间的距离可以与启动子和它在启动子来源的基因中控制的基因之间的距离大致相同。如本领域已知的，可以调节该距离的变化而不损失启动子功能。

本文所用的“肽”、“蛋白质”或“多肽”可以指连接的氨基酸序列，并且可以是天然的、合成的，或天然和合成的修饰或组合。

本文所用的“启动子”是指能够赋予、激活或增强核酸在细胞中表达的合成或天然来源的分子。启动子可以包含一个或多个特异性转录调节序列以进一步增强其表达和/或改变其空间表达和/或时间表达。启动子还可以包含远端增强子或阻抑物元件，其可以位于距转录起始位点多达几千个碱基对处。启动子可以来自包括病毒、细菌、真菌、植物、昆虫和动物的来源。启动子可以相对于发生表达的细胞、组织或器官，或相对于发生表达的发育阶段，或响应外部刺激如生理应激、病原体、金属离子或诱导剂，而组成型或差异地调节基因组分的表达。启动子的代表性实例包含噬菌体T7启动子、噬菌体T3启动子、SP6启动子、lac操纵子启动子、tac启动子、SV40晚期启动子、SV40早期启动子、RSV-LTR启动子和CMV IE启动子。

“信号肽”和“前导序列”在本文中可互换使用并且是指可以在本文阐述的SARS-CoV-2蛋白质的氨基末端处连接的氨基酸序列。信号肽/前导序列通常指导蛋白质的定位。本文使用的信号肽/前导序列优选地促使蛋白质从产生所述蛋白质的细胞中分泌。信号肽/前导序列通常在从细胞分泌时从蛋白质的其余部分(通常称为成熟蛋白质)裂解。信号肽/前导序列在蛋白质的N端处连接。

如本文所用，“受试者”可以意指想要或需要用本文所描述的免疫原性组合物或疫苗免疫的哺乳动物。哺乳动物可以是人、黑猩猩、豚鼠、狗、猫、马、牛、小鼠、兔或大鼠。

本文所用的“基本上相同”可意指第一氨基酸序列和第二氨基酸序列在1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1100个或更多个氨基酸的区域上至少60％、65％、70％、75％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％。基本上相同也可以意指第一核酸序列和第二序列在1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1100个或更多个核苷酸的区域上至少60％、65％、70％、75％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％。

如本文所用，“治疗(treatment)”或“治疗(treating)”可以意指通过预防、抑制、阻遏或完全消除疾病的方式来保护动物免于疾病。预防疾病涉及在疾病发作之前向动物施用本发明的免疫原性组合物或疫苗。抑制疾病涉及在诱导疾病之后但在疾病的临床表现之前向动物施用本发明的免疫原性组合物或疫苗。阻遏疾病涉及在疾病的临床表现之后向动物施用本发明的免疫原性组合物或疫苗。

如本文所用，除非另有说明，否则术语“临床证明的”(独立使用或修饰术语“安全的”和/或“有效的”)应意指已通过临床试验证明，其中临床试验已满足美国食品和药品管理局、EMA或相应的国家监管机构的批准标准。例如，证明可以由本文所提供的实例中描述的2期或3期临床试验提供。

术语“在临床上被证明是安全的”，因为它涉及使用SARS-CoV-2抗原(例如，作为pGX9501、或INO-4800、或其生物仿制药施用的SARS-CoV-2刺突抗原)的剂量、给药方案、治疗或方法，是指与护理标准或其他比较者相比具有可接受的频率和/或可接受的治疗出现的不良事件(被称为AE或TEAE)严重程度的有利风险:收益比。不良事件是施用药物产品的患者出现的不良医疗事件。一项安全性指数是根据不良事件常见毒性标准CTCAE v4.03进行分级的美国国家癌症研究所(NCI)的不良事件(AE)发生率。

本文在剂量、给药方案、治疗或方法的上下文中使用的术语“临床证明的功效”和“临床证明有效”是指特定剂量、给药或治疗方案的有效性。功效可以基于对本发明药剂的反应的病程变化来测量。例如，将SARS-CoV-2抗原(例如，作为pGX9501、或INO-4800、或其生物仿制药施用的SARS-CoV-2抗原)以足以诱导至少一种针对受SARS-CoV-2感染的保护性免疫应答的指标的量和时间向患者施用。可以评定反映保护性免疫应答的各种指标以确定治疗的量和时间是否足够。此类指标包括，例如，临床上公认的保护性免疫应答的指标，诸如但不限于：体液和细胞免疫应答，其靶向施用免疫原性组合物的受试者中的SARS-CoV-2刺突抗原；中和抗体和免疫球蛋白G(IgG)抗体，其与SARS-CoV-2刺突抗原具有反应性；和/或CD8+和/或CD4+T细胞应答，其对SARS-CoV-2刺突抗原有反应并产生干扰素-γ(IFN-γ)、TNF-α和/或IL-2。

本文所用的“载体”是指含有复制起点的核酸序列。载体可以是病毒载体、噬菌体、细菌人工染色体或酵母人工染色体。载体可以是DNA或RNA载体。载体可以是自我复制的染色体外载体，并且优选地为DNA质粒。

对于本文中数值范围的列举，明确地设想了在其之间具有相同的精确程度的每个中间数字。例如，对于6-9的范围，除了6和9之外，设想了数字7和8；并且对于范围6.0-7.0，明确考虑了数字6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9和7.0。

核酸分子、抗原和免疫原性组合物

本文提供免疫原性组合物，诸如疫苗，其包括编码SARS-CoV-2抗原、其片段、其变体或其组合的核酸分子。本文还提供了免疫原性组合物，如疫苗，其包括SARS-CoV-2抗原、其片段、其变体或其组合。根据一些实施例，核酸分子包含SEQ ID NO:2的核苷酸55至3837的核酸序列、SEQ ID NO:2的核酸序列或SEQ ID NO:3的核酸序列；或pGX9501。所述免疫原性组合物可以用于防范和治疗任何数量的SARS-CoV-2毒株，由此治疗、预防和/或防范基于SARS-CoV-2的病理。所述免疫原性组合物可以显著诱导施用所述免疫原性组合物的受试者的免疫应答，由此防范和治疗SARS-CoV-2感染。

免疫原性组合物可以是DNA疫苗、肽疫苗或组合DNA和肽疫苗。所述DNA疫苗可以包含编码SARS-CoV-2抗原的核酸分子。核酸分子可以是DNA、RNA、cDNA、其变体、其片段或其组合。所述核酸分子还可以包含编码连接子、前导或标签序列的另外的序列，所述连接子、前导或标签序列通过肽键与所述编码所述SARS-CoV-2抗原的核酸分子连接。根据一些实施例，核酸分子包含SEQ ID NO:2的核苷酸55至3837的核酸序列、SEQ ID NO:2的核酸序列或SEQ ID NO:3的核酸序列；或pGX9501。所述肽疫苗可以包含SARS-CoV-2抗原肽、SARS-CoV-2抗原蛋白、其变体、其片段或其组合。组合DNA和肽疫苗可以包含上文所描述的编码SARS-CoV-2抗原的核酸分子以及SARS-CoV-2抗原肽或蛋白，其中所述SARS-CoV-2抗原肽或蛋白和经编码的SARS-CoV-2抗原具有相同的氨基酸序列。

所公开的免疫原性组合物可以在施用该免疫原性组合物的受试者中引发靶向SARS-CoV-2抗原的体液免疫应答和细胞免疫应答两者。所公开的免疫原性组合物可以引发与SARS-CoV-2刺突抗原具有反应性的中和抗体和免疫球蛋白G(IgG)抗体。免疫原性组合物还可以引发对SARS-CoV-2抗原有反应的CD8+和CD4+T细胞应答，并且产生干扰素-γ(IFN-γ)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)和白介素-2(IL-2)。

免疫原性组合物可以诱导施用该免疫原性组合物的受试者的体液免疫应答。经诱导的体液免疫应答可以对SARS-CoV-2抗原具有特异性。经诱导的体液免疫应答可以与SARS-CoV-2抗原具有反应性。可以在施用疫苗的受试者中诱导约1.5倍至约16倍、约2倍至约12倍，或约3倍至约10倍的体液免疫应答。可以在施用疫苗的受试者中诱导至少约1.5倍、至少约2.0倍、至少约2.5倍、至少约3.0倍、至少约3.5倍、至少约4.0倍、至少约4.5倍、至少约5.0倍、至少约5.5倍、至少约6.0倍、至少约6.5倍、至少约7.0倍、至少约7.5倍、至少约8.0倍、至少约8.5倍、至少约9.0倍、至少约9.5倍、至少约10.0倍、至少约10.5倍、至少约11.0倍、至少约11.5倍、至少约12.0倍、至少约12.5倍、至少约13.0倍、至少约13.5倍、至少约14.0倍、至少约14.5倍、至少约15.0倍、至少约15.5倍或至少约16.0倍的体液免疫应答。

与未施用免疫原性组合物的受试者相比，由该免疫原性组合物诱导的体液免疫应答可以包括与施用该免疫原性组合物的受试者相关联的中和抗体水平增加。所述中和抗体可以对SARS-CoV-2抗原具有特异性。所述中和抗体可以与SARS-CoV-2抗原具有反应性。所述中和抗体可以在施用免疫原性组合物的受试者中提供针对SARS-CoV-2感染和其相关病理的保护和/或治疗。

与基线相比，由该免疫原性组合物诱导的体液免疫应答可以包括与施用该免疫原性组合物的受试者相关联的中和抗体水平增加。在施用疫苗的受试者中，中和抗体的水平可以增加约1.5倍至约16倍、约2倍至约12倍或约3倍至约10倍。可以在施用疫苗的受试者中诱导至少约1.5倍、至少约2.0倍、至少约2.5倍、至少约3.0倍、至少约3.5倍、至少约4.0倍、至少约4.5倍、至少约5.0倍、至少约5.5倍、至少约6.0倍、至少约6.5倍、至少约7.0倍、至少约7.5倍、至少约8.0倍、至少约8.5倍、至少约9.0倍、至少约9.5倍、至少约10.0倍、至少约10.5倍、至少约11.0倍、至少约11.5倍、至少约12.0倍、至少约12.5倍、至少约13.0倍、至少约13.5倍、至少约14.0倍、至少约14.5倍、至少约15.0倍、至少约15.5倍或至少约16.0倍的体液免疫应答。如通过病毒中和测定测量的体液免疫应答可以在初始施用免疫原性组合物之后约6周确定。

与未施用免疫原性组合物的受试者相比，由该免疫原性组合物诱导的体液免疫应答可以包括与施用该免疫原性组合物的受试者相关联的IgG抗体水平增加。这些IgG抗体可以对SARS-CoV-2抗原具有特异性。这些IgG抗体可以与SARS-CoV-2抗原具有反应性。与未施用免疫原性组合物的受试者相比，与施用该免疫原性组合物的受试者相关联的IgG抗体水平可以增加约1.5倍至约16倍、约2倍至约12倍或约3倍至约10倍。与未施用免疫原性组合物的受试者相比，与施用该免疫原性组合物的受试者相关联的IgG抗体水平可以增加至少约1.5倍、至少约2.0倍、至少约2.5倍、至少约3.0倍、至少约3.5倍、至少约4.0倍、至少约4.5倍、至少约5.0倍、至少约5.5倍、至少约6.0倍、至少约6.5倍、至少约7.0倍、至少约7.5倍、至少约8.0倍、至少约8.5倍、至少约9.0倍、至少约9.5倍、至少约10.0倍、至少约10.5倍、至少约11.0倍、至少约11.5倍、至少约12.0倍、至少约12.5倍、至少约13.0倍、至少约13.5倍、至少约14.0倍、至少约14.5倍、至少约15.0倍、至少约15.5倍或至少约16.0倍。

免疫原性组合物可以在施用该免疫原性组合物的受试者中诱导细胞免疫应答。经诱导的细胞免疫应答可以对SARS-CoV-2抗原具有特异性。经诱导的细胞免疫应答可以与SARS-CoV-2抗原具有反应性。

诱导的细胞免疫应答可包括，如通过干扰素-γ(IFN-γ)酶联免疫斑点(ELISpot)测定测量的，抗原特异性细胞免疫应答相对于基线的增加。如通过干扰素-γ(IFN-γ)酶联免疫斑点(ELISpot)测定测量的，与施用免疫原性组合物的受试者相关联的细胞免疫应答可以相对于基线增加至少约1.5倍、至少约2.0倍、至少约3.0倍、至少约4.0倍、至少约5.0倍、至少约6.0倍、至少约6.5倍、至少约7.0倍、至少约7.5倍、至少约8.0倍、至少约8.5倍、至少约9.0倍、至少约9.5倍、至少约10.0倍、至少约10.5倍、至少约11.0倍、至少约11.5倍、至少约12.0倍、至少约12.5倍、至少约13.0倍、至少约13.5倍、至少约14.0倍、至少约14.5倍、至少约15.0倍、至少约16.0倍、至少约17.0倍、至少约18.0倍、至少约19.0倍、至少约20.0倍、至少约21.0倍、至少约22.0倍、至少约23.0倍、至少约24.0倍、至少约25.0倍、至少约26.0倍、至少约27.0倍、至少约28.0倍、至少约29.0倍或至少约30.0倍。如通过干扰素-γ(IFN-γ)酶联免疫斑点(ELISpot)测定测量的细胞免疫应答可以在初始施用免疫原性组合物之后约6周确定。

经诱导的细胞免疫应答可以包含引发CD8+T细胞应答。经引发的CD8+T细胞应答可以与SARS-CoV-2抗原具有反应性。经引发的CD8+T细胞应答可以是多功能的。经诱导的细胞免疫应答可以包含引发CD8+T细胞应答，其中CD8+T细胞产生干扰素-γ(IFN-γ)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)、白介素-2(IL-2)或IFN-γ和TNF-α的组合。

与未施用免疫原性组合物的受试者相比，诱导的细胞免疫应答可以包括增加的与施用该免疫原性组合物的受试者相关联的CD8+T细胞应答。与未施用所述免疫原性组合物的受试者相比，与施用所述免疫原性组合物的受试者相关的CD8+T细胞应答可以增加约2倍至约30倍、约3倍至约25倍或约4倍至约20倍。与未施用免疫原性组合物的受试者相比，与施用该免疫原性组合物的受试者相关联的CD8+T细胞应答可以增加至少约1.5倍、至少约2.0倍、至少约3.0倍、至少约4.0倍、至少约5.0倍、至少约6.0倍、至少约6.5倍、至少约7.0倍、至少约7.5倍、至少约8.0倍、至少约8.5倍、至少约9.0倍、至少约9.5倍、至少约10.0倍、至少约10.5倍、至少约11.0倍、至少约11.5倍、至少约12.0倍、至少约12.5倍、至少约13.0倍、至少约13.5倍、至少约14.0倍、至少约14.5倍、至少约15.0倍、至少约16.0倍、至少约17.0倍、至少约18.0倍、至少约19.0倍、至少约20.0倍、至少约21.0倍、至少约22.0倍、至少约23.0倍、至少约24.0倍、至少约25.0倍、至少约26.0倍、至少约27.0倍、至少约28.0倍、至少约29.0倍或至少约30.0倍。

经诱导的细胞免疫应答可以包含产生IFN-γ的CD3+CD8+T细胞的频率增加。与未施用免疫原性组合物的受试者相比，与施用该免疫原性组合物的受试者相关联的CD3+CD8+IFN-γ+T细胞的频率可以增加至少约2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、11倍、12倍、13倍、14倍、15倍、16倍、17倍、18倍、19倍或20倍。

经诱导的细胞免疫应答可以包含产生TNF-α的CD3+CD8+T细胞的频率增加。与未施用免疫原性组合物的受试者相比，与施用该免疫原性组合物的受试者相关联的CD3+CD8+TNF-α+T细胞的频率可以增加至少约2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、11倍、12倍、13倍或14倍。

经诱导的细胞免疫应答可以包含产生IL-2的CD3+CD8+T细胞的频率增加。与未施用所述免疫原性组合物的受试者相比，与施用所述免疫原性组合物的受试者相关的CD3+CD8+IL-2+T细胞的频率可以增加至少约0.5倍、1.0倍、1.5倍、2.0倍、2.5倍、3.0倍、3.5倍、4.0倍、4.5倍或5.0倍。

经诱导的细胞免疫应答可以包含产生IFN-γ和TNF-α两者的CD3+CD8+T细胞的频率增加。与未施用免疫原性组合物的受试者相比，与施用该免疫原性组合物的受试者相关联的CD3+CD8+IFN-γ+TNF-α+T细胞的频率可以增加至少约25倍、30倍、35倍、40倍、45倍、50倍、55倍、60倍、65倍、70倍、75倍、80倍、85倍、90倍、95倍、100倍、110倍、120倍、130倍、140倍、150倍、160倍、170倍或180倍。

由免疫原性组合物诱导的细胞免疫应答可以包含引发CD4+T细胞应答。经引发的CD4+T细胞应答可以与SARS-CoV-2抗原具有反应性。经引发的CD4+T细胞应答可以是多功能的。经诱导的细胞免疫应答可以包含引发CD4+T细胞应答，其中CD4+T细胞产生IFN-γ、TNF-α、IL-2或IFN-γ和TNF-α的组合。

经诱导的细胞免疫应答可以包含产生IFN-γ的CD3+CD4+T细胞的频率增加。与未施用免疫原性组合物的受试者相比，与施用该免疫原性组合物的受试者相关联的CD3+CD4+IFN-γ+T细胞的频率可以增加至少约2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、11倍、12倍、13倍、14倍、15倍、16倍、17倍、18倍、19倍或20倍。

经诱导的细胞免疫应答可以包含产生TNF-α的CD3+CD4+T细胞的频率增加。与未施用免疫原性组合物的受试者相比，与施用该免疫原性组合物的受试者相关联的CD3+CD4+TNF-α+T细胞的频率可以增加至少约2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、11倍、12倍、13倍、14倍、15倍、16倍、17倍、18倍、19倍、20倍、21倍或22倍。

经诱导的细胞免疫应答可以包含产生IL-2的CD3+CD4+T细胞的频率增加。与未施用免疫原性组合物的受试者相比，与施用该免疫原性组合物的受试者相关联的CD3+CD4+IL-2+T细胞的频率可以增加至少约2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、11倍、12倍、13倍、14倍、15倍、16倍、17倍、18倍、19倍、20倍、21倍、22倍、23倍、24倍、25倍、26倍、27倍、28倍、29倍、30倍、31倍、32倍、33倍、34倍、35倍、36倍、37倍、38倍、39倍、40倍、45倍、50倍、55倍或60倍。

经诱导的细胞免疫应答可以包含产生IFN-γ和TNF-α两者的CD3+CD4+T细胞的频率增加。与未施用免疫原性组合物的受试者相比，与施用该免疫原性组合物的受试者相关联的CD3+CD4+IFN-γ+TNF-α+的频率可以增加至少约2倍、2.5倍、3.0倍、3.5倍、4.0倍、4.5倍、5.0倍、5.5倍、6.0倍、6.5倍、7.0倍、7.5倍、8.0倍、8.5倍、9.0倍、9.5倍、10.0倍、10.5倍、11.0倍、11.5倍、12.0倍、12.5倍、13.0倍、13.5倍、14.0倍、14.5倍、15.0倍、15.5倍、16.0倍、16.5倍、17.0倍、17.5倍、18.0倍、18.5倍、19.0倍、19.5倍、20.0倍、21倍、22倍、23倍、24倍、25倍、26倍、27倍、28倍、29倍、30倍、31倍、32倍、33倍、34倍或35倍。

本发明的免疫原性组合物可以具有有效的免疫原性组合物所需的特征，诸如安全性，因此该免疫原性组合物本身不会引起疾病或死亡；对因暴露于活病原体诸如病毒或细菌而引起的疾病具有保护作用；诱导中和抗体以阻止细胞的产生；诱导针对细胞内病原体的保护性T细胞；并且提供易于施用、副作用少、生物稳定性和每剂成本低。

当施用至不同组织诸如肌肉或皮肤时，免疫原性组合物可以进一步诱导免疫应答。当通过电穿孔、或注射、或皮下、或肌内施用时，免疫原性组合物可以进一步诱导免疫应答。

a.SARS-CoV-2抗原和编码其的核酸分子

如上文所描述，本文提供免疫原性组合物，其包括编码SARS-CoV-2抗原的核酸分子、其片段、其变体或其组合。本文还提供了免疫原性组合物，其包括SARS-CoV-2抗原、其片段、其变体或其组合。

在结合细胞表面蛋白以及膜融合后，冠状病毒进入细胞，并且其单链RNA基因组被释放到受感染细胞的细胞质中。单链RNA基因组是正链，并且因此可以翻译成RNA聚合酶，所述聚合酶产生作为负链的另外的病毒RNA。因此，SARS-CoV-2抗原也可以是SARS-CoV-2RNA聚合酶。

病毒负RNA链被转录成用于翻译其他病毒蛋白，例如核衣壳(N)蛋白、包膜(E)蛋白和基质(M)蛋白的较小的亚基因组正RNA链。因此，SARS-CoV-2抗原可以包括SARS-CoV-2核衣壳蛋白、SARS-CoV-2包膜蛋白、SARS-CoV-2基质蛋白、或S1亚基的包含SARS-CoV-2刺突受体结合结构域(RBD)的片段。

病毒负RNA链也可以用于复制由核衣壳蛋白结合的病毒基因组。基质蛋白连同刺突蛋白一起被整合到受感染细胞的内质网中。与病毒基因组结合的核衣壳蛋白和膜包埋基质和刺突蛋白一起出芽到内质网的管腔中，由此将病毒基因组包裹在膜中。然后病毒后代通过高尔基体囊泡(golgi vesicle)转运到受感染细胞的细胞膜，并且通过内吞作用释放到胞外空间。

冠状病毒，包括SARS-CoV-2，被膜包封并且具有被称为刺突(S)蛋白的1型膜糖蛋白，该S蛋白在冠状病毒的表面上形成突出的刺突。SARS-CoV-2S蛋白是作为冠状病毒的表面上的主要包膜蛋白的I类膜融合蛋白。刺突蛋白促进冠状病毒与定位于细胞的表面上的蛋白质(例如，金属蛋白酶氨基肽酶N)结合，并且介导细胞-病毒膜融合。具体地，刺突蛋白含有促进冠状病毒与细胞表面蛋白的结合的S1亚基。因此，刺突蛋白的S1亚基控制哪些细胞被冠状病毒感染。刺突蛋白还含有作为促进病毒和细胞膜融合的跨膜亚基的S2亚基。因此，SARS-CoV-2抗原可包括SARS-CoV-2刺突蛋白、SARS-CoV-2刺突蛋白的S1亚基或SARS-CoV-2刺突蛋白的S2亚基。

在一些实施例中，SARS-CoV-2抗原可以是SARS-CoV-2刺突蛋白、SARS-CoV-2RNA聚合酶、SARS-CoV-2核衣壳蛋白、SARS-CoV-2包膜蛋白、SARS-CoV-2基质蛋白、其片段、其变体或其组合。

SARS-CoV-2抗原可以是SARS-CoV-2刺突抗原、其片段、其变体或其组合。SARS-CoV-2刺突抗原能够引发哺乳动物的针对一种或多种SARS-CoV-2毒株的免疫应答。SARS-CoV-2刺突抗原可以包括使其作为免疫原特别有效的表位，针对所述免疫原可以诱导抗SARS-CoV-2免疫应答。

SARS-CoV-2抗原可以是源自两种或更多种SARS-CoV-2毒株的共有抗原。在一些实施例中，SARS-CoV-2抗原是SARS-CoV-2共有刺突抗原。SARS-CoV-2共有刺突抗原可以源自SARS-CoV-2毒株的刺突抗原的序列，并且因此SARS-CoV-2共有刺突抗原是独有的。在一些实施例中，SARS-CoV-2共有刺突抗原可以是异常刺突抗原，与其它SARS-CoV-2刺突蛋白具有更大的氨基酸序列差异。因此，由于SARS-CoV-2共有刺突抗原的独特序列，本发明的免疫原性组合物广泛适用于多种SARS-CoV-2毒株。这些独有的序列允许疫苗普遍防范多种SARS-CoV-2毒株，包含SARS-CoV-2的基因多样性变体。可以修饰编码SARS-CoV-2抗原的核酸分子以改善表达。修饰可以包含密码子优化、RNA优化、添加kozak序列以增加翻译起始和/或添加免疫球蛋白前导序列以增加SARS-CoV-2抗原的免疫原性。SARS-CoV-2刺突抗原可以包括信号肽，如免疫球蛋白信号肽，例如但不限于免疫球蛋白E(IgE)或免疫球蛋白(IgG)信号肽。在一些实施例中，SARS-CoV-2刺突抗原可以包括血凝素(HA)标签。与对应的经密码子优化的刺突抗原相比，SARS-CoV-2刺突抗原可以被设计成引发更强和更广泛的细胞和/或体液免疫应答。

在一些实施例中，SARS-CoV-2抗原包含在SEQ ID NO:1的残基19至1279的全长上具有至少约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，SARS-CoV-2抗原包括SEQ ID NO:1的残基19至1279中所示的氨基酸序列。在一些实施例中，SARS-CoV-2抗原包含在SEQ ID NO:1的整个长度上具有至少约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，SARS-CoV-2抗原包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列。在一些实施例中，编码SARS-CoV-2抗原的核酸分子包含与SEQ ID NO:2的核苷酸55至3837所示的序列、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3具有至少约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的核苷酸序列。

在一些实施例中，SARS-CoV-2抗原包含在SEQ ID NO:4的残基19至1279的全长上或在SEQ ID NO:4的全长上具有至少约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，SARS-CoV-2抗原包括SEQ ID NO:4的残基19至1279中所示的氨基酸序列。在一些实施例中，SARS-CoV-2抗原包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列。在一些实施例中，编码SARS-CoV-2抗原的核酸分子包含：在SEQ ID NO:5的核苷酸55至3837的全长上或在SEQ ID NO:5的全长上具有至少约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的核酸序列；SEQ ID NO:5的核苷酸55至3837的核酸序列；SEQ ID NO:5的核酸序列；在SEQ ID NO:6的全长上具有至少约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的核酸序列；或SEQ IDNO:6的核酸序列。

在一些实施例中，SARS-CoV-2抗原与IgE前导序列可操作地连接。在一些此类实施例中，SARS-CoV-2抗原包含SEQ ID NO:1中所示的氨基酸序列。在一些实施例中，SARS-CoV-2抗原由SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3中所示的核苷酸序列编码。在其中SARS-CoV-2抗原包括IgE前导的一些实施例中，该SARS-CoV-2抗原包含SEQ ID NO:4中所示的氨基酸序列。在一些此类实施例中，SARS-CoV-2抗原由SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:6中所示的核苷酸序列编码。

可以提供SEQ ID NO:1的免疫原性片段。免疫原性片段可以包括SEQ ID NO:1的至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％。在一些实施例中，免疫原性片段包含前导序列，如例如免疫球蛋白前导，如IgE前导。在一些实施例中，免疫原性片段不含前导序列。

可以提供具有与SEQ ID NO:1的免疫原性片段同源的氨基酸序列的蛋白质的免疫原性片段。此类免疫原性片段可以包括与SEQ ID NO:1 95％同源的蛋白质的至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％。一些实施例涉及与本文中的共有蛋白序列的免疫原性片段具有96％同源性的免疫原性片段。一些实施例涉及与本文中的共有蛋白序列的免疫原性片段具有97％同源性的免疫原性片段。一些实施例涉及与本文中的共有蛋白序列的免疫原性片段具有98％同源性的免疫原性片段。一些实施例涉及与本文中的共有蛋白序列的免疫原性片段具有99％同源性的免疫原性片段。在一些实施例中，免疫原性片段包含前导序列，如例如免疫球蛋白前导，如IgE前导。在一些实施例中，免疫原性片段不含前导序列。

一些实施例涉及SEQ ID NO:1的免疫原性片段。免疫原性片段可以是SEQ ID NO:1的至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％。免疫原性片段可以与SEQ ID NO:1的片段至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同源。在一些实施例中，免疫原性片段包含编码前导序列的序列，如例如免疫球蛋白前导，如IgE前导。在一些实施例中，片段不含编码前导序列的编码序列。

可以提供SEQ ID NO:4的免疫原性片段。免疫原性片段可以包括SEQ ID NO:4的至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％。在一些实施例中，免疫原性片段包含前导序列，如例如免疫球蛋白前导，如IgE前导。在一些实施例中，免疫原性片段不含前导序列。

可以提供具有与SEQ ID NO:4的免疫原性片段同源的氨基酸序列的蛋白质的免疫原性片段。此类免疫原性片段可以包括与SEQ ID NO:4 95％同源的蛋白质的至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％。一些实施例涉及与本文中的共有蛋白序列的免疫原性片段具有96％同源性的免疫原性片段。一些实施例涉及与本文中的共有蛋白序列的免疫原性片段具有97％同源性的免疫原性片段。一些实施例涉及与本文中的共有蛋白序列的免疫原性片段具有98％同源性的免疫原性片段。一些实施例涉及与本文中的共有蛋白序列的免疫原性片段具有99％同源性的免疫原性片段。在一些实施例中，免疫原性片段包含前导序列，如例如免疫球蛋白前导，如IgE前导。在一些实施例中，免疫原性片段不含前导序列。

一些实施例涉及SEQ ID NO:4的免疫原性片段。免疫原性片段可以是SEQ ID NO:4的至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％。免疫原性片段可以与SEQ ID NO:4的片段至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同源。在一些实施例中，免疫原性片段包含编码前导序列的序列，如例如免疫球蛋白前导，如IgE前导。在一些实施例中，片段不含编码前导序列的编码序列。

b.载体

免疫原性组合物可包括一种或多种载体，该一种或多种载体包括编码SARS-CoV-2抗原的核酸分子。该一种或多种载体能够表达抗原。载体可以具有含有复制起点的核酸序列。载体可以是质粒、噬菌体、细菌人工染色体或酵母人工染色体。载体可以是自我复制的染色体外载体或掺入到宿主基因组中的载体。

该一种或多种载体可以是表达构建体，其通常是用于将特异性基因引入到靶细胞中的质粒。一旦表达载体进入细胞内，由该基因编码的蛋白质就会由细胞转录和翻译机器核糖体复合物产生。质粒经常被工程化以含有调节序列，该调节序列充当增强子和启动子区，并且导致表达载体上携带的基因的有效转录。本发明的载体表达大量稳定的信使RNA并且因此表达蛋白质。

载体可以具有表达信号，诸如强启动子、强终止密码子、启动子与克隆基因之间距离的调整以及转录终止序列和PTIS(便携式翻译起始序列)的插入。

(1)表达载体

载体可以是环形质粒或线性核酸。环形质粒和线性核酸能够指导特定核苷酸序列在适当的受试者细胞中表达。载体可以具有与抗原编码性核苷酸序列可操作地连接的启动子，该核苷酸序列可以与终止信号可操作地连接。载体还可以含有正确翻译核苷酸序列所需的序列。包括所关注的核苷酸序列的载体可以是嵌合的，这意味着载体组分中的至少一种组分相对于载体其它组分中的至少一种组分是异源的。核苷酸序列在表达盒中的表达可以在组成型启动子或诱导型启动子的控制下，其仅在宿主细胞暴露于一些特定的外部刺激时启动转录。在多细胞生物的情况下，启动子也可以特异于特定的组织或器官或发育阶段。

(2)环形和线性载体

载体可以是环形质粒，其可以通过并入到细胞基因组中来转化靶细胞或在染色体外存在(例如，具有复制起点的自主复制质粒)。

载体可以是pVAX、pcDNA3.0、pGX-0001或provax、或能够表达对抗原进行编码的DNA并使细胞能够将序列翻译成免疫系统识别的抗原的任何其他表达载体。

本文还提供了线性核酸免疫原性组合物或线性表达盒(“LEC”)，其能够通过电穿孔有效地递送至受试者并表达一种或多种期望的抗原。LEC可以是没有任何磷酸骨架的任何线性DNA。DNA可以编码一种或多种抗原。LEC可以含有启动子、内含子、终止密码子和/或聚腺苷酸化信号。抗原的表达可以由启动子控制。LEC可能不含任何抗生素抗性基因和/或磷酸骨架。LEC可以不含有与期望抗原基因表达无关的其它核酸序列。

LEC可以衍生自能够被线性化的任何质粒。质粒能够表达抗原。质粒可以是pNP(Puerto Rico/34)或pM2(New Caledonia/99)。质粒可以是WLV009、pVAX、pcDNA3.0或provax，或能够表达编码抗原的DNA并使细胞能够将该序列翻译为被免疫系统识别的抗原的任何其它表达载体。

LEC可以是perM2。LEC可以是perNP。perNP和perMR可以分别源自pNP(波多黎各/34)和pM2(新喀里多尼亚/99)。

(3)启动子、内含子、终止密码子和聚腺苷酸化信号

载体可以具有启动子。启动子可以是能够驱动基因表达和调节分离的核酸表达的任何启动子。这种启动子是通过DNA依赖性RNA聚合酶转录所需的顺式作用序列元件，其转录本文所述的抗原序列。用于指导异源核酸表达的启动子的选择取决于具体的应用。启动子可以位于距载体中的转录起始点与距其天然设置中的转录起始点大致相同的距离处。然而，可以调节该距离的变化而不损失启动子功能。

启动子可以与编码抗原和转录物的有效聚腺苷酸化、核糖体结合位点和翻译终止所需的信号的核酸序列可操作地连接。启动子可以是CMV启动子、SV40早期启动子、SV40晚期启动子、金属硫蛋白启动子、鼠乳腺肿瘤病毒启动子、劳斯肉瘤病毒启动子(Roussarcoma virus promoter)、多角体蛋白启动子或显示在真核细胞中表达有效的另一种启动子。

载体可以包括增强子和具有功能性剪接供体和受体位点的内含子。载体可以含有结构基因下游的转录终止区以提供有效的终止。终止区可以从与启动子序列相同的基因获得，或者可以从不同的基因获得。

c.免疫原性组合物的赋形剂和其他组分

疫原性组合物可以进一步包括药学上可接受的赋形剂。药学上可接受的赋形剂可以是功能分子，如媒剂、载体、缓冲剂或稀释剂。如本文所用。“缓冲液”是指通过其酸-碱缀合物组分的作用抵抗pH变化的缓冲溶液。缓冲液通常具有约4.0至约8.0，例如约5.0至约7.0的pH。在一些实施例中，缓冲液是盐水-柠檬酸钠(SSC)缓冲液。在其中所述免疫原性组合物包括编码如上文所描述的SARS-CoV-2刺突抗原的核酸分子的一些实施例中，所述免疫原性组合物包括缓冲剂例如但不限于SSC缓冲剂中的10mg/ml的载体。在一些实施例中，所述免疫原性组合物包括缓冲剂中的10mg/mL的DNA质粒pGX9501或pGX9503。在一些实施例中，免疫原性组合物在约2℃至约8℃储存。在一些实施例中，免疫原性组合物在室温储存。所述免疫原性组合物可以在室温下储存至少一年。在一些实施例中，所述免疫原性组合物在室温下稳定至少一年，其中稳定性定义为至少约80％的超螺旋质粒百分比。在一些实施例中，在室温下储存至少一年后，超螺旋质粒的百分比为至少约85％。

药学上可接受的赋形剂可以是转染促进剂，其可以包括表面活性剂，如免疫刺激复合物(ISCOMS)、弗氏不完全佐剂、LPS类似物(包括单磷酰脂质A)、胞壁酰肽、醌类似物、囊泡(如角鲨烯和角鲨烯)、透明质酸、脂质、脂质体、钙离子、病毒蛋白、聚阴离子、聚阳离子或纳米颗粒，或其它已知的转染促进剂。

转染促进剂可以是聚阴离子、聚阳离子，包括聚-L-谷氨酸(LGS)或脂质。转染促进剂是聚-L-谷氨酸，并且聚-L-谷氨酸可以以小于6mg/ml的浓度存在于免疫原性组合物中。转染促进剂还可以包含表面活性剂，如免疫刺激复合物(ISCOMS)、弗氏不完全佐剂、包含单磷酰脂质A的LPS类似物、胞壁酰肽、醌类似物和如鲨烯和鲨烯等囊泡，并且透明质酸还可以与基因构建体结合施用。DNA质粒免疫原性组合物还可以包含转染促进剂，如脂质、脂质体，包含卵磷脂脂质体或本领域已知的其它脂质体，作为DNA-脂质体混合物(参见例如WO9324640)、钙离子、病毒蛋白、聚阴离子、聚阳离子或纳米颗粒或其它已知的转染促进剂。转染促进剂是聚阴离子、聚阳离子，包含聚-L-谷氨酸(LGS)或脂质。免疫原性组合物中转染剂的浓度为小于4mg/ml、小于2mg/ml、小于1mg/ml、小于0.750mg/ml、小于0.500mg/ml、小于0.250mg/ml、小于0.100mg/ml、小于0.050mg/ml或小于0.010mg/ml。

药学上可接受的赋形剂可以是佐剂。佐剂可以是在替代质粒中表达或作为蛋白质与免疫原性组合物中的上述质粒组合递送的其它基因。佐剂可以选自由以下组成的组：α-干扰素(IFN-α)、β-干扰素(IFN-β)、γ-干扰素、血小板源性生长因子(PDGF)、TNFα、TNFβ、GM-CSF、表皮生长因子(EGF)、皮肤T细胞吸引趋化因子(CTACK)、上皮胸腺表达趋化因子(TECK)、粘膜相关上皮趋化因子(MEC)、IL-12、IL-15、MHC、CD80、CD86，包含具有缺失的信号序列的IL-15并且任选地包含来自IgE的信号肽。佐剂可以是IL-12、IL-15、IL-28、CTACK、TECK、血小板衍生生长因子(PDGF)、TNFα、TNFβ、GM-CSF、表皮生长因子(EGF)、IL-1、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-10、IL-12、IL-18或其组合。

其他可用作佐剂的基因包括编码以下项的那些：MCP-1、MIP-1a、MIP-1p、IL-8、RANTES、L-选择素、P-选择素、E-选择素、CD34、GlyCAM-1、MadCAM-1、LFA-1、VLA-1、Mac-1、p150.95、PECAM、ICAM-1、ICAM-2、ICAM-3、CD2、LFA-3、M-CSF、G-CSF、IL-4、IL-18的突变形式、CD40、CD40L、血管生长因子、成纤维细胞生长因子、IL-7、IL-22、神经生长因子、血管内皮生长因子、Fas、TNF受体、Flt、Apo-1、p55、WSL-1、DR3、TRAMP、Apo-3、AIR、LARD、NGRF、DR4、DR5、KILLER、TRAIL-R2、TRICK2、DR6、半胱天冬酶ICE、Fos、c-jun、Sp-1、Ap-1、Ap-2、p38、p65Rel、MyD88、IRAK、TRAF6、IkB、非活性NIK、SAP K、SAP-1、JNK、干扰素应答基因、NFkB、Bax、TRAIL、TRAILrec、TRAILrecDRC5、TRAIL-R3、TRAIL-R4、RANK、RANK LIGAND、Ox40、Ox40LIGAND、NKG2D、MICA、MICB、NKG2A、NKG2B、NKG2C、NKG2E、NKG2F、TAP1、TAP2及其功能片段。

免疫原性组合物可以进一步包括如在1994年4月1日提交的美国序列号021,579中描述的基因疫苗促进剂，该文献通过引用完全并入。

免疫原性组合物可以根据所使用的施用方式进行调配。根据一些实施例，所述免疫原性组合物被调配在缓冲剂中，任选地是盐水-柠檬酸钠缓冲剂。例如，免疫原性组合物可以以每毫升柠檬酸钠盐缓冲剂10mg核酸分子的浓度调配。可注射免疫原性药物组合物可以是无菌、无热原和无颗粒的。可以使用等渗调配物或溶液。用于等渗性的添加剂可以包括氯化钠、葡萄糖、甘露醇、山梨醇和乳糖。免疫原性组合物可以包括血管收缩剂。等渗溶液可以包含磷酸盐缓冲盐水。免疫原性组合物可以进一步包括包含明胶和白蛋白的稳定剂。稳定剂可以使包含LGS或聚阳离子或聚阴离子的调配物在室温或环境温度下在延长的时间段稳定。

本文还提供包括免疫原性组合物的制品。在一些实施例中，所述制品是装有免疫原性组合物的容器。容器可以是例如但不限于注射器或小瓶。小瓶可以具有可被注射器刺穿的塞子。

免疫原性组合物可以以多剂量或单位剂量形式包装在适当灭菌的容器中，诸如安瓿、瓶子或小瓶中。容器优选地在填充有疫苗制剂之后气密密封。优选地，疫苗被包装在其上贴有标记的容器中，所述标记标识疫苗，并且带有呈由政府机构如美国食品药品监督管理局规定的形式的反映根据适当的法律批准疫苗、剂量信息等的通知。标记优选地含有关于疫苗的信息，所述信息对于将疫苗施用于患者的医疗保健专业人员有用。包装还优选地含有与疫苗的施用、说明书、适应症和任何必要的必需警告有关的印刷信息材料。

疫苗接种方法

本文还提供通过将向有此需要的受试者施用免疫原性组合物来在该受试者中治疗、保护以免受、和/或预防疾病的方法。向受试者施用免疫原性组合物可以诱导或引发受试者的免疫应答。经诱导的免疫应答可以用于治疗、预防和/或防范疾病，例如与SARS-CoV-2感染有关的病理。在施用免疫原性组合物的受试者中诱导的免疫应答可以提供对一种或多种SARS-CoV-2毒株的抗性。

诱导的免疫应答可以包括诱导的体液免疫应答和/或诱导的细胞免疫应答。可以诱导约1.5倍至约16倍、约2倍至约12倍或约3倍至约10倍的体液免疫应答。经诱导的体液免疫应答可以包含对抗原具有反应性的IgG抗体和/或中和抗体。诱导的细胞免疫应答可包括CD8+T细胞应答，其被诱导约2倍至约30倍、约3倍至约25倍或约4倍至约20倍。

疫苗剂量可以介于1μg与10mg活性组分/kg体重/次之间，并且可以是20μg至10mg组分/kg体重/次。疫苗可以每21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40或更多天或者每3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或更多周施用一次。用于有效治疗的疫苗剂量数可以为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多。

在一个实施例中，总疫苗剂量为1.0mg核酸。在一个实施例中，总疫苗剂量为2.0mg核酸，以2×1.0mg核酸的方式施用。

a.施用

免疫原性组合物可以根据制药领域技术人员熟知的标准技术进行调配。考虑到如特定患者的年龄、性别、体重和病状以及施用途径等此类因素，可以以医学领域技术人员熟知的剂量和技术施用此类组合物。可以例如以一次、二次、三次、四次或更多次注射施用疫苗。在一些实施例中，向受试者施用约0.5mg至约2.0mg核酸分子的初始剂量。初始剂量可以一次、两次、三次或更多次注射施用。在紧接前一个剂量之后约一周、二周、三周、四周、五周、六周、七周、八周、十周、十二周或更多个周，初始剂量之后可以施用约0.5mg至约2.0mg核酸分子的一、二、三、四或更多个后续剂量。每个后续剂量可以一次、两次、三次或更多次注射施用。在一些实施例中，所述免疫原性组合物在所述另外的药剂之前、同时或之后施用于所述受试者。在一些实施例中，在施用用于治疗SARS-CoV-2感染或治疗或预防与SARS-CoV-2感染相关的疾病或病症的药剂后，所述免疫原性组合物作为加强剂施用。在一个实施例中，与SARS-CoV-2感染相关联的疾病或病症包括但不限于2019冠状病毒病(COVID-19)和/或成人多系统炎症综合征(MIS-A)或儿童多系统炎症综合征(MIS-C)。

受试者可以是哺乳动物，诸如人、马、非人灵长类动物、牛、猪、羊、猫、狗、豚鼠、兔、大鼠或小鼠。

疫苗可以预防性或治疗性施用。在预防性施用中，疫苗可以以足以诱导免疫应答的量施用。在治疗应用中，将疫苗以足以引起治疗效果的量施用于有需要的受试者。足以实现此目的的量定义为“治疗有效剂量”。用于该用途的有效量将取决于例如施用的疫苗方案的具体组合物、施用方式、疾病的阶段和严重程度、患者的总体健康状况和处方医生的判断。

疫苗可以通过本领域熟知的方法施用，如Donnelly等人(《免疫学年鉴(Ann.Rev.Immunol.)15:617-648(1997))；Felgner等人(美国专利第5,580,859号，于1996年12月3日发布)；Felgner(美国专利第5,703,055号，于1997年12月30日发布)；和Carson等人(美国专利第5,679,647号，于1997年10月21日发布)中所述，其全部内容通过引用整体并入本文。疫苗的DNA可以复合成颗粒或珠粒，颗粒或珠粒可以例如使用疫苗枪施用于个体。本领域技术人员知道，药学上可接受的载体(包括生理学上可接受的化合物)的选择取决于例如表达载体的施用途径。

疫苗可以通过多种途径递送。典型的递送途径包括肠胃外施用，例如皮内、肌肉内或皮下递送，任选地然后进行电穿孔，如本文所述。其它途径包括口服、鼻内和阴道内途径。特别是对于疫苗的DNA，可以将疫苗递送至个体组织的间质间隙(Felgner等人，美国专利第5,580,859号和第5,703,055号，所有这些专利的内容通过引用整体并入本文)。疫苗也可以施用于肌肉，或可以通过皮内或皮下注射施用，或透皮施用，如通过离子电渗疗法。也可以采用疫苗的表皮施用。表皮施用可以包括机械或化学刺激表皮的最外层以刺激对刺激物的免疫应答(Carson等人，美国专利第5,679,647号，其全部内容通过引用并入本文)。

疫苗也可以调配成经由鼻道施用。其中载体是固体的适用于鼻腔施用的调配物可以包含粒度例如在约10到约500微米范围内的粗粉，所述粗粉以吸鼻烟的方式施用，即通过鼻道从靠近鼻子的粉末容器中快速吸入。调配物可以是鼻喷雾剂、滴鼻剂或通过喷雾器的气雾剂施用。调配物可以包含疫苗的水性或油性溶液。

疫苗可以是如悬浮液、糖浆或酏剂等液体制剂。疫苗还可以是用于肠胃外、皮下、皮内、肌内或静脉内施用(例如，可注射施用)的制剂，如无菌悬浮液或乳剂。

疫苗可以并入脂质体、微球或其他聚合物基质中(Felgner等人，美国专利第5,703,055号；Gregoriadis,脂质体技术(Liposome Technology),第I至III卷(第2版，1993)，所述文献的内容以全文引用的方式并入本文中。脂质体可以由磷脂或其它脂质组成，并且可以是制备和施用相对简单的无毒、生理上可接受和可代谢的载体。

疫苗可以通过电穿孔施用，如通过美国专利第7,664,545号中描述的方法，其内容通过引用并入本文。电穿孔可以通过在美国专利号6,302,874、5,676,646、6,241,701、6,233,482、6,216,034、6,208,893、6,192,270、6,181,964、6,150,148、6,120,493、6,096,020、6,068,650和5,702,359中所述的方法和/或设备进行，其内容以全文引用的方式并入本文中。电穿孔可以通过微创器械进行。

微创电穿孔器械(“MID”)可以是用于将上述疫苗和相关流体注射到身体组织中的设备。该器械可以包含中空针、DNA盒和流体递送装置，其中该器械适于在使用中致动流体递送装置，以便在将针插入身体组织期间同时(例如，自动地)将DNA注射到所述身体组织中。这具有这样的优点，即在针插入的同时逐渐注射DNA和相关流体的能力导致流体通过身体组织的更均匀分布。由于被注射的DNA分布在较大的区域上，在注射期间经历的疼痛可以减轻。

MID可以不使用针将疫苗注射到组织中。MID可以用这样的力以小流或射流的形式注射疫苗，使得疫苗刺穿组织的表面并进入下面的组织和/或肌肉。小流或射流后面的力可以由压缩气体(如二氧化碳)在几分之一秒内通过微孔的膨胀提供。在公开的美国专利申请第20080234655号；美国专利6,520,950、7,171,264、6,208,893、6,009,347、6,120,493、7,245,963、7,328,064和6,763,264中，其中每篇的内容通过引用并入本文。

MID可以包含产生无痛刺穿组织的高速液体射流的注射器。这种无针注射器在市场上可以买到。可以在本文中使用的无针注射器的实例包括在美国专利号3,805,783、4,447,223、5,505,697和4,342,310中，其中每篇专利的内容通过引用并入本文。

适合于直接或间接电转运形式的所需疫苗可以使用无针注射器引入(例如，注射)到待治疗的组织中，通常通过使组织表面与注射器接触以致动药剂射流的递送，用足够的力使疫苗穿透到组织中。例如，如果待治疗的组织是粘膜、皮肤或肌肉，则用足够的力将药剂向粘膜或皮肤表面投射，以使药剂分别穿透角质层并进入真皮层，或进入下面的组织和肌肉。

无针注射器非常适合将疫苗递送到所有类型的组织，特别是皮肤和粘膜。在一些实施例中，可以使用无针注射器将含有疫苗的液体推进到表面并进入受试者的皮肤或粘膜。可以使用本发明方法治疗的各种类型组织的代表性实例包括胰腺、喉、鼻咽、下咽、口咽、唇、咽喉、肺、心脏、肾、肌肉、乳房、结肠、前列腺、胸腺、睾丸、皮肤、粘膜组织、卵巢、血管或其任何组合。

MID可以具有使组织电穿孔的针电极。通过在多电极阵列中的多对电极之间产生脉冲，例如以矩形或正方形图案设置，提供了比在一对电极之间产生脉冲的结果更好的结果。例如，公开于题为《用于药物和基因的介导递送的针电极(Needle Electrodes forMediated Delivery of Drugs and Genes)》的美国专利第5,702,359号是针阵列，其中多对针可以在治疗性治疗期间产生脉冲。在该申请中，针被设置成圆形阵列，但具有能够在相对的针电极对之间产生脉冲的连接器和开关设备锁，该申请通过引用并入本文，就像完全阐述一样。可以使用一对针电极将重组表达载体递送到细胞。这种器械和系统在美国专利第6,763,264号中有所描述，其内容通过引用并入本文。替代地，可以使用单针器械，其允许用类似于普通注射针的单针注射DNA和电穿孔，并施加比目前使用的器械传递的电压更低的电压脉冲，从而减少患者经历的电感觉。

MID可以包含一个或多个电极阵列。阵列可以包含两个或更多个相同直径或不同直径的针。针可以均匀地或不均匀地间隔开。这些针可以在0.005英寸与0.03英寸之间，在0.01英寸与0.025英寸之间；或在0.015英寸和0.020英寸之间。针的直径可以是0.0175英寸。针可以间隔0.5mm、1.0mm、1.5mm、2.0mm、2.5mm、3.0mm、3.5mm、4.0mm或更大。

MID可以由脉冲发生器和双针或多针疫苗注射器组成，它们在单个步骤中递送疫苗和电穿孔脉冲。脉冲发生器可以允许通过闪存卡操作的个人计算机灵活地编程脉冲和注射参数，以及全面地记录和存储电穿孔和患者数据。脉冲发生器可以在短时间内递送各种电压脉冲。例如，脉冲发生器可以递送三个持续时间为100ms的15伏脉冲。这种MID的一个实例是Inovio生物医学公司的Elgen 1000系统，其描述于美国专利第7,328,064号中有所描述，其内容通过引用并入本文。

MID可以是

MID可以是Elgen 1000系统(Inovio制药公司)。Elgen 1000系统可以包含提供中空针的器械；以及流体递送装置，其中设备适于在使用中致动流体递送装置，以便在将针插入身体组织期间同时(例如，自动地)将流体(本文所述的疫苗)注射到身体组织中。优点是当针插入时逐渐注射流体的能力导致流体通过身体组织的更均匀的分布。还据信，由于被注射的流体体积分布在较大区域上，在注射期间经历的疼痛减轻。

另外，流体的自动注射便于自动监测和记录注射的流体的实际剂量。如果需要，该数据可以由控制单元存储用于文件记录的目的。

应当理解，注射速率可以是线性的或非线性的，并且注射可以在针已经被插入通过待治疗受试者的皮肤之后并且当它们被进一步插入身体组织中时进行。

可以通过本发明的设备将流体注射到其中的合适组织包含肿瘤组织、皮肤或肝组织，但可以是肌肉组织。

该设备进一步包含用于引导针插入身体组织的针插入装置。流体注射的速率由针插入速率控制。这具有这样的优点，即针的插入和流体的注射都可以被控制，使得插入速率可以与所希望的注射速率相匹配。这也使得用户更容易操作该设备。如果需要，可以提供用于将针自动插入身体组织的装置。

用户可以选择何时开始注入流体。然而，理想地，当针的尖端已经到达肌肉组织时开始注射，并且该设备可以包括用于感测何时针已经插入到足够深度以开始注射流体的装置。这意味着当针到达所需深度(通常是肌肉组织开始的深度)时，可以促使流体的注射自动开始。肌肉组织开始的深度例如可以取为预设的针插入深度，如4mm的值，其被认为足以使针穿过皮肤层。

感测装置可以包含超声探头。感测装置可以包含用于感测阻抗或电阻变化的装置。在这种情况下，该装置可以不这样记录针在身体组织中的深度，而是适合于当针从不同类型的身体组织移动到肌肉中时检测阻抗或电阻的变化。这些替代方案中的任何一个都提供了一种相对和简单的检测注射开始的操作装置。如果需要，可以进一步记录针的插入深度，并且可以用于控制流体的注射，使得当记录针插入深度时确定待注射的流体的体积。

该设备可以进一步包含：用于支撑针的基座；以及用于在其中容纳基座的壳体，其中基座可相对于壳体移动，使得当基座处于相对于壳体的第一向后位置时，针缩回到壳体内，并且当基座处于壳体内的第二向前位置时，针伸出壳体。这对于使用者是有利的，因为壳体可以在患者的皮肤上对齐，并且然后可以通过相对于基座移动壳体而将针插入患者的皮肤中。

如上所述，希望实现流体注射的受控速率，使得流体在针插入皮肤时均匀地分布在针的长度上。流体递送装置可以包含适于以受控速率注射流体的活塞驱动装置。活塞驱动装置例如可以由伺服马达致动。然而，活塞驱动装置可以通过基座相对于壳体在轴向方向上移动来致动。应当理解，可以提供用于流体递送的替代装置。因此，例如，可以挤压以受控或非受控速率递送流体的封闭容器可以代替注射器和活塞系统。

上述设备可用于任何类型的注射。然而，设想它在电穿孔领域特别有用，因此它可以进一步包含用于向针施加电压的装置。这允许针不仅用于注射，而且在电穿孔期间用作电极。这是特别有利的，因为这意味着电场施加到与注射流体相同的区域。传统上存在电穿孔的问题，即很难将电极与先前注射的流体精确对准，因此使用者倾向于在较大面积上注射比所需更大量的流体，并在较大面积上施加电场以试图保证注射物质和电场之间的重叠。使用本发明，可以减小注射的流体的体积和施加的电场的大小，同时实现电场和流体之间的良好配合。

组合使用

在一些实施例中，本发明提供一种通过施用编码SARS-CoV-2抗原的核酸分子或其片段或变体的组合与一种或多种用于治疗SARS-CoV-2感染或者治疗或预防与SARS-CoV-2感染相关联的疾病或病症的另外的药剂组合来在有此需要的受试者中治疗SARS-CoV-2感染或者治疗、保护以免受、和/或预防与SARS-CoV-2感染相关联的疾病或病症的方法。在一些实施例中，与SARS-CoV-2感染相关的疾病或病症是2019冠状病毒病(COVID-19)、成人多系统炎症综合征(MIS-A)或儿童多系统炎症综合征(MIS-C)。

编码SARS-CoV-2抗原的核酸分子和另外的药剂可以使用任何合适的方法施用，使得编码SARS-CoV-2抗原的核酸分子和该另外的试剂的组合都存在于受试者中。在一个实施例中，所述方法可以包括施用包括用于治疗SARS-CoV-2感染或治疗或预防与SARS-CoV-2感染相关的疾病或病症的药剂的第一组合物，并且在施用所述包括所述用于治疗SARS-CoV-2感染或者治疗或预防与SARS-CoV-2感染相关的疾病或病症的药剂的第一组合物后小于1天、小于2天、小于3天、小于4天、小于5天、小于6天、小于7天、小于8天、小于9天或小于10天，施用包括编码SARS-CoV-2抗原的核酸分子的第二组合物。在一个实施例中，该方法可包括施用包括编码SARS-CoV-2抗原的核酸分子的第一组合物，并且在施用编码SARS-CoV-2抗原的核酸分子后少于1天、少于2天、少于3天、少于4天、少于5天、少于6天、少于7天、少于8天、少于9天或少于10天，施用包括用于治疗SARS-CoV-2感染或者治疗或预防与SARS-CoV-2感染相关联的疾病或病症的药剂的第二组合物。在一个实施例中，该方法包括同时施用包括用于治疗SARS-CoV-2感染或者治疗或预防与SARS-CoV-2感染相关联的疾病或病症的药剂的第一组合物以及包括编码SARS-CoV-2抗原的核酸分子的第二组合物。在一个实施例中，所述方法包括施用包括用于治疗SARS-CoV-2感染或者治疗或预防与SARS-CoV-2感染相关的疾病或病症的药剂的单一组合物以及编码SARS-CoV-2抗原的核酸分子。

在一些实施例中，用于治疗SARS-CoV-2感染或者治疗或预防与SARS-CoV-2感染相关的疾病或病症的药剂是治疗剂。在一个实施例中，治疗剂是抗病毒剂。在一个实施例中，治疗剂是抗生素剂。

可以与编码本发明的SARS-CoV-2抗原的核酸分子组合使用的抗生素的非限制性实例包括氨基糖苷类(例如，庆大霉素、阿米卡星、妥布霉素)、喹诺酮类(例如，环丙沙星、左氧氟沙星)、头孢菌素类(例如，头孢他啶、头孢吡肟、头孢哌酮、头孢匹罗、头孢托比普罗)、抗假单胞菌青霉素类：羧基青霉素类(例如，羧苄青霉素和替卡西林)和脲青霉素类(例如，美洛西林、阿洛西林和哌拉西林)、碳青霉烯类(例如，美罗培南、亚胺培南、多利培南)、多粘菌素(例如，多粘菌素B和粘菌素)和单环内酰胺类(例如，氨曲南)。

作为加强剂施用

在一个实施例中，在施用初始药剂或用于治疗SARS-CoV-2感染或者治疗或预防与SARS-CoV-2感染相关的疾病或病症(包括但不限于COVID-19、成人多系统炎症综合征(MIS-A)或儿童多系统炎症综合征(MIS-C))后，施用免疫原性组合物作为加强疫苗。在一个实施例中，在施用用于治疗SARS-CoV-2感染或者治疗或预防与SARS-CoV-2感染相关的疾病或病症(包含但不限于COVID-19、成人多系统炎症综合征(MIS-A)或儿童多系统炎症综合征(MIS-C))的初始药剂或疫苗后，所述加强剂疫苗施用至少一次、至少两次、至少3次、至少4次或至少5次。在一个实施例中，在施用初始药剂或用于治疗SARS-CoV-2感染或者治疗或预防与SARS-CoV-2感染相关联的疾病或病症(包括但不限于COVID-19、成人多系统炎症综合征(MIS-A)或儿童多系统炎症综合征(MIS-C))的疫苗后至少8小时、至少12小时、至少16小时、至少20小时、至少24小时、至少36小时、至少48小时、至少60小时、至少72小时、至少4天，至少5天、至少6天、至少1周、至少2周、至少3周、至少4周、至少1个月、至少2个月、至少3个月、至少4个月、至少5个月、至少6个月、至少7个月、至少8个月、至少9个月、至少10个月、至少11个月、至少1年或超过1年，施用加强疫苗。

在测定中的用途

在一些实施例中，本发明的核酸分子或编码的抗原可以用于体内或体外测定中。在一些实施例中，核酸分子或编码的抗原可以在用于检测抗SARS-CoV-2刺突抗体的存在的测定中使用。可以将核酸分子或经编码的抗原整合到其中的示例性测定包含但不限于蛋白质印迹、斑点印迹、表面等离子体共振法、流式细胞术方法、各种免疫测定，例如免疫组织化学测定、免疫细胞化学测定、ELISA、捕获ELISA、酶联免疫斑点(ELISpot)测定、夹心测定、酶免疫测定、放射免疫测定、荧光免疫测定等，所有这些都是本领域技术人员已知的。参见例如Harlow等人，1988,Antibodies:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor,New York；Harlow等人，1999,Using Antibodies:A Laboratory Manual,Cold Spring HarborLaboratory Press,NY。

在一个实施例中，本发明的SARS-CoV-2刺突抗原或其片段可以在与流式细胞术组合的细胞内细胞因子染色测定中使用，以评定T细胞免疫应答。此测定使得能够同时评估与响应T细胞有关的多个表型、分化和功能参数，最值得注意的是，多种效应细胞因子的表达。这些属性使所述技术特别适于评估由本发明的疫苗诱导的T细胞免疫应答。

在一个实施例中，本发明的SARS-CoV-2刺突抗原或其片段可以用于ELIspot测定。ELISpot测定是在单细胞水平下测量分泌细胞因子的细胞的频率的高度敏感的免疫测定。在此测定中，在存在或不存在刺激的情况下，将细胞培养在涂覆有特异性捕获抗体的表面上。在一个实施例中，本发明的SARS-CoV-2刺突抗原或其片段可以在ELISpot测定中用作刺激物。

诊断方法

在一些实施例中，本发明涉及将受试者诊断为患有SARS-CoV-2感染或具有SARS-CoV-2抗体的方法。在一些实施例中，所述方法包含将来自受试者的样品与本发明的SARS-CoV-2抗原或包括用于表达SARS-CoV-2抗原的核酸分子的细胞接触，并且检测抗SARS-CoV-2刺突抗体与本发明的SARS-CoV-2抗原的结合。在此类实施例中，受试者的样品中存在的抗SARS-CoV-2刺突抗体与本发明的抗原或其片段的结合将表明受试者当前感染或先前感染有SARS-CoV-2。

试剂盒和制品

本文提供一种试剂盒，该试剂盒可以用于使用上文所描述的疫苗接种方法治疗受试者。所述试剂盒可以包括本文所描述的免疫原性组合物。

该试剂盒还可包括关于实施上述疫苗接种方法和/或如何使用试剂盒的说明书。试剂盒中包括的说明书可以贴在包装材料上或可以作为包装说明书包括在内。虽然说明书通常是书面或印刷材料，但它们不限于此。本公开涵盖能够存储指令并将其传送到最终用户的任何介质。这种介质包括但不限于电子存储介质(例如，磁盘、磁带、盒式磁带)、光学介质(例如，CD ROM)等。如本文所用，术语“指令”可以包括提供指令的互联网网站的地址。

本文进一步提供含有本文所描述的免疫原性组合物的制品。在一些实施例中，所述制品是容器，如小瓶，任选地一次性小瓶。在一个实施例中，所述制品是配备有塞子的一次性玻璃小瓶，所述一次性玻璃小瓶含有要施用的本文所描述的免疫原性组合物。在一些实施例中，小瓶包括可被注射器刺穿的塞子以及密封件。在一些实施例中，所述制品是注射器。

本发明具有多个方面，通过以下非限制性实施例展示。

实例

实例1

材料与方法：

细胞系。人胚肾(HEK)-293T(

体外蛋白质表达(蛋白质印迹)。如前所述，培养和转染人胚胎肾细胞293T(Yan等人Enhanced cellular immune responses elicited by an engineered HIV-1subtypeBconsensus-based envelope DNA vaccine.Mol Ther.2007；15(2):411-421.)。按照制造商的方案，使用TurboFectin8.0(傲锐基因科技有限公司(OriGene))转染试剂用pDNA转染293T细胞。四十八小时后，使用改良的RIPA细胞裂解缓冲液采集细胞裂解物。在4-12％BIS-TRIS凝胶(赛默飞世尔科技公司(ThermoFisher Scientific))上分离蛋白质。转移后，将印迹与抗SARS-CoV刺突蛋白多克隆抗体(诺伟思生物制剂公司(Novus Biologicals))一起温育，并且然后与辣根过氧化物酶(HRP)偶联的抗小鼠IgG(通用安玛西亚(GE Amersham))一起观察。

转染的293T细胞的免疫荧光。对于刺突蛋白表达的体外染色，293T细胞在4孔载玻片(Lab-Tek)上培养，并且按照制造商的方案使用TurboFectin8.0(OriGene)转染试剂用3μg/孔的pDNA进行转染。在用10％中性缓冲福尔马林(华盛顿州BBC生化公司(BBCBiochemical,Washington State))转染之后48小时将细胞在室温(RT)下固定10分钟，并且然后用PBS洗涤。在染色之前，室载玻片用PBS中的0.3％(v/v)Triton-X(Sigma)、2％(v/v)驴血清在RT阻断1小时。用在PBS中的1％(w/v)BSA(西格玛公司)、2％(v/v)驴血清、0.3％(v/v)Triton-X(西格玛公司)和0.025％(v/v)1g/ml叠氮化钠(西格玛公司)中稀释的兔抗SARS-CoV刺突蛋白多克隆抗体(诺伟思生物制剂公司)在RT下对细胞进行染色持续2小时。载玻片在PBS中洗涤三次，持续5分钟，并且然后在RT下用驴抗兔IgG AF488(生命技术公司(Life Technologies)，A21206)染色1小时。再次洗涤载玻片并用DAPI-Fluoromount(南方生物技术公司(SouthernBiotech))安装和覆盖。

体外RNA表达(qRT-PCR)。通过用连续稀释的质粒转染COS-7，然后使用逆转录和PCR分析从细胞中提取的总RNA，证明了质粒的体外mRNA表达。使用

抗原结合ELISA。进行ELISA以确定血清抗体结合滴度。Nunc ELISA板在4℃下在杜氏磷酸盐缓冲盐水(Dulbecco’s phosphate-buffered saline，DPBS)中用1μg/ml重组蛋白抗原包被过夜。将板洗涤三次，然后用含有0.05％ Tween 20的DPBS中的3％牛血清白蛋白(BSA)在37℃封闭2小时。然后洗涤板并与小鼠或豚鼠血清的连续稀释液一起温育，并在37℃下温育2小时。再次洗涤板，并且然后用经辣根过氧化物酶(HRP)缀合的抗豚鼠IgG次级抗体(西格玛奥德里奇公司(Sigma-Aldrich)，目录号A7289)或经HRP缀合的抗小鼠IgG次级抗体(西格玛奥德里奇公司)的1:10,000稀释液温育并在RT下温育1小时。最终洗涤之后，使用SureBlue

ACE2竞争ELISA。对于小鼠研究，进行ELISA以确定针对具有人Fc标签的人ACE2的血清IgG抗体竞争。Nunc ELISA板在室温(RT)下用1X PBS中的1μg/mL兔抗His6X包被4至6小时，并且用洗涤缓冲液(1X PBS和0.05％

对于豚鼠研究，在96孔半面积测定(Costar)板用在1x DPBS(Thermofisher)中稀释的25μl每孔的5μg/mL的SARS-CoV-2刺突S1+S2蛋白(Sino Biological)在4℃包被过夜。用含有0.05％

SARS-CoV-2假病毒中和测定。使用经GeneJammer(Agilent)转染的HEK293T细胞，使用IgE-SARS-CoV-2S质粒(Genscript)和pNL4-3.Luc.R-E-质粒(NIH AIDS试剂)，以1:1比率产生SARS-CoV-2假型化病毒。转染后四十八小时，收集转染上清液，用FBS富集至最终体积的12％，无菌过滤(Millipore Sigma)，并分装在-80℃储存。SARS-CoV-2假型化病毒在72小时的感染之后进行滴定并且产生大于单独细胞的50倍的相对发光单位(RLU)。将来自INO-4800疫苗接种的组和原初组的小鼠血清在56℃热灭活15分钟，并从1:10稀释度开始连续稀释三倍用于测定。将血清与固定量的SARS-CoV-2假型化病毒一起温育90分钟。在90分钟之后添加稳定表达ACE2的HEK293T细胞，并且允许在标准培养箱(37％湿度，5％ CO

SARS-CoV-2野生型病毒中和测定。SARS-CoV-2/澳大利亚/VIC01/2020分离物中和测定在英国公共卫生部(Porton Down,UK)进行。在已经在56℃下热灭活持续30分钟的血清样品中测量中和病毒滴度。SARS-CoV-2(澳大利亚/VIC01/2020分离物)(Caly等人,从澳大利亚第一位确诊患有COVID-19的患者中分离和快速共享2019新型冠状病毒(SARS-CoV-2)(Isolation and rapid sharing of the 2019novel coronavirus(SARS-CoV-2)from thefirst patient diagnosed with COVID-19in Australia.)Med.J.Aust.(2020)doi:10.5694/mja2.50569；在线发布：2020年4月13日)被稀释至933pfu/ml的浓度，并且在含有25mM HEPES缓冲液的1％ FCS/MEM中以50:50混合，其中在96孔V底板中将血清稀释度从1:10加倍至1:320。在将病毒转移到已在前一天在10％ FCS/MEM中以每孔1.5x 10

SARS-CoV-2/WH-09/人/2020分离物中和测定在中华人民共和国国家卫生健康委员会批准的中国医学科学院实验动物科学研究所(CAMS)进行。原种SARS-CoV-2(SARS-CoV-2/WH-09/人/2020)种群和病毒分离研究在维持在补充有10％胎牛血清(FBS)、100IU/ml青霉素和100μg/ml链霉素的杜氏改良伊氏培养基(DMEM，Invitrogen,Carlsbad,USA)中的Vero E6细胞中进行，并且在36.5℃、5％ CO

支气管肺泡灌洗液收集。通过用700-1000ul含有100μm EDTA、0.05％叠氮化钠、0.05％

IFN-γELISpot。小鼠：将来自小鼠的脾单独收集在补充有10％ FBS(R10)和青霉素/链霉素的RPMI1640培养基中，并加工成单细胞悬浮液。在室温下，将细胞沉淀物重新悬浮在5mL的ACK裂解缓冲液(加利福尼亚州卡尔斯巴德生命技术公司(Life Technologies,Carlsbad,CA))中持续5分钟，然后添加PBS以停止反应。样品再次以1,500g离心10分钟，将细胞沉淀物重新悬浮在R10中，并且然后在用于ELISpot测定之前通过45μm尼龙过滤器。使用小鼠IFN-γELISpot

流式细胞术。对从BALB/c和C57BL/6小鼠中采集的在37℃、5％ CO

统计：使用GraphPad Prism 7或8软件(加利福尼亚州拉荷亚(La Jolla,CA))进行所有统计学分析。如果p<0.05，这些数据被视为是显著的。所有图中的线表示平均值，并且误差线表示标准偏差。没有样品或动物被排除在分析之外。动物研究未进行随机化。在进行每个实验之前，样品和动物不是不知情的。

结果

SARS-CoV-2DNA疫苗构建体的设计和合成

从发表在GISAID(共享所有流感数据全球倡议)上的前四个可用SARS-CoV-2全基因组序列中检索到四个刺突蛋白序列。三个刺突序列是100％匹配的，并且一个被视为是异常值(与其它序列具有98.6％序列同一性)。进行序列比对之后，产生了SARS-CoV-2刺突糖蛋白序列(“Covid-19刺突抗原”；SEQ ID NO:1)，并且添加了N端IgE前导序列。如本文别处所描述产生高度优化的编码SARS-CoV-2IgE-刺突的DNA序列，以增强表达和免疫原性。产生了SARS-CoV-2刺突异常糖蛋白序列(“Covid-19刺突-OL抗原”；SEQ ID NO:4)，并且添加了N端IgE前导序列。合成经优化的DNA序列，用BamHI和XhoI消化，并且在人巨细胞病毒立即早期启动子和牛生长激素聚腺苷酸化信号的控制下克隆到表达载体pGX0001中。所得质粒被设计为pGX9501和pGX9503，分别被设计成编码来自3个匹配序列和异常序列的SARS-CoV-2S蛋白(图1A)。

合成DNA疫苗构建体的体外表征

测量了用pGX9501和pGX9503转染的COS-7细胞中经编码的SARS-CoV-2刺突转基因在RNA水平下的表达。使用从经转染的COS-7细胞中提取的总RNA，通过RT-PCR确认刺突转基因的表达(图1B)。使用针对细胞裂解物上的SARS-CoV S蛋白的交叉反应性抗体，通过蛋白质印迹分析来测量293T细胞中的体外刺突蛋白表达。用pGX9501或pGX9503构建体转染的HEK-293T细胞的裂解物的蛋白质印迹揭示，条带接近于预测的S蛋白分子量140-142kDa，其中可能由于S蛋白中的22个潜在的N-连接聚糖而略有变化(图1C)。在免疫荧光研究中，在用pGX9501或pGX9503转染的293T细胞中检测到S蛋白(图1D)。总之，体外研究揭示了在用候选疫苗构建体转染细胞系之后，刺突蛋白在RNA和蛋白质水平两者上的表达。

小鼠的体液免疫应答。pGX9501被选择作为用于推进免疫原性研究的疫苗构建体，因为与异常值pGX9503相比，它可能提供更广泛的覆盖范围。pGX9501后续被称为INO-4800。INO-4800的免疫原性在BALB/c小鼠中进行了评估，施用后使用

中和测定。开发了一种基于pNL4-3.Luc.R-E的显示SARS-CoV-2刺突蛋白的假病毒的中和测定。与RLU信号没有降低的对照相比，通过相对荧光素酶单位(RLU)的减少来检测中和滴度。BALB/c小鼠在第0天和第14天用INO-4800免疫两次，并且在第2次免疫后第7天收集血清。将假病毒与小鼠血清的连续稀释液一起温育，并且将血清-病毒混合物添加到稳定表达人ACE2受体(ACE2-293T)的293T细胞中持续72小时。在经INO-4800免疫的小鼠中观察到中和ID50平均滴度为92.2(图4A和4B)。没有观察到对照动物的RLU减少。还通过噬斑减少中和测试(PRNT)测定对两种野生型SARS-CoV-2病毒株的中和滴度进行了测量。来自经INO-4800免疫的BALB/c小鼠的血清中和SARS-CoV-2/WH-09/人/2020和SARS-CoV-2/澳大利亚/VIC01/2020病毒株两者，其中平均ND50滴度分别为97.5和128.1(表1)。在相同的INO-4800免疫方案之后，还在C57BL/6小鼠中评估了活病毒中和滴度。来自经INO-4800免疫的C57BL/6小鼠的血清中和野生型SARS-CoV-2病毒，其中平均ND50滴度为340(表1)。

表1.在向小鼠和豚鼠施用INO-4800之后的血清中和活性。

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评估INO-4800在哈特利豚鼠模型(已建立的皮内疫苗递送模型)中的免疫原性(Carter等人The adjuvant GLA-AF enhances human intradermal vaccine responses.《科学进展(Sci Adv.)》2018；4(9):eaas9930；Schultheis等人对在EP辅助将DNA疫苗递送到皮肤之后引发的豚鼠T细胞应答的表征(Characterization of guinea pig T cellresponses elicited after EP-assisted delivery of DNA vaccines to the skin.)《疫苗(Vaccine.)》2017；35(1):61-70)。如上文方法部分所描述，通过Mantoux注射将100μg的pDNA施用于皮肤，然后在当天通过

抑制SARS-CoV-2 S蛋白与ACE2受体结合。检查了INO-4800诱导的抗体应答的受体抑制功能。开发了一种基于ELISA的ACE2抑制测定作为中和的替代方法。作为该测定中的对照，示出了ACE2以EC50为0.025μg/ml与SARS-CoV-2刺突蛋白结合(图6A)。在第0天和第14天用10μg的INO-4800使BALB/c小鼠免疫，并且在免疫后第21天纯化血清IgG以确保抑制是抗体介导的。比较了使用来自原初小鼠和来自经INO-4800疫苗接种的小鼠的血清IgG对刺突-ACE2相互作用的抑制(图6B)。对一组五只经免疫的小鼠重复受体抑制测定，证明INO-4800诱导的抗体与ACE2竞争与SARS-CoV-2刺突蛋白的结合(图6C和6F)。在豚鼠模型中进一步评估了ACE2结合抑制。从经INO-4800免疫的豚鼠收集的血清在ACE2浓度范围(0.25μg/ml至4μg/ml)内抑制SARS-CoV-2刺突蛋白的结合(图6D)。此外，血清稀释度曲线揭示了从经INO-4800免疫的豚鼠收集的血清以稀释度依赖性方式阻断ACE2与SARS-CoV-2的结合(图6E)。从经pVAX处理的动物中收集的血清在抑制ACE2与病毒蛋白结合方面显示出可忽略不计的活性，在最高血清浓度下下OD信号的降低被视为是测定中的基质效应。图6F描绘，与合并的原初小鼠IgG相比，在用INO-4800进行第二次免疫后第14天，从n＝5只小鼠中纯化的IgG显示针对与SARS-CoV-2刺突蛋白结合的ACE2受体的竞争。

总之，小鼠和豚鼠两者的免疫原性测试揭示，SARS-CoV-2候选疫苗INO-4800能够引发对SARS-CoV-2刺突蛋白的抗体应答。ACE2被视为是SARS-CoV-2细胞进入的主要受体，阻断这种相互作用表明INO-4800诱导的抗体可以预防宿主感染。

SARS-CoV-2反应性IgG到肺部的生物分布。下呼吸道疾病(LRD)与严重的COVID-19病例相关。肺黏膜中针对SARS-CoV-2的抗体的存在可能会介导对LRD的保护。评估了经免疫的小鼠和豚鼠的肺部存在SARS-CoV-2特异性抗体。BALB/c小鼠和哈特利豚鼠分别在第0天和第14天或第0天、第14天和第28天用INO-4800或pVAX对照pDNA进行免疫。处死后收集支气管肺泡灌洗(BAL)液，并进行SARS-CoV-2S蛋白ELISA。在接受INO-4800的BALB/c和哈特利豚鼠两者中，与接受pVAX对照的动物相比，测量到BAL液中的SARS-CoV-2S蛋白结合IgG的统计学显著增加(图7A至7D)。总之，这些数据证明在用INO-4800免疫后，肺部存在抗SARS-CoV-2特异性抗体。

在小鼠中的冠状病毒交叉反应性细胞免疫应答。通过IFN-γELISpot测定针对SARS-CoV-2、SARS-CoV和MERS-CoV S抗原的T细胞应答。在INO-4800施用后第4天、第7天或第10天处死BALB/c小鼠组(2.5或10μg的pDNA)，采集脾细胞，并且用跨越SARS-CoV-2、SARS-CoV和MERS-CoV刺突蛋白的15聚体重叠肽池刺激单细胞悬液20小时。在INO-4800施用后第7天，分别针对2.5和10μg剂量，测量到每10

BALB/c SARS-CoV-2表位映射。对接受10μg INO-4800剂量的BALB/c小鼠的脾细胞进行表位作图。使用三十个基质映射池刺激脾细胞20小时，并且在多个肽池中检测到免疫显性应答(图14A)。对应答进行去卷积以鉴定在受体结合结构域和S2结构域中聚集的几个表位(H2-Kd)(图14B)。有趣的是，观察到一个SARS-CoV-2H2-Kd表位PHGVVFLHV(SEQ ID NO:16)与SARS-CoV人HLA-A2限制性表位VVFLHVTVYV(SEQ ID NO:17)重叠并相邻。

总之，在用INO-4800免疫的小鼠中检测到针对SARS-CoV-2S蛋白表位的T细胞应答。

实例2-在经INO-4800治疗的新西兰白(NZW)兔中测量的细胞免疫应答和体液免疫应答。

第0天和第28天皮内递送pDNA。PBMC IFN-γELISpot(图9)；血清IgG结合ELISA(图10)。

实例3

在经INO-4800治疗的恒河猴中测量的对SARS-CoV-2刺突蛋白的体液免疫应答。

第0天和第28天皮内递送pDNA。血清IgG结合ELISA。(图11A至11E。)

在经INO-4800治疗的恒河猴中测量的对SARS和MERS刺突蛋白的体液免疫应答。第0天和第28天皮内递送pDNA。血清IgG结合ELISA。(图12A至12G；左图，1mg INO-4800；右图，2mg INO-4800)。

在第0天和第28天皮内递送pDNA后，通过PBMC IFN-γELISpot在经INO-4800治疗的恒河猴中测量的细胞免疫应答。结果在图13A(SARS CoV-2刺突肽)；13B(SARS CoV刺突肽)；以及13C(MERS CoV刺突肽)中显示。

实例4INO-4800SARS-CoV-2刺突ELISA测定

通过孵育过夜或持续至多三天，将SARS-CoV-2刺突蛋白包被到96孔微孔板的孔上。然后添加封闭缓冲液以封闭剩余的空闲结合位点。将含有针对SARS-COV-2刺突蛋白的抗体的人血清样品和测定对照添加到封闭板中并温育1小时。在温育期间，样品中存在的抗刺突蛋白抗体和阳性对照与固定在板上的刺突蛋白结合。然后洗涤板以去除未结合的血清组分。接下来，添加经辣根过氧化物酶(HRP)标记的抗人IgG抗体，以检测与刺突蛋白结合的抗体。在一小时温育之后，洗涤板以去除未结合的HRP检测抗体，并且将TMB底物添加到板中。在存在辣根过氧化物酶的情况下，TMB底物变为深蓝色，与孔中存在额HRP的量成比例。在允许反应进行大约10分钟之后，添加酸基终止溶液，这会停止酶促反应并使TMB变为黄色。黄色与每个孔中结合的抗刺突蛋白抗体的量成比例，并且在450nm处读取。测定应答的幅度以滴度表示。滴度值被定义为最大连续稀释度，在所述稀释度处，测定信号大于基于来自正常人类供体的一组血清的测定背景水平的截止值。

ELISA测定方法鉴定

INO-4800SARS-CoV-2刺突ELISA测定已有资格，并且被发现适于测量参与涉及INO-4800的临床试验的受试者中的体液应答。正式鉴定由18个板组成，并且由两名操作员在四天的时间内进行。鉴定确定了测定的灵敏度、特异性、选择性和精度。在开发所述测定时，康复血清不可用。因此在开发中使用了单克隆抗体。在正常人血清中稀释的单克隆抗体用于测试此测定中的所有参数。1/20稀释的血清的总体测定灵敏度为16.1ng/mL，未经稀释的血清为322ng/mL。通过在测定前将抗刺突蛋白抗体与重组刺突蛋白预孵育来评定特异性。与重组刺突蛋白预孵育导致信号降低超过60％，表明抗体与包被在板上的刺突蛋白特异性结合，而不是与不同的测定组分结合。通过向单独的人血清样品中掺杂浓度接近检测限的阳性对照抗刺突抗体来研究选择性。10个个体中有七个个体的信号高于截止值，并且十个个体中有八个个体的测定信号在十个个体的平均信号的20％内，这证明当1/20稀释时，大多数人血清样品的基质效应预期会很小。通过在六个板中的每一个上测定六次高、低和中等抗刺突蛋白抗体阳性对照来评估测定精度。结果表明测定内原始信号变化低，但测定间原始信号变化高。由于每个单独的板截止值是基于每个板上的阴性对照的信号，因此预期原始信号中的测定间变化不会影响最终滴度计算的精度。为了测试这一点，在此鉴定中，通过在六个板上的每个板上滴定HPC(高阳性对照)六次，总共进行了三十六次滴度评估，评估了板截止值的精度。三十六个值中有三十五个是相同的(滴度为180)，而其中一个滴度确定比其余的低一级(60而不是180)。这产生了4.6％的测定间CV。

实例5INO-4800SARS-CoV-2刺突ELISPOT测定

酶联免疫斑点(ELISPOT)测定是在单细胞水平下测量分泌细胞因子的细胞的频率的高度敏感的免疫测定。在此测定中，在存在或不存在刺激的情况下，将细胞培养在涂覆有特异性捕获抗体的表面上。在适当的温育时间之后，去除细胞并使用检测抗体以与ELISA所采用的相似的程序检测分泌的分子。检测抗体被生物素化，并且然后是链霉亲和素-酶缀合物。通过使用具有沉淀物而非可溶性产品的底物，最终结果是在表面上可见的斑点。每个点对应于单独的分泌细胞因子的细胞。成功完成了IFN-y ELISPOT测定鉴定，评估了测定特异性、重现性和精度(测定内精度和测定间精度)、动态范围、线性、相对准确度、检测限和定量限以及测定稳健性。所述测定已根据GLP/GCLP实验室指南进行了测试和资格鉴定。

ELISPOT测定方法鉴定。特异性读取给出了测定阴性对照(含有DMSO的培养基)的平均值为<10个斑点形成单位(SFU)，阳性对照肽池CEF的平均值为565SFU，并且响应于用丝裂原(佛波醇肉豆蔻酸乙酸酯+罗奴霉素)进行的刺激的平均值为593SFU。测定内变化的最高报告CV％为7.37％。测定间变异的最高报告CV％为17.23％。观察到的操作员间变异性的最高CV％为8.11％。这些值落在FDA推荐的20％标准接受标准以下。

稀释度曲线的线性以0.15的斜率和0.99的R2值证明。在列出的动态范围(156-5000个细胞/孔)内，测定准确度>90％，落在80-120％的接受标准内。检测限确定为11SFU/1x10

基于此资格鉴定的结果，IFN-y ELISPOT被视为是合格的，并且可用于临床试验。

实例6用于评估INO-4800(针对SARS-CoV-2的预防性疫苗)的安全性、耐受性和免疫原性的1期开放标记研究，在健康志愿者中进行皮内施用，然后进行电穿孔

这是一项1期、开放标记、多中心试验(clinicaltrials_gov标识符NCT04336410)，用于评估通过皮内(ID)施用，然后使用

表2：COVID19-001基础研究剂量组

a

最后一个剂量后，所有受试者随访24周。第28周为研究结束(EOS)访视。

主要目标：

·评估INO-4800在健康成年志愿者中通过ID注射然后通过EP施用的耐受性和安全性

·评估对通过ID注射然后通过EP施用的INO-4800的细胞免疫应答和体液免疫应答

主要安全性端点：

·按系统器官类别(SOC)、首选术语(PT)、严重性和与研究产品的关系划分的不良事件发生率

·施用(即，注射)位点反应(按频率和严重程度描述)

·特别关注的不良事件的发生率

主要免疫原性端点：

·按照结合测定的SARS-CoV-2刺突糖蛋白抗原特异性抗体

·通过IFN-γ、ELISpot和/或流式细胞术测定的抗原特异性细胞免疫应答

探索性目的：

·通过评估T和B细胞免疫应答来评估扩展的免疫学特征

探索性端点：

·扩展的免疫学特征，可以包含(但不限于)对T和B细胞数量、中和应答以及T和B细胞分子变化的另外评估，通过在所有周测量如由样品可用性确定的所关注基因的免疫蛋白和mRNA水平

安全性评估：

在试验持续期间至研究结束(EOS)或受试者最后一次访视期间，受试者针对安全性进行随访。在每次访视(以及第1天的电话通话)时收集不良事件。根据事件时间表(表3)，在筛选时、第0天(仅妊娠测试)、第1周(仅妊娠测试)、第4周、第6周、第8周、第12周和第28周抽取实验室血液和尿液样品。所有不良事件，无论关系如何，都从同意之日到EOS收集。所有严重不良事件、特别关注的不良事件和治疗相关的不良事件随访至消退或稳定。

表3.事件的临床试验时间表

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表3(续)

a.筛选评定发生在第0天之前的-30天到-1天。

b.仅在筛选时和第28周(或任何其他研究中止访视)时进行全面体格检查。在所有其他访视时进行有针对性的体格检查。

c.包括Na、K、Cl、HCO3、Ca、PO4、葡萄糖、BUN和Cr。

d.HIV抗体或快速测试、HBsAg、HCV抗体。

e.用于检测葡萄糖、蛋白质和血尿的试纸。如果试纸异常，应进行显微镜检查。

f.在筛查时进行血清妊娠测试。在其他访视时进行尿液妊娠测试。

g.所有剂量均经由皮内注射，然后进行EP来递送。

h.对于研究组1，在第0天和第4周，优选在三角肌上进行一次皮肤注射。对于研究组2，进行两次皮肤注射，每次注射在不同的三角肌或股四头肌外侧；优选在第0天和第4周时在三角肌上进行。

i.施用INO-4800后，将从

j.包括自同意之时起的AE以及符合AE条件的所有注射部位反应。

k.电话随访以收集AE。

l.每个时间点4x 8.5mL(34mL)全血置于10mL酸性柠檬酸葡萄糖(ACD，黄帽)管中。注意：在第1个剂量之前(筛选和第0天给药之前)收集总计68mL全血。

m.每个时间点1x 8mL血液置于10mL红帽血清收集管中。注意：在第1个剂量之前(筛选和第0天给药之前)的每个时间点收集血清的四个等分试样，每个1mL(总计4mL)。

免疫原性评估：

在筛选时、第0天(剂量之前)、第4周(剂量之前)、第6周、第8周、第12周和第28周收集免疫学血液样品。在整个研究过程中持续不断地确定所收集样品的免疫学端点的分析确定。

临床试验群体：

年龄在18至50岁(含)之间的健康成年志愿者。

纳入标准：

a.年龄在18至50岁(含)的成年人；

b.由研究者基于在筛选时的病史、体格检查和生命体征判断为健康；

c.能够并愿意遵守所有研究程序；

d.筛选处于正常范围内或研究者认为并非临床显著的实验室结果；

e.对于乙型肝炎表面抗原(HBsAg)、丙型肝炎抗体和人类免疫缺陷病毒(HIV)抗体筛选，血清学测试呈阴性；

f.筛选研究者认为没有临床显著发现的心电图(ECG)(例如沃尔夫-帕金森-怀特综合征)；

g.使用医学上有效的避孕措施(如果从筛选到最后一个剂量后3个月一致且正确地使用，则每年的失败率<1％)，处于绝经后，经手术绝育或伴侣绝育。

排除标准：

a.在从筛选访视开始直至最后一个剂量后3个月的试验预计持续时间内怀孕或哺乳，或打算怀孕或生育；

b.目前正在参与或在第0天前30天内参与过一项用研究性产品进行的研究；

c.先前暴露于SARS-CoV-2(由研究者自行决定进行实验室测试)或接受用于预防COVID-19、MERS或SARS的研究性疫苗产品；

d.目前患有下列疾病或有下列疾病史：

·呼吸系统疾病(例如，哮喘、慢性阻塞性肺病)；

·高血压，坐位收缩压>150mm Hg或舒张压>95mm Hg；

·筛选后5年内患有恶性肿瘤；

·心血管疾病(例如，心肌梗塞、充血性心力衰竭、心肌病或临床显著的心律失常)；

e.潜在疾病或治疗导致的免疫抑制，包括：

·原发性免疫缺陷；

·口服或肠胃外糖皮质激素的长期(≥7天)使用；

·当前或预期使用疾病缓解剂量的抗风湿药物和生物疾病缓解药物；

·实体器官或骨髓移植史；

·其他临床显著的免疫抑制既往病史或临床诊断的自身免疫性疾病。

f.考虑到三角肌和股四头肌前外侧肌肉，可用于ID注射和EP的可接受部位少于两个；

g.具有在研究者看来可能会混淆研究结果或因参与研究而对患者构成另外风险的任何体格检查结果和/或任何疾病史。

临床试验治疗：

INO-4800药品含有处于1X SSC缓冲液(150mM氯化钠和15mM柠檬酸钠)中的10mg/mL DNA质粒pGX9501。将0.4mL体积填充到配有橡胶塞和密封铝盖的2mL玻璃瓶中。INO-4800储存于2℃至8℃。

在第0天和第4周每次给药访视时，向研究组1施用INO-4800的一次1.0毫克(mg)皮内(ID)注射，然后使用

外周血免疫原性评定

获得全血和血清样品。在筛选时并且在事件时间表(表3)中指定的访视时收集免疫学血液和血清样品。需要筛选和第0天免疫学样品来进行所有免疫学测试。使用测定测量对INO-4800的T和B细胞免疫应答，这些测定可包括但不限于ELISA、中和、免疫基因表达评定、免疫蛋白表达评定、流式细胞术和ELISPOT。ELISA结合测定是使用96孔ELISA板的基于标准板的ELISA。用SARS-CoV-2刺突蛋白包被板并阻断。阻断后，将来自经疫苗接种的受试者的血清连续稀释并在板上孵育。能够结合人IgG的二抗用于评定血清中疫苗特异性抗体的水平。T细胞应答通过IFN-γELISPOT测定进行评定。从研究志愿者中分离出的PBMC与SARS-CoV-2刺突蛋白的肽片段一起孵育。将细胞和肽置于包被有捕获IFN-γ抗体的MabTech板中。刺激24小时后，洗掉细胞并添加结合IFN-γ的二抗。每个疫苗特异性细胞均产生一个斑点，可以通过计数该斑点来确定诱导的细胞应答水平。此外，还可以评定研究期间对SARS-CoV-2核衣壳蛋白(NP)的体液应答，以排除野生型SARS-CoV-2在INO-4800治疗后的潜在感染。在整个研究过程中持续不断地确定所收集样品的免疫学端点的分析确定。

主要结果量度：

1.有不良事件(AE)的参与者的百分比[时间范围：基线直至第28周]

2.有施用(注射)部位反应的患者的百分比[时间范围：第0天直至第28周]

3.特别关注的不良事件(AESI)的发生率[时间范围：基线直至第28周]

4.抗原特异性结合抗体滴度相对于基线的变化[时间范围：基线直至第28周]如果疫苗接种后的光密度比第0天的光密度高2.0SD并高于ELISA特异性截止值，则认为受试者具有阳性抗体应答。

5.抗原特异性干扰素-γ(IFN-γ)细胞免疫应答相对于基线的变化[时间范围：基线直至第28周]如果疫苗接种后的产生IFN-γ的细胞(斑点)数量比第0天的斑点数高

2.0SD且高于测定LOD，则认为受试者具有阳性细胞应答。

INO-4800的安全性根据2007年9月发布的《参加预防性疫苗临床试验的健康成人和青少年志愿者毒性分级量表》(Toxicity Grading Scale for Healthy Adult andAdolescent Volunteers Enrolled in Preventive Vaccine Clinical Trials)(附录A)进行测量和分级。特别关注的不良事件(AESI)(严重或非严重)是产品或计划特有的科学和医学问题之一。AESI包括表4中列出的那些。

表4.

剂量限制毒性(DLT)

出于本临床试验的目的，下列为剂量限制性毒性：

·在INO-4800施用之后≥1天，观察到3级或以上局部注射部位红斑、肿胀和/或硬结(见表5)；

·尽管正确使用非麻醉性镇痛药，但注射部位仍出现疼痛或压痛，需要住院治疗；

·由PI评定的与INO-4800施用相关的4级或以上非注射部位不良事件；

·由PI评定的与INO-4800施用相关的4级或以上临床显著的实验室异常。

表5.注射部位反应分级量表

2007年9月《FDA关于参加预防性疫苗临床试验的健康成人和青少年志愿者的行业毒性分级量表的指南》

a

b

分析群体

分析群体为：

·改进的意向治疗(mITT)群体包括接受INO-4800的至少一个剂量的所有受试者。该样品中的受试者按其分配的INO-4800剂量组进行分析。mITT群体用于分析共同主要和探索性免疫学端点。

·符合方案(PP)群体由mITT受试者组成，他们接受所有计划的施用并且没有由医学监察员评定的重要方案违规行为。对PP群体的分析被认为支持对应的mITT分析。

安全性分析群体包括接受通过ID注射接受INO 4800的至少一个剂量的所有受试者。该群体的受试者根据他们接受的INO-4800剂量进行分组。该群体用于研究中的所有安全性分析。

主要安全性分析

本试验的主要分析是治疗突发不良事件(TEAE)的安全性分析、施用位点反应和安全性实验室参数相对于基线的临床显著变化。

本试验将TEAE定义为在IP施用后第0天或之后发生的任何不良事件、特别关注的不良事件或严重不良事件。所有TEAE均按频率、百分比和相关联的95％Clopper-Pearson置信区间进行总结。频率按剂量数单独呈现，并按系统顺序类别和首选术语进行描述。根据最大严重程度和与IP的关系来呈现另外的频率。根据严重程度和与IP的关系，遵循最差情况方法，多次发生的相同AE仅计数一次。所有严重TEAE均总结如上。AE持续时间计算为AE停止日期-AE开始日期+1天。将不是TEAE或严重TEAE的AE和SAE呈现在列表中。

所有这些主要安全性分析均对安全性群体中的受试者执行。

主要免疫原性分析

按照年龄层内的研究组，分析了SARS-CoV-2刺突糖蛋白抗原特异性结合抗体滴度和特异性细胞免疫应答。使用几何平均值和相关联的95％置信区间分析每个研究组的结合抗体滴度。使用中位数、四分位数范围和95％置信区间来分析每个研究组的抗原特异性细胞免疫应答的增加。使用几何平均倍数上升和95％置信区间来分析结合抗体滴度和抗原特异性细胞应答两者的增加相对于基线的变化。使用几何平均比率和相关联的95％置信区间来分析年龄层内每个研究组对之间的结合抗体滴度。使用中值差异和相关联的95％置信区间来分析年龄层内每个研究组对之间的抗原特异性细胞免疫应答。所有这些主要免疫原性分析均对mITT和PP群体中的受试者执行。

探索性分析

将会使用平均值/中位数和相关联的95％置信区间按照研究组对T和B基线后细胞数进行描述性分析。将使用中位数、四分位数范围和95％置信区间来分析每个研究组的中和抗体百分比。

如下所述，将在既往两剂量方案后分析INO-4800的任选加强剂量的安全性和免疫原性。将使用几何平均值和相关联的95％置信区间来对年龄层内每个研究组的活中和倒数抗体滴度和假中和倒数抗体滴度进行分析。将针对每个免疫原性生物标志物从基线上升的倍数制成表格。如果有足够的数据用于分析，将在选择仅2次施用的受试者与选择2次施用加上加强施用的受试者之间进行探索性组间免疫原性比较。

进一步探索年龄和其他潜在混杂因素对于免疫生物标志物与INO-4800剂量之间关系的效应可能涉及使用ANCOVA和/或Logistic回归模型。

初步基础研究结果

报告的所有8起不良事件均为1级；5起是由于局部注射部位反应。没有报告严重不良事件、特别关注的不良事件或剂量限制性毒性。

初步结合ELISA分析表明7/9(78％)的受试者有阳性抗体应答。应答者的滴度增加了四倍。

在第六周，在两个剂量之后，对1.0mg和2.0mg剂量队列两者执行多项免疫学测定，包括那些针对体液和细胞免疫应答的测定。当时的分析显示，基于评定体液(结合和中和)和T细胞免疫应答的初步数据，94％(36名试验参与者中的34名)表现出总体免疫应答率。1mg剂量队列中的一名参与者和2mg剂量队列中的两名参与者被排除在免疫分析之外，因为他们在进入研究时测试出COVID-19免疫应答呈阳性，指示既往感染。2mg剂量队列的一名参与者因与安全性或耐受性无关的原因终止研究。

到第八周，INO-4800在两个队列的所有参与者中总体上都是安全且耐受性良好的。所有十起报告的不良事件(AE)的严重程度均为1级，其中大多数是注射部位发红。没有报告严重不良事件(SAE)。

初始I期结果

研究群体人口统计数据

总计筛选了55名参与者，并且40名参与者入组初始两个组(图16)。中位年龄为34.5岁(范围18至50岁)。参与者中55％为男性(表6)。大多数参与者是白人(82.5％)。

表6

疫苗以0.1ml皮内注射方式施用，然后在疫苗接种部位进行EP。使用

疫苗安全性和耐受性

39名(97.5％)完成两个剂量，并且2.0mg组中的1名受试者在接受第二个剂量之前因缺乏前往临床地点的交通而终止试验参与，这与研究或给药无关。其余39名受试者全部在剂量1后8周完成访视。截至剂量1后8周，总计报告11起局部和全身性AE，其中六起被认为与疫苗相关。所有AE均为轻度或严重程度为1级。最常见的AE为注射部位反应，包括注射部位疼痛(3)和红斑(2)。与疫苗相关的一种全身性AE为恶心。没有发热反应。没有受试者因AE而终止试验。既未报告严重不良事件(SAE)也未报告AESI。在初始8周随访期间，没有出现临床关注的异常实验室值。与1.0mg组(受试者的15％)中相比，2.0mg组(受试者的10％)中经历与疫苗相关的AE的参与者数量没有增加。此外，在两个剂量水平组中，与第一剂量相比，使用第二剂量的AE频率没有增加。因此，INO-4800 1期安全数据表明，该疫苗可能是一种安全的加强疫苗，因为与第一剂量相比，在第二疫苗施用之后副作用的频率没有增加。

免疫原性：免疫原性分析包括三十八名受试者。除了2.0mg组中的一名受试者在完成给药前终止外，1.0mg组中的一名受试者在基线时被认为是血清反应阳性并被排除在外。

体液免疫应答：使用血清样品来测量针对SARS-CoV-2/澳大利亚/VIC01/2020分离株的中和抗体滴度以及与RBD和全刺突S1+S2蛋白的结合抗体。

S1+S2酶联免疫吸附测定(ELISA)：使用标准结合ELISA来检测血清结合抗SARS-CoV-2刺突抗体。ELISA板用重组S1+S2 SARS-CoV-2刺突蛋白(Sino Biological)包被，孵育过夜并阻断。将样品连续稀释并在阻断的测定板上孵育一小时。测定应答的幅度以滴度表示，滴度定义为光密度高于第0天背景3SD时的最大连续稀释度。与接种前时间点(第0天)相比，1.0mg组中68％的参与者和2.0mg组中70％的参与者的S1+S2刺突蛋白血清IgG结合滴度至少有所增加，其中1.0mg组和2.0mg组的应答者GMT分别为320.0(95％ CI：160.5，638.1)和508.0(95％ CI：243.6，1059.4)(图17C)。在图17D中，针对结合整个刺突蛋白(S1和S2)的能力(n＝19，1.0mg；n＝19，2.0mg)，评定1.0mg剂量组和2.0mg剂量组中的体液应答。端点滴度计算为表现出高于基线的OD 3.0SD的滴度，基线滴度设置为1。对活病毒中和的应答是PRNT IC50≥10。在所有图中，水平线表示中值，并且条表示四分位距。

还在SARS-CoV-2野生型病毒中和测定中测试了血清中和活病毒的能力。SARS-CoV-2/澳大利亚/VIC01/2020分离物中和测定在英国公共卫生部(Porton Down,UK)进行。在已经在56℃热灭活30分钟的血清样品中测量中和病毒滴度。将SARS-CoV-2(澳大利亚/VIC01/2020分离株44)稀释至浓度为933pfu ml-1，并以50:50的比率与含有1％ FCS/MEM的具有加倍血清稀释倍数的25mM HEPES缓冲液混合。在37℃下在加湿箱中进行5天温育之后，将板固定、染色并对噬菌斑进行计数。使用标准50％组织培养感染剂量(TCID50)测定确定病毒滴度。在第6周第二次疫苗接种之后，1.0mg组和2.0mg组中活病毒PRNT IC50中和测定的应答者几何平均滴度(GMT)分别为82.4和63.5。1.0mg组和2.0mg组的应答者百分比(疫苗接种后PRNT IC50≥10)分别为83％和84％(图17A和表7)。

*排除一名基线NP ELISA呈阳性的受试者

**第6周PRNT IC

RBD酶联免疫吸附测定(ELISA)：将MaxiSorp 96孔板(ThermoFisher，439454)用50ul/孔的1ug/ml SARS-CoV-2RBD(SinoBiological，40592-V08H)、稀释在PBS中的蛋白质包被，并且在4℃孵育过夜。用PBST(具有0.05％ Tween-20的PBS)洗涤板4次，并用200ul/孔的阻断缓冲液(具有5％脱脂奶粉和0.1％ Tween-20的PBS)在室温阻断2小时。在用PBST洗涤之后，将50ul/孔的在封闭缓冲液中连续稀释的血清样品一式两份添加到板中，并在室温孵育2小时。在用PBST洗涤之后，添加50ul/孔的用阻断缓冲液稀释500倍的抗人IgG-HRP检测抗体(BD Pharmingen，555788)，并在室温孵育1小时。在用PBST洗涤之后，添加50ul/孔的1-Step Ultra TMB(Thermo，34028)，并在室温孵育5分钟。添加50ul/孔的2M硫酸以终止颜色变化反应，并在Synergy 2酶标仪(Biotek)上测量在450和570nm处的吸光度。端点滴度定义为OD450-570值比匹配的第0天信号高出3个标准差时的最大连续稀释度。在第6周，1.0mg组和2.0mg组的应答者GMT分别为385.6(95％ CI：69.0，2154.9)和222.1(95％ CI：87.0，566.8)(图17B)。

在2个疫苗剂量之后，1.0mg和2.0mg剂量组中的总体血清转化(定义为对S蛋白或RBD产生中和或结合抗体的参与者)分别为89％和95％。

细胞应答：从血液样品分离外周血单核细胞(PBMC)，冷冻并储存在液氮中以供后续分析。

INO-4800SARS-CoV-2刺突ELISPOT。在疫苗接种前和疫苗接种后分离外周单核细胞(PBMC)。在体外用跨越全长共有刺突蛋白序列的15聚体肽(重叠9个残基)刺激细胞。将细胞与肽池(225μg/ml)、单独的DMSO(0.5％，阴性对照)或PMA和离子霉素(阳性对照)一起孵育过夜(18至22小时，37C，5％ CO2)。第二天，洗掉细胞，并对板进行显影。检测抗体被生物素化，然后是链霉亲和素-酶缀合物。通过使用具有沉淀物而非可溶性产品的底物，导致可见的斑点。每个点对应于单独的分泌细胞因子的细胞。在将板显影之后，使用带有ImmunoCapture

在第8周，1.0mg剂量组中的应答者百分比为74％，并且在2.0mg剂量组中为100％(表8)。对于1.0mg和2.0mg剂量组中的应答者，每10

表8.免疫应答

1.0mg队列排除一名基线ELISA滴度为1280的受试者

应答标准：中和：第6周PRNT IC

μ-使用第6周和第8周数据生成的应答者

INO-4800 SARS-CoV-2刺突流式细胞术测定：通过细胞内细胞因子染色(ICS)评定CD4+和CD8+T细胞对于针对INO-4800的细胞免疫应答的贡献。PBMC还用于使用流式细胞术进行细胞内细胞因子染色(ICS)分析。将200 uL完全RPMI培养基中的一百万个PBMC用DMSO(阴性对照)、PMA和离子霉素(阳性对照，分别为100 ng/mL和2μg/mL)或用指示的肽池(225μg/mL)刺激六小时(37℃，5％CO

表9：流式细胞术组

在2.0mg剂量组中，产生IFN-γ、TNF-α和/或IL-2(任何应答)的CD8+T细胞在疫苗接种后统计上显著地增加(图18C，P＝0.0181，Wilcoxon配对符号秩检验，事后分析)。在2.0mg剂量组中，产生TNF-α的CD4+T细胞也统计上显著地增加(图18C，P＝0.0020，Wilcoxon配对符号秩检验，事后分析)。

疫苗接种后，研究了CD4+和CD8+T细胞。在2.0mg剂量组中，近一半(47％)的CD8+T细胞双重产生IFN-γ和TNF-α(图18E)。在1.0mg剂量组中，产生细胞因子的CD8+T细胞主要是单功能IFN-γ产生细胞。CD4+T细胞区室为高度多功能的，其中6％和9％(分别在1.0mg和2.0mg剂量组)产生所有3种细胞因子：IFN-γ、TNF-α和IL-2。

还针对表面标志物CCR7和CD45RA来评定产生任何细胞因子(疫苗接种后的任何应答，IFN-γ或TNF-α或IL-2)的CD4+或CD8+T细胞的组成，以表征效应细胞(CCR7-CD45RA+)、效应记忆细胞(CCR7-CD45RA-)和中枢记忆细胞(CCR7+CD45RA-)(图18D)。在两个剂量组中，响应于用刺突肽进行的刺激而产生细胞因子的CD8+T细胞跨三个群体是平衡的，而CD4+T细胞主要是中枢记忆表型(图18D)。

还通过评定IL-4产生来测量Th2应答，并且在疫苗接种后的任一组中均未观察到统计学上显著的增加(Wilcoxon配对符号秩检验，事后分析)(图18F)。

在这项1期试验中，IFN-γELISpot以及多参数流式细胞术两者表明，INO-4800疫苗接种导致了带有增加的Th1表型的有效的T细胞应答，如通过Th1型细胞因子IFN-γ、TNF-α和IL-2的增加的表达证明的(图18C)。对由INO-4800诱导的T细胞多功能性的评定表明存在表现出记忆状态的标志的SARS-CoV-2特异性CD4+和CD8+T细胞，表明持久的细胞应答已经建立(图18D)。重要的是，这是在最大限度地减少IL-4(一种典型的Th2细胞因子)的诱导的同时完成的(图18F)。

1期更新

这设计为一项1期、开放标签、多中心试验(COVID19-001；ClinicalTrials_gov标识符NCT04336410)，以评估经皮内(ID)、然后使用CELLECTRA 2000器械进行电穿孔来施用的INO-4800的安全性、耐受性和免疫原性。没有已知COVID-19病史的18至50岁健康参与者在2剂量方案中接受1.0mg或2.0mg剂量的INO-4800(第0周和第4周)。

DNA疫苗INO-4800。该疫苗是根据现行良好生产规范生产的。INO-4800含有表达SARS-CoV-2全长刺突糖蛋白的合成、优化序列的质粒pGX9501，该质粒按照先前所述在柠檬酸钠盐缓冲液中以10mg/ml的浓度进行优化。

端点。安全端点包括直至剂量1后8周的全身性和局部施用部位反应。免疫学端点包括在疫苗的2个剂量之后的抗原特异性结合抗体滴度、中和滴度和抗原特异性干扰素-γ(IFN-γ)细胞免疫应答。对于活病毒中和，应答者定义为第6周PRNT IC50>10，或>4(如果受试者在ELISA中是应答者)。对于S1+S2 ELISA，应答者定义为第6周值>1。对于ELISpot测定，应答者定义为，第6周或第8周值比第0周高出每10

研究程序。

四十名参与者入组两个组；1.0mg和2.0mg剂量组各有20名参与者在第0周和第4周接受其剂量。疫苗以0.1ml皮内注射方式在手臂中施用，然后在疫苗接种部位进行EP。1.0mg剂量组中的受试者在每次给药访视时接受一次注射。疫苗的第二剂量可以注射到与第一剂量相同的手臂或不同的手臂中。2.0mg剂量组中的受试者在每次给药访视时每只手臂接受一次注射。如前所述，使用

方案资格。符合资格的参与者必须符合下列标准：年龄在18岁与50岁之间的健康成年人；能够并愿意遵守所有研究程序；在筛选时体重指数为18-30kg/m

临床试验群体：

年龄在18至50岁(含)之间的健康成年志愿者。

纳入标准：

a.年龄在18至50岁(含)的成年人；

b.由研究者基于在筛选时的病史、体格检查和生命体征判断为健康；

c.能够并愿意遵守所有研究程序；

d.筛选处于正常范围内或研究者认为并非临床显著的实验室结果；

e.对于乙型肝炎表面抗原(HBsAg)、丙型肝炎抗体和人类免疫缺陷病毒(HIV)抗体筛选，血清学测试呈阴性；

f.筛选研究者认为没有临床显著发现的心电图(ECG)(例如沃尔夫-帕金森-怀特综合征)；

g.使用医学上有效的避孕措施(如果从筛选到最后一个剂量后3个月一致且正确地使用，则每年的失败率<1％)，处于绝经后，经手术绝育或伴侣绝育。

排除标准：

a.在从筛选访视开始直至最后一个剂量后3个月的试验预计持续时间内怀孕或哺乳，或打算怀孕或生育；

b.目前正在参与或在第0天前30天内参与过一项用研究性产品进行的研究；

c.先前暴露于SARS-CoV-2(由研究者自行决定进行实验室测试)或接受用于预防COVID-19、MERS或SARS的研究性疫苗产品；

d.目前患有下列疾病或有下列疾病史：

·呼吸系统疾病(例如，哮喘、慢性阻塞性肺病)；

·高血压，坐位收缩压>150mm Hg或舒张压>95mm Hg；

·筛选后5年内患有恶性肿瘤；

·心血管疾病(例如，心肌梗塞、充血性心力衰竭、心肌病或临床显著的心律失常)；

e.潜在疾病或治疗导致的免疫抑制，包括：

·原发性免疫缺陷；

·口服或肠胃外糖皮质激素的长期(≥7天)使用；

·当前或预期使用疾病缓解剂量的抗风湿药物和生物疾病缓解药物；

·实体器官或骨髓移植史；

·其他临床显著的免疫抑制既往病史或临床诊断的自身免疫性疾病。

f.考虑到三角肌和股四头肌前外侧肌肉，可用于ID注射和EP的可接受部位少于两个；

g.具有在研究者看来可能会混淆研究结果或因参与研究而对患者构成另外风险的任何体格检查结果和/或任何疾病史。

免疫原性评定方法

分析了在筛选时、第0周(剂量之前)以及在第6和8周收集的样品。通过将标准品覆盖在聚蔗糖泛影葡胺上，然后离心，从血液样品分离出外周血单核细胞(PBMC)。将分离的细胞冷冻在10％ DMSO和90％胎牛血清中。将冷冻的PBMC储存在液氮中以供后续分析。血清样品储存在-80℃，直至用于测量结合和中和抗体滴度。

SARS-CoV-2野生型病毒中和测定

SARS-CoV-2/澳大利亚/VIC01/2020分离物中和测定在英国公共卫生部(PortonDown,UK)进行。在已经在56℃热灭活30分钟的血清样品中测量中和病毒滴度。将SARS-CoV-2(澳大利亚/VIC01/2020分离株44)稀释至浓度为933pfu/ml，并以50:50的比率与含有1％FCS/MEM的具有加倍血清稀释倍数的25mM HEPES缓冲液混合。在37℃孵育1小时之后，将病毒-抗体混合物转移至Vero E6细胞(ECACC 85020206；PHE，UK)的汇合单层中。使病毒在培养箱中在37℃再吸附到细胞上一小时，并且用MEM/4％FBS/1.5％ CMC覆盖细胞单层。在37℃孵育5天之后，将板固定，用25％甲醇(v/v)中的0.2％结晶紫溶液(Sigma)染色。计数斑块。

S1+S2酶联免疫吸附测定(ELISA)

用2.0mg/mL重组SARS-CoV-2S1+S2刺突蛋白(Acro Biosystems；SPN-C52H8)包被ELISA板，并且在2℃至8℃孵育过夜。S1+S2含有全长刺突蛋白GenBank#QHD43416.1的氨基酸残基Val 16-Pro 1213。它含有两个突变以将蛋白稳定为三聚体融合前状态(R683A、R685A)，还含有C末端10xHis标签(SEQ ID NO：24)。然后用含有0.05％ Tween-20的PBS(Sigma；P3563)洗涤板并在室温阻断(起始阻断，Thermo Scientific；37,538)1至3小时。使用阻断缓冲液连续稀释样品，并一式两份地与制备好的对照一起添加到经洗涤和阻断的测定板中。将样品在经阻断的测定板上在室温孵育一小时。样品和对照孵育后，洗涤板，然后将阻断缓冲液中的抗人IgG HRP缀合物的1/1000制剂(BD Pharmingen；555,788)添加到每个孔中，并且在室温孵育1小时。洗涤板，然后添加TMB底物(KPL；5120-0077)并在室温孵育大约10分钟。接下来添加TMB终止溶液(KPL；5150-0021)，并在Synergy HTX微孔读板仪(BioTek)上在450nm和650nm处读板。测定应答的幅度以滴度表示，滴度定义为经板校正的光密度高于受试者的对应的第0天背景3SD时的最大稀释连续稀释度的最大倒数稀释系数。

SARS-CoV-2刺突ELISpot测定

疫苗接种前和接种后的外周单核细胞(PBMC)在体外用跨越全长共有刺突蛋白序列的15聚体肽(9个残基重叠)进行刺激。将细胞在培养箱中与浓度为5mg/ml的肽池在预包被的ELISpot板(Mab-Tech，人IFN-g ELISpot Plus)中一起孵育过夜。次日，洗掉细胞，并通过生物素化的抗IFN-g检测抗体，然后通过链霉亲和素-酶缀合物对板进行显影，从而产生可见的斑点。每个点对应于单独的分泌细胞因子的细胞。将板显影之后，使用带有Immuno-Capture和ImmunoSpot软件的CTL S6微量分析仪(CTL)对斑点进行扫描和定量。值显示为所测量的三次重复在减去背景后的平均值。ELISpot测定先决条件确定，12个斑点形成单位为检测下限。因此，任何高于该截止值者都被视为是抗原特异性细胞应答的信号。

INO-4800SARS-CoV-2刺突流式细胞术测定

PBMC还用于使用流式细胞术进行细胞内细胞因子染色(ICS)分析。将200mL完全RPMI培养基中的一百万个PBMC用DMSO(阴性对照)、PMA和离子霉素(阳性对照，分别为100ng/mL和2mg/mL)或用指示的肽池(225μg/mL)刺激六小时(37℃，5％ CO

统计分析

没有正式的功效分析适用于该试验。使用描述性统计来总结安全性端点：具有AE的比例、施用部位反应和8周内的AESI。还使用描述性统计来总结免疫原性端点：对于细胞结果，中位应答(95％置信区间)和应答者百分比；以及对于体液结果，几何平均滴度(95％置信区间)和应答者百分比。对SARS-CoV-2中和应答(在自然对数尺度上，使用配对t检验)、ELISpot应答(使用Wilcoxon符号秩检验)和细胞内流式测定应答(使用Wilcoxon符号秩检验)中的疫苗接种后减去疫苗接种前配对差异进行了事后分析。

结果

研究群体人口统计数据

总计筛选了55名参与者，并且40名参与者入组初始两个组(图16)。中位年龄为34.5岁(范围18至50岁)。参与者中55％(22/40)为男性(表6)。大多数参与者为白人(82.5％，33/40)。

疫苗安全性和耐受性

40名参与者中总计39名(97.5％)完成两个剂量；2.0mg组中的一名参与者在接受第二剂量之前由于缺乏前往临床地点的交通而终止试验参与，并且终止与研究或给药无关(图16)。其余39名受试者全部在剂量1后8周完成访视。截至剂量1后8周，总计报告11起局部和全身性不良事件(AE)，其中六起被认为与疫苗相关(表10)。所有AE的严重程度均为1级(轻度)。六起相关的AE中的五起为注射部位反应，包括注射部位疼痛(3)和红斑(2)。与疫苗相关的一种1级全身性AE为恶心。所有相关的AE均在受试者接受第一次或第二次疫苗接种的给药日发生。疫苗接种后未出现发热反应，也未使用退热药。没有受试者因AE而终止试验。既未报告严重不良事件(SAE)也未报告特别关注的不良事件(AESI)。在初始8周随访期间，没有出现研究人员认为临床显著的异常实验室值。与1.0mg组(15％，3/20)中相比，2.0mg组(10％，2/20)中经历与疫苗相关的AE的参与者数量没有增加(图19A和19B)。此外，在两个剂量组中，与第一剂量相比，使用第二剂量的AE频率没有增加。

表10.按

免疫原性

免疫原性分析中包括三十八名受试者。除了2.0 mg组中的一名受试者在完成给药前终止外，1.0 mg组中的一名受试者在基线时被认为是血清反应阳性并被排除在外。该受试者的数据可在表11中找到。

表11.入组时血清阳性的受试者的免疫应答，INO-4800 1.0mg剂量组

体液免疫应答

测试了血清结合S1+S2刺突蛋白的能力。与接种前时间点(第0周)相比，1.0mg组中89％(17/19)的参与者和2.0mg组中95％(18/19)的参与者的S1+S2刺突蛋白血清IgG结合滴度有所增加，其中1.0mg组和2.0mg组的应答者GMT分别为655.5(95％CI：255.6，1681.0)和994.2(95％CI：395.3，2500.3)(图17B、图20和表13)。还通过活病毒PRNTIC50中和测定测试了血清中和活病毒的能力。在1.0mg组和2.0mg组中，在第6周，相对于基线的几何平均倍数上升分别为10.8(95％CI为(4.4,27.0))和11.5(95％CI为(5.3,24.9))。在每组中，在第6周有相对于基线统计学上显著的增加(P<0.0001，配对t检验，事后分析)，图17A。在第6周，1.0mg和2.0mg组中应答者的百分比分别为78％(14/18)和84％(16/19)(图17A和表13)，并且1.0mg组和2.0mg组中的应答者几何平均滴度(GMT)分别为102.3(95％CI：37.4，280.3)和63.5(95％CI：39.6，101.8)。在第6周，在1.0mg和2.0mg剂量组中，每组的总体血清转化(定义为对S蛋白作出中和和/或结合抗体应答的参与者)为95％(18/19)(表13)。

酶联免疫斑点(ELISpot)

在第8周，1.0mg剂量组中的应答者百分比为74％(14/19)，并且在2.0mg剂量组中为100％(19/19)。这些数据与血清转化数据一起得出每组的总体免疫应答为100％(19/19)(表13、图18A和21)。对于1.0mg和2.0mg剂量组的应答者，每10

细胞内流式测定

通过细胞内细胞因子染色(ICS)评定CD4+和CD8+T细胞对于针对INO-4800的细胞免疫应答的贡献。在2.0mg剂量组中，产生IFN-γ、TNF-α和/或IL-2(任何应答)的CD8+T细胞从基线到第6周的中位变化为0.11，其中95％ CI为(-0.02,0.23)；变化显著增加(P＝0.0181，Wilcoxon配对签名秩检验，事后分析)，主要是由于IFN-γ和TNF-α产量显著增加(图18C)。还是在2.0mg剂量组中，产生TNF-α的CD4+T细胞从基线到第6周的中位变化为0.02，其中95％ CI为(0.01至0.09)；变化也显著增加(P＝0.0020，Wilcoxon配对符号秩检验，事后分析，图18C)。还针对表面标志物CCR7和CD45RA来评定产生任何细胞因子(IFN-γ或TNF-α或IL-2)的CD4+或CD8+T细胞的组成，以表征效应细胞(CCR7-CD45RA+)、效应记忆细胞(CCR7-CD45RA-)和中枢记忆细胞(CCR7+CD45RA-)(图18D)。在两个剂量组中，应答用SARS-CoV-2刺突肽进行的刺激而产生细胞因子的CD8+T细胞跨三个群体通常是平衡的，而CD4+T细胞主要是中枢记忆表型(图18D)。进一步研究了疫苗接种后的CD4+和CD8+T细胞一次产生超过一种细胞因子的能力，并且令人鼓舞地注意到，在2.0mg剂量组中，近一半(41％)的CD8+T细胞可双重产生IFN-γ和TNF-α(图18E)。在1.0mg剂量组中，产生细胞因子的CD8+T细胞主要是单功能IFN-γ产生细胞(57％)。CD4+T细胞区室本质上也是多功能的，其中在1.0mg和2.0mg剂量组中，分别有6％和9％产生所有3种细胞因子：IFN-γ、TNF-α和IL-2(表12)。还通过评定IL-4产生来测量Th2应答，并且在疫苗接种后的任一组中均未观察到统计学上显著的增加(Wilcoxon配对符号秩检验，事后分析)(图18F)。

INO-4800的耐受性良好，在1.0mg和2.0mg剂量组中，参与者的与产品相关的1级AE发生频率分别为15％(3/20名受试者)和10％(2/20名受试者)。研究中注意到仅有1级AE，这与现有许可的疫苗相比毫不逊色。成功的COVID-19疫苗的安全性非常重要，并且支持INO-4800在SARS-CoV-2感染并发症风险更严重的处于风险群体(包括老年人和患有合并症的群体)中的广泛开发。INO-4800还产生了平衡的体液和细胞免疫应答，所有38名可评估的参与者在INO-4800的两个剂量后均表现出抗体或T细胞应答中的任一者或两者。在每个剂量组中，在95％(18/19)的参与者中观察到通过结合或中和抗体测量的体液应答。通过活病毒中和测定测量，对于1.0mg和2.0mg剂量组，分别在78％(14/18)和84％(16/19)的参与者中见到中和抗体，并且对应的GMT为102.3[95％ CI(37.4,280.3)]和63.5[95％ CI(39.6,101.8)]。该范围与恢复期患者报告的PRNT IC50滴度以及在SARS-CoV-2攻击中受到保护的NHP中的PRNT IC50滴度重叠。此外，滴度有统计学显著的增加。值得注意的是，除了一名未发展出中和抗体滴度的疫苗接受者外，所有疫苗接受者在T细胞ELISpot测定中均呈阳性应答，表明由疫苗产生的免疫应答在这些测定中有所不同。分别在1.0mg和2.0mg剂量组的74％(14/19)和100％(19/19)中观察到细胞免疫应答。重要的是，INO-4800产生的T细胞应答更频繁并且应答者中位应答也更高(在1.0mg和2.0mg剂量组中分别为46[95％ CI(21.1,142.2)]与71[95％ CI(32.2,194.4)]SFU 10

在这项1期试验中，IFN-γELISpot以及多参数流式细胞术两者表明，INO-4800疫苗接种导致了带有增加的Th1表型的实质性T细胞应答，如通过Th1型细胞因子IFN-γ、TNF-α和IL-2的增加的表达测量的(图18C)。对由INO-4800诱导的细胞应答的评定显示存在表现出分化为中枢和效应记忆细胞的标志的SARS-CoV-2特异性CD4+和CD8+T细胞，表明持久的细胞应答已经建立(图18D)。重要的是，这是在最大限度地减少IL-4(一种典型的Th2细胞因子)的诱导的同时完成的(图18F)，支持该疫苗具有免疫表型并且伴随在临床前模型中诱导保护，这使得它不太可能成为诱导疾病增强的风险因素。

表12.流式细胞术多功能性

列出的百分比为每个输出对总细胞因子应答的贡献

表13.

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1.0mg队列排除一名基线NP ELISA呈阳性的受试者

应答标准：或中和：第6周PRNT IC

μ

扩展I期研究

跨三(3)个剂量水平(研究组)对120名健康志愿者进行评估。每个研究组入组总计40名受试者。每个研究组的入组按年龄分层；对于18-50岁，n＝20；对于51-64岁，n＝10；以及，对于≥65岁，n＝10(表14)。

受试者为年龄至少为18岁的成年人；由研究者基于在筛选时进行的病史、体格检查和生命体征判断为健康；能够并愿意遵守所有研究程序；筛选处于测试实验室正常范围内或研究者认为并非临床显著的实验室结果；在筛选时体重指数为18-30 kg/m

所有受试者均在第0天和第4周接受给药(表15)。同意接受加强剂量(表16)的受试者在不早于其给药时间表中的第12周接受加强剂量，其剂量与先前在其两剂量方案(第0天和第4周)中接受的剂量相同。加强剂量后2周，评估安全性和免疫原性。

表14：

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a

b

未接受任选加强剂量的受试者将随访至在第52周的研究结束(EOS)访视(表15)。对于接受任选加强剂量的受试者，加强剂量后48周访视将是EOS访视(表16)。

主要目标：

·评估INO-4800在健康成年志愿者中通过ID注射然后通过EP施用的耐受性和安全性

·评估对通过ID注射然后通过EP施用的INO-4800的细胞免疫应答和体液免疫应答主要安全性端点：

·按系统器官类别(SOC)、首选术语(PT)、严重程度和与研究性产品的关系划分的不良事件发生率。有不良事件(AE)的参与者的百分比[时间范围：基线直至第52周(如果未接受任选的加强剂量)或加强剂量后48周访视(如果接受任选的加强剂量)]。

·施用(即，注射)位点反应(按频率和严重程度描述)。有施用(注射)部位反应的参与者的百分比[时间范围：第0天直至第52周(如果未接受任选的加强剂量)或加强剂量后48周访视(如果接受任选的加强剂量)]。

·特别关注的不良事件的发生率。有特别关注的不良事件(AESI)的参与者的百分比。[时间范围：基线直至第52周(如果未接受任选的加强剂量)或加强剂量后48周访视(如果接受任选的加强剂量)]。

主要免疫原性端点：

·按照结合测定的SARS-CoV-2刺突糖蛋白抗原特异性抗体。SARS-CoV-2刺突糖蛋白抗原特异性结合抗体滴度相对于基线的变化[时间范围：基线直至第52周(如果未接受任选的加强剂量)或加强剂量后48周访视(如果接受任选的加强剂量)]。

·通过IFN-γ、ELISpot和/或流式细胞术测定的抗原特异性细胞免疫应答。抗原特异性细胞免疫应答相对于基线的变化[时间范围：基线直至第52周(如果未接受任选的加强剂量)或加强剂量后48周访视(如果接受任选的加强剂量)]。

探索性目标：

·通过评定T和B细胞免疫应答两者来评估扩展的免疫学特征

·评估通过ID注射、然后在两剂量方案之后进行EP来施用的任选加强剂量的INO-4800的安全性和免疫原性

探索性终点：

·扩展的免疫学特征，可以包含(但不限于)对T和B细胞数量、中和应答以及T和B细胞分子变化的另外评定，通过在所有周测量如由样品可用性确定的所关注基因的免疫蛋白和mRNA水平

·通过ID注射、然后进行EP来施用的任选加强剂量的INO-4800之后所有不良事件的发生率

·通过ID注射、然后进行EP来施用的任选加强剂量的INO-4800之后，SARS-CoV-2刺突糖蛋白抗原特异性中和和结合抗体

·通过ID注射、然后进行EP来施用的任选加强剂量的INO-4800之后，通过IFN-γELISpot和/或流式细胞术测量的抗原特异性细胞免疫应答

安全性评估：

在试验持续期间至EOS或受试者最后一次访视期间，受试者将针对安全性而进行随访。不良事件将在每次访视时收集(包括第1天和加强剂量后36周的电话通话)。将根据事件时间表(表15和表16)抽取实验室血液和尿液样品。

表15-非加强剂临床试验事件时间表

表15(续)

a.筛选评定发生在第0天之前的-30天到-1天。

b.仅在筛选时和第52周(或任何其他研究中止访视)时进行全面体格检查。在所有其他访视时进行有针对性的体格检查。

c.包括Na、K、Cl、HCO3、Ca、PO4、葡萄糖、BUN、Cr、AST、ALT和TBili。

d.HIV抗体或快速测试、HBsAg、HCV抗体。

e.用于检测葡萄糖、蛋白质和血尿的试纸。如果试纸异常，应进行显微镜检查。

f.在筛查时进行血清妊娠测试。在其他访视时进行尿液妊娠测试。

g.所有剂量均经由皮内注射，然后进行EP来递送。

h.对于研究组1和组3，在第0天和第4周，优选在三角肌上进行一次皮肤注射。对于研究组2，进行两次皮肤注射，每次注射在不同的三角肌或股四头肌外侧；优选在第0天和第4周时在三角肌上进行。

i.施用INO-4800+EP后，将从

j.包括自同意之时起的AE以及符合AE条件的所有注射部位反应。

k.电话随访以收集AE。

l.每个时间点4x 8.5mL(34mL)全血置于10mL酸性柠檬酸葡萄糖(ACD，黄帽)管中。注意：在第1个剂量之前(筛选和第0天给药之前)收集总计68mL全血。

m.每个时间点1x 8mL血液置于10mL红帽血清收集管中。注意：在第1个剂量之前(筛选和第0天给药之前)的每个时间点收集血清的四个等分试样，每个1mL(总计4mL)。

表16-加强剂临床试验事件时间表

a.仅在加强剂量后48周访视(或任何其他研究中止访视)时进行全面体格检查。在所有其他访视时进行有针对性的体格检查。

b.包括Na、K、Cl、HCO

c.用于检测葡萄糖、蛋白质和血尿的试纸。如果试纸异常，应进行显微镜检查。

d.在接受加强剂量之前，尿妊娠测试必须呈阴性。

e.所有剂量均经由皮内注射，然后进行EP来递送。

f.对于研究组1和3，在加强剂量访视时，优选在三角肌(或替代性地，股四头肌外侧)上进行一次皮肤注射。对于研究组2，进行两次皮肤注射，每次注射在不同的三角肌或股四头肌外侧；优选加强量访视时在三角肌上进行。

g.施用INO-4800+EP后，将从

h.包括自同意之时起的AE以及符合AE条件的所有注射部位反应。

i.电话随访以收集AE。

j.每个时间点4x 8.5mL(34mL)全血置于10mL酸性柠檬酸葡萄糖(ACD，黄帽)管中。

k.每个时间点1x 8mL血液置于10mL红帽血清收集管中。

免疫原性评估：

将根据事件时间表(表15和表16)收集免疫学血液样品。

SARS-CoV-2假病毒中和测定：如上所述，使用假病毒中和测定来测量来自INO-4800疫苗接种者的血清样品。数据以ID50报告，它是与未添加血清样品的对照孔相比，导致对感染性的50％抑制的倒数血清稀释度。

SARS-CoV-2刺突酶联免疫吸附测定(ELISA)：如上所述，通过ELISA来测量与SARS-CoV-2刺突蛋白的结合抗体。SARS-CoV-2刺突抗体浓度通过具有20,000单位/mL指定浓度的SARS-CoV-2恢复期血浆稀释度曲线插值法确定。

SARS-CoV-2刺突ELISpot测定：如上所述，测量SARS-CoV-2刺突抗原特异性IFN-γT细胞应答。在使用仅DMSO的阴性对照孔进行背景减除后，将值报告为三个一式三份孔中每百万个PBMC的平均点形成单位。

INO-4800SARS-CoV-2刺突流式细胞术测定：

PBMC用于使用流式细胞术进行细胞内细胞因子染色(ICS)分析。将200mL完全RPMI培养基中的一百万个PBMC用DMSO(阴性对照)、PMA和离子霉素(阳性对照，分别为100ng/mL和2mg/mL)或用指示的肽池(225μg/mL)刺激六小时(37℃，5％ CO2)。在刺激一小时之后，添加布雷菲德菌素A和莫能菌素(BD GolgiStop和GolgiPlug，分别为0.001％和0.0015％)以阻断所表达的细胞因子的分泌。在刺激之后，将细胞移至4℃过夜。接下来，在PBS中洗涤细胞以进行活/死染色(Life Technologies活/死水可固定活力染料)，并且然后重新悬浮于FACS缓冲液(0.5％ BSA、2mM EDTA、20mM HEPES)中。接下来，针对细胞外标志物进行染色，对细胞进行固定和透化(eBioscience

还在裂解颗粒加载(LGL)测定中评定PBMC。LGL测定也在用重叠肽刺激全长刺突蛋白后按照之前的报道进行(Aggarwal等人Immune Therapy Targeting E6/E7 Oncogenesof Human Paillomavirus Type 6(HPV-6)Reduces or Eliminates the Need forSurgical Intervention in the Treatment of HPV-6Associated RecurrentRespiratory Papillomatosis.Vaccines(Basel)2020；8)，以测量CD8+T细胞活化(CD38、CD69、CD137、Ki67)和产生裂解蛋白(颗粒酶A和B、穿孔素和颗粒溶素)的能力。

统计分析。没有正式的功效分析适用于该试验。使用描述性统计数据来总结基于安全性群体的安全性端点：截至剂量2后6个月(未加强的参与者)或加强剂量后2周，有AE的参与者的比例。安全性群体包括接受INO-4800的至少一个剂量的所有参与者，并且按年龄和INO-4800的剂量分组。对SARS-CoV-2中和以及ELISA刺突应答(在自然对数尺度上，使用配对t检验)、ELISpot应答(使用Wilcoxon符号秩检验)和流式测定应答(使用Wilcoxon符号秩检验)中的疫苗接种后减去疫苗接种前配对差异进行了事后受试者内分析。

结果

大多数与INO-4800相关的不良事件(AE)的严重程度为轻度，并且发生频率不会随着年龄和后续给药而增加。在1期中，在1.0和2.0组中，分别有78％(14/18)和84％(16/19)的受试者产生中和抗体反应，其中几何平均滴度(GMT)分别为17.4(95％ CI 8.3,36.5)和62.3(95％ CI 36.4,106.7)。截至第8周，通过与Th1相关联的IFNγELISPOT测定，74％(14/19)和100％(19/19)的受试者产生了T细胞应答。加强剂量后，在1.0mg和2.0mg组中，中和GMT分别升至82.2(95％ CI 38.2,176.9)和124.7(95％ CI 62.8,247.7)，证明了INO-4800的加强能力。

表17在I期中，按剂量组的假病毒中和

表18在1期中，按剂量组(接受加强剂量的所有受试者)的假病毒中和

免疫原性评估：在分离之后，将PBMC储存在液氮冷冻机的气相中直至分析，而血清样品在-80℃储存。八名参与者因血清阳性应答(如通过对于SARS-CoV-2核蛋白的阳性ELISA滴度确定的，指示存在SARS-CoV-2感染)而被排除在免疫原性分析之外。

试验群体人口统计数据

筛选了154名参与者，并且120名参与者入组试验(图44)。中位年龄为50.5岁(范围18至86岁)。参与者中的57.5％为女性(69/120)，而42.5％为男性(51/120)(图45)。大多数参与者为白人(94.2％，113/120)。

疫苗安全性和耐受性

120名参与者中总计117名(97.5％)接受了两个剂量。2.0mg组中的一名参与者在接受第二剂量之前终止试验参与，仅仅是因为缺乏前往临床地点的交通。由于已经在剂量1后确定了排除资格标准(高血压)，0.5mg组中的两名参与者没有接受第二剂量(图44)。

大约在第二剂量后约6至10.5个月，120名参与者中的九十九名(82.5％)同意并接受了加强剂量。

由18名参与者报告了总计34起与治疗相关的局部和全身性AE。31起AE的严重程度为1级(轻度)，并且主要包括注射部位反应。据报告，三起与治疗相关的2级(中度)AE为嗜睡、腹痛和注射部位瘙痒。没有报告发热反应。没有参与者因AE而终止。没有报告与治疗相关的SAE。没有被认为与治疗相关且临床显著的异常实验室值。与1.0mg组(15％，6/40)或0.5mg组(17.5％，7/40)中相比，2.0mg组(12.5％，5/40)中经历与疫苗相关的AE的参与者数量没有增加。此外，当与第一剂量相比时，使用第二剂量或加强剂量的AE频率没有明显增加(图46)。当与较年轻年龄组相比时，观察到较年老年龄组和老年组中治疗相关AE的频率的减少(图47A至47C)。

INO-4800诱导能够被增强的持久的体液免疫应答。从试验参与者的血清测量了用INO-4800进行疫苗接种后产生的针对SARS-CoV-2的抗体。使用假病毒中和测定来评定抗体的功能能力。所有三个剂量组均诱导中和抗体，该中和抗体在第二剂量后两周达到峰值(0.5mg、1.0mg和2.0mg剂量组中的GMT分别为14.9、19.1、54.1)(图48，左图；图49)。对于截至研究第28周(在剂量2之后大约6个月)的每个时间点，2.0mg剂量组中的这些增加的应答与基线相比均具有统计学显著性(图48、49)。施用加强剂量后，在所有剂量组中均观察到相对于加强前滴度的统计学显著增加(0.5mg、1.0mg和2.0mg剂量组中的GMT分别为58.7、76.1、100；全部P<0.001)(图48，右图；图49)。相对于加强前滴度，2.0mg剂量组具有12.8(95％ CI 6.3,26.0)的几何倍数上升(GMFR)，是所有剂量组中最高的。按参与者年龄划分的中和滴度如图50A所示；较年老年龄组中的GMT在数值上较低，但在2.0mg剂量组中，在第6周的GMT统计学显著地高于基线。

在结合ELISA中测量针对刺突三聚体蛋白的抗体。所有三个剂量组均诱导结合抗体，该中和抗体在剂量2后四周达到峰值(0.5mg、1.0mg和2.0mg剂量组中的GMT分别为428.5、595.9、678.0)(图48B，左图；图51)。在接受2.0mg剂量的所有参与者中均观察到相对于基线的增加，并且在剂量2后6个月的GMT统计学显著地高于基线(0.5mg、1.0mg和2.0mg剂量组中的GMT分别为250.1、215.3、407.2；全部P<0.026)。施用加强剂量后，在所有剂量组中均观察到相对于加强前滴度的统计学显著增加(0.5mg、1.0mg和2.0mg剂量组中的GMT分别为1963.8、3685、5953；全部为P<0.007)(图48B，右图；图51)。相对于加强前滴度，2.0mg剂量组具有20.8(95％ CI 13.9,31.2)的GMFR，这是所有剂量组中最高的。按参与者年龄划分的ELISA结合滴度显示于图50B中。

INO-4800诱导能够被增强的细胞免疫应答。

对PBMC进行干扰素-γ(IFNγ)酶联免疫斑点(ELISpot)。每百万个PBMC的点形成单位(SFU)相对于基线的增加显示于图52A左图中。对于0.5mg和2.0mg剂量组，IFNγ的幅度在第6周达到峰值(中位数分别为19.4和43.3)；对于1.0mg剂量组，IFNγ的幅度在第8周达到峰值(中位数为17.8)。剂量2后六个月，2.0mg剂量组中的幅度保持在高位(中位数为19.6)。值得注意的是，1.0mg和2.0mg剂量组中的幅度在加强剂量后统计学显著地增加(分别为P＝0.018和P＝0.008)(图52A，右图)。2.0mg剂量组在加强后的中位数差异为10，导致任何剂量组的最高加强后增加。按参与者年龄划分的ELISpot应答显示在图53A中。

INO-4800诱导产生细胞因子的T细胞和具有裂解潜力的活化CD8+T细胞。

对2个剂量后的参与者进行了对T细胞应答的进一步探索。通过细胞内细胞因子染色(ICS)评定SARS-CoV-2特异性CD4+和CD8+T细胞的贡献，图52B、52C。在INO-4800的所有三个剂量组中，疫苗接种后，产生IFNγ的CD4+T细胞的中位频率均增加，并且在2.0mg剂量组中，产生TNFα的CD4+T细胞的频率统计学显著地增加(P<0.001)(图52B)。在INO-4800的所有三个剂量组中，接种疫苗后，产生TNFα的CD8+T细胞的频率统计学显著地增加(全部P<0.041)(图52C)。对于产生任何应答、IFNγ和TNFα的CD8+T细胞，2.0mg剂量组的中位数差异最大(分别为0.066、0.026和0.011)。按参与者年龄划分的ICS应答显示在图53B、53C中。

还通过裂解颗粒负载流式细胞术测定，对3个剂量后具有剩余样品的参与者子集的SARS-CoV-2特异性CD8+T细胞进行表征，该测定包括T细胞受体活化诱导的标志物CD69和CD137。用2.0mg INO-4800免疫后，CD8+CD69+CD137+细胞的中值频率增加，其中中值差异为0.072(图54A，左图)。对这些活化细胞的进一步表征，包括用于溶细胞杀伤的蛋白质(颗粒酶A、颗粒酶B、穿孔素或颗粒溶素)的共表达，揭示了1.0mg(P＝0.008)和2.0mg(P＝0.003)剂量组两者中的统计学显著增加(图54A中图和右图)。2.0mg剂量组在共表达穿孔素以及颗粒酶A和B的CD69+CD137+群体中的中位数差异为0.085，在共表达颗粒溶素的群体中的中位数差异为0.054。还评定了表达活化标志物CD38和增殖标志物Ki67的CD8+T细胞(分别为图54B和54C)。在2.0mg INO-4800后，SARS-CoV-2特异性CD38+CD8+T细胞的频率统计显著增加(P＝0.016)，其中中位数差异为1.45(图54B，左图)。具有裂解潜力的CD38+CD8+T细胞(图54B中图和右图)在2.0mg INO-4800后统计学显著地增加(P<0.001)。用2.0mg INO-4800免疫后，表达颗粒酶A、B和穿孔素的活化CD8+T细胞的平均频率为1.7％，其中中位数差异为0.710，而表达颗粒溶素的活化CD8+T细胞的平均频率为1.8％，其中中位数差异为0.433(图54B，中图和右图)。在1.0mg剂量组中还观察到这些CTL表型的频率的统计学显著的增加(P<0.012)(图54B，中图和右图)。2.0mg剂量组的CD8+T细胞表达Ki67的频率最高，其中中位数差异为0.367，并且对于Ki67及细胞溶解蛋白，中位数差异为：0.296(GrzA+GrzB+Prf+)和0.230(Gnly+)。所有三个Ki67+群体在2.0mg剂量组中均统计学显著地增加(P<0.001；图54C)。与其他两个剂量组相比，2.0mg剂量组在所有评定的表型中始终显示出最高的中位应答。

结论。INO-4800在所有三个剂量水平下都表现出良好的耐受性，没有报告与治疗相关的严重不良事件。大多数不良事件的严重程度为轻度，并且发生频率不会随着年龄和后续给药而增加。

在当前试验中，跨所有三个剂量组均观察到体液和细胞应答两者的诱导，包括结合和中和抗体和产生细胞因子的T细胞，以及响应于SARS-CoV-2刺突抗原而表现出裂解潜力。使用2.0mg剂量的INO-4800进行免疫，在所有测试的年龄组中导致最高的中和和结合抗体的GMT以及最高幅度的对于任何剂量的SARS-CoV-2的IFNγ产生，并且直到剂量2后6个月，抗体水平与基线相比的增加是统计学显著的。重要的是，加强剂量后，体液和细胞免疫应答两者的增加是统计学显著的。

实例7 2/3期随机、盲法、安慰剂对照试验，旨在评估INO-4800的安全性、免疫原性和功效，INO-4800是一种针对COVID-19疾病的预防性疫苗，在处于SARS-CoV-2暴露的高风险的成人中皮内施用，然后进行电穿孔(EP)(COVID19-311；ClinicalTrials_gov标识符：NCT04642638；INNOVATE；WHO UTN：U1111-1266-9952)

这是一项2/3期、随机、安慰剂对照、多中心试验，旨在评估INO-4800的安全性、免疫原性和功效，INO-4800通过皮内(ID)注射、然后使用

表19.

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主要结果量度：

1.2期：通过干扰素-γ(IFN-γ)酶联免疫斑点(ELISpot)测定来测量抗原特异性细胞免疫应答相对于基线的变化

[时间范围：基线直至第393天]

2.2期：通过基于假病毒的中和测定来测量中和抗体反应相对于基线的变化[时间范围：基线直至第393天]

3.3期：经病毒学确诊患有COVID-19疾病的参与者(基线时SARS-CoV-2血清阴性)的百分比

[时间范围：从完成2剂量方案之后14天到剂量2后12个月(即第42天直至第393天)]次要结果度量：

1.2期和3期：有征集性和非征集性注射部位反应的参与者的百分比

[时间范围：从同意之时直至剂量2之后28天(最多56天)]

2.2期和3期：有征集性和非征集性全身性不良事件(AE)的参与者的百分比[时间范围：从同意之时直至剂量2之后28天(最多56天)]

3.2期和3期：有严重不良事件(SAE)的参与者的百分比[时间范围：基线直至第393天]

4.2期和3期：有特别关注的不良事件(AESI)的参与者的百分比[时间范围：基线直至第393天]

5.3期：因各种原因死亡的参与者的百分比[时间范围：基线直至第393天]

6.3期：患有非严重COVID-19疾病的参与者(基线时SARS-CoV-2血清阴性)的百分比[时间范围：从完成2剂量方案之后14天到剂量2后12个月(即第42天直至第393天)]

7.3期：患有严重COVID-19疾病的参与者(基线时SARS-CoV-2血清阴性)的百分比[时间范围：从完成2剂量方案之后14天到剂量2后12个月(即第42天直至第393天)]

8.3期：死于COVID-19疾病的参与者(基线时SARS-CoV-2血清阴性)的百分比[时间范围：从完成2剂量方案之后14天到剂量2后12个月(即第42天直至第393天)]

9.3期：患有经病毒性确认的COVID-19疾病的参与者(基线时SARS-CoV-2血清阳性)的百分比[时间范围：从完成2剂量方案之后14天到剂量2后12个月(即第42天直至第393天)]

10.3期：通过IFN-γELISpot测定测量的抗原特异性细胞免疫应答相对于基线的变化[时间范围：基线直至第393天]

11.3期：通过基于假病毒的中和测定来测量中和抗体反应相对于基线的变化[时间范围：基线直至第393天]

资格标准

有资格参与研究的年龄：18岁及以上

有资格参与研究的性别：所有

基于性别：否

接受健康志愿者：是

关键入选标准：

·在具有暴露于SARS-CoV-2的高风险的环境中工作或居住，其暴露时间可能相对延长或可能不一致地使用个人防护装备(PPE)，尤其是在密闭环境中

·仅2期：筛选处于测试实验室的正常范围内或研究者认为并非临床显著的实验室结果。

·绝经后或经手术绝育或伴侣绝育或使用医学上有效的避孕措施(如果从筛选直至最后一个剂量后3个月(2期)或直至最后一个剂量(3期)一致且正确地使用，则每年失败率<1％)。

关键排除标准：

·急性发热性疾病，其中体温>100.4℉(38.0℃)或急性发作上呼吸道或下呼吸道症状(例如，咳嗽、气短、咽痛)。

·筛选时针对SARS-CoV-2的血清学或分子(逆转录聚合酶链反应[RT-PCR])测试呈阳性。(该标准适用于所有2期参与者，并且仅在将大约402名SARS-CoV-2血清学测试呈阳性的参与者随机分配在该研究的3期分段中之后才适用)。

·在从筛选访视开始直至最后一个剂量后3个月(2期)或直至最后一个剂量(3期)的预计试验持续时间内怀孕或母乳喂养或打算怀孕或打算生育。

·基于CD4计数低于200个细胞/立方毫米/mm^3)或过去3个月内可检测到的病毒载量，已知未控制HIV病史。

·目前正在参与或在第0天前30天内参与过一项用研究性产品进行的研究。

·先前或计划接受用于预防或治疗COVID-19、中东呼吸系统综合征(MERS)或严重急性呼吸系统综合征(SARS)的研究性疫苗(包括紧急使用授权(EUA)或当地同等授权)或许可疫苗(试验资格允许在先前试验中存档的接受安慰剂)。

·在入组之前的6周期间，因病情恶化而需要显著改变疗法或住院的呼吸系统疾病(例如，哮喘、慢性阻塞性肺病)。

·潜在疾病或治疗导致的免疫抑制

·缺乏可用于ID注射和EP的可接受部位

·第0天之前1个月内献血或输血。

·报告酗酒或者物质滥用或依赖，或使用非法药物(不包括吸食大麻)。

研究设计和参与者：

该临床试验被设计为一项2/3期、随机、安慰剂对照、多中心试验(NCT04642638；其他研究标识符：COVID19-311、INNOVATE)，旨在评估皮内(ID)注射、然后进行电穿孔(EP)来施用的INO-4800的安全性、免疫原性和有效性。2期分段旨在进一步评估2剂量方案中两种剂量的INO-4800(1.0mg和2.0mg)在SARS-CoV-2血清阴性成人中的安全性和免疫原性，以选择在3期分段中用于疗效评估的剂量。这里报告的发现适用于2期分段。临床试验方案得到了中央和特定地点机构审查委员会的批准。该研究是根据现行的良好临床实践执行的。所有参与者在入组前均提供了书面知情同意书。年龄为至少18岁且具有暴露于SARS-CoV-2的高风险的健康参与者如下所述随机分组。

2期分段的主要端点本质上是免疫学，并且包括通过IFN-γELISpot测定测量的抗原特异性细胞免疫应答和通过基于假病毒的中和测定测量的中和抗体应答。次要端点聚焦于安全性和耐受性，测量征集性和非征集性局部和全身性反应的发生率，包括严重不良事件(SAE)和特别关注的不良事件(AESI)。出于本实例的目的，在第6周(剂量2后2周)评定免疫学端点，并且在第8周评定安全性和耐受性端点。按照临床试验方案中的规定，在维持受试者水平盲法的同时，产生了免疫原性和安全性数据的组水平非盲法临时总结。对于截至最终访视尚未终止剩余访视的所有受试者，将继续收集长期随访数据。由于要维持受试者水平的盲法，因此并非所有不良事件都可以显示在治疗组汇总表中。

DNA疫苗INO-4800

该疫苗是根据现行良好生产规范生产的。INO-4800含有表达SARS-CoV-2刺突糖蛋白的合成全长序列的质粒pGX9501。安慰剂组接受等体积的盐水柠檬酸钠缓冲液。

ID施用INO-4800后，使用

研究程序

符合条件的参与者以3:3:1:1的比率随机分组以接受INO-4800的一次或两次1.0mg ID注射或安慰剂的一次或两次ID注射，然后进行EP，该注射在第0和28天施用。在三角肌或股四头肌外侧肌肉上以0.1mL体积施用该注射，然后使用

在筛选时、剂量1后第0天(剂量1)、7、28(剂量2)、35、42、56、210和392天针对安全性和耐受性对参与者进行评定。在2期分段中管理参与者日志以收集在给药当天以及每次剂量后6天的征集性局部和全身AE。无论与疫苗的关系如何，局部和全身性AE均由研究者评定、记录并分级。在筛选时、剂量1后第0、28、42和392天收集安全性实验室测试(全血细胞计数、综合代谢组和尿液分析)。AE根据不良事件通用术语标准(CTCAE)5.0版进行分级。注射部位反应按照美国食品和药物管理局在2007年9月发布的《参加预防性疫苗临床试验的健康成人和青少年志愿者毒性分级量表》指南对不良事件进行分级。独立的数据安全监测委员会(DSMB)被授权定期审查AE和实验室数据，并审查本报告中呈现的第56天(第8周)安全性数据。有协议指定的安全性停止规则。

如果参与者发展出任何提示COVID-19的症状，由研究者对他们进行评估以包括针对SARS-CoV-2的RT-PCR测试。在接受剂量2之前发展出COVID-19的参与者不得接受剂量2。

在剂量前、第0周、第6周、第30周和第56周收集免疫学样品(细胞和体液样品)。

免疫原性评定方法

分析了在第0周和第6周收集的样品。通过将标准品覆盖在聚蔗糖泛影葡胺上，然后离心，从血液样品分离出外周血单核细胞(PBMC)。将分离的细胞冷冻在10％ DMSO和90％胎牛血清中。将冷冻的PBMC储存在液氮中以供后续分析。从全血采集物获得血清样品并储存在-80℃，直至用于测量结合和中和抗体滴度。

SARS-CoV-2假病毒中和测定：使用1:1比率的IgE-SARS-CoV-2S质粒(Genscript)和pNL4-3.Luc.R-E-质粒(NIH AIDS试剂)，从用GeneJammer(Agilent)转染的HEK 293T细胞产生SARS-CoV-2-δCT假病毒。在感染之后72小时，SARS-CoV-2-δCT假病毒的滴度达到仅细胞对照相对发光单位(RLU)的20倍以上。该测定在96孔板中使用10,000个稳定表达人ACE2的CHO细胞作为靶细胞(Creative Biolabs，目录号VCeL-Wyb019)在100μl D10(补充有10％FBS和1X青霉素-链霉素的DMEM)培养基中进行。第二天，按需要对来自经INO-4800疫苗接种的受试者的热灭活血清进行连续稀释，并与固定量的SARS CoV-2-δCT假病毒在室温孵育90分钟。将血清和假病毒混合物转移至铺板的细胞并孵育72小时。然后，使用britelite plus发光报告基因测定系统(Perkin Elmer目录号6066769)裂解细胞，并且使用Biotek读板仪测量RLU。中和滴度(ID50)定义为在减去细胞对照孔中的背景RLU之后，与病毒对照孔中的RLU相比，RLU降低50％的倒数血清稀释度。将中和百分比与血清稀释度的数据拟合为非线性回归，即log(抑制剂)与归一化的应答-可变斜率最小二乘拟合以获得ID50值。所有计算均使用GraphPad Prism 8完成。S1+S2酶联免疫吸附测定(ELISA)：用2.0μg/mL重组SARS-CoV-2S1+S2刺突三聚体蛋白(Acro Biosystems；SPN-C52H9)包被ELISA板以去除弗林蛋白酶切割序列，该蛋白含有C端His标签、用于三聚体稳定的七个脯氨酸取代(F817P、A892P、A899P、A942P、K986P、V987P)和两个突变(R683A和R685A)。然后用含有0.05％Tween-20的PBS(Sigma；P3563)洗涤板4次并阻断(起始阻断，Thermo Scientific；37538)1至3小时。血清样品在起始阻断液中以最低1/20稀释，并且一式两份添加至经洗涤和阻断的测定板中。将样品在设定为600rpm的板摇床上于室温孵育2小时。在含有0.05％ Tween-20的PBS中洗涤三次之后，将在起始阻断液中以1/1000稀释的抗人IgG HRP缀合物(BD Pharmingen；555,788)添加至板中，并在设置为600rmp的板摇床上于室温孵育60分钟。然后将板在含有0.05％ Tween-20的PBS中洗涤三次，并将TMB底物(KPL；5120-0077)添加至板中，孵育大约九分钟。添加终止溶液(KPL；5150-0021)，并且使用Synergy HTX酶标仪(BioTek)读取450nm处的光密度，其中在650nm处进行背景校正。以单位每毫升(U/mL)计的抗体浓度通过从拟合至在症状出现>28天之后从经PCR确认的SARS-CoV-2恢复的供体获得的参考恢复期血浆的标准曲线的四参数Logistic模型差值来确定并任意指定浓度为20,000U/mL。

SARS-CoV-2刺突ELISpot测定描述：ELISpot测定按照先前所述进行(Tebas P,Yang S,Boyer JD等人Safety and immunogenicity of INO-4800DNA vaccine againstSARS-CoV-2:A preliminary report of an open-label,Phase 1clinicaltrial.EClinicalMedicine2021；31:100689。)在预包被的干扰素-γELISpot板(MabTech，人IFN-γELISpot Plus)上，使用包含整个刺突蛋白序列的重叠15聚体肽刺激在疫苗接种前和疫苗接种后获得的外周单核细胞(PBMC)过夜。过夜刺激后，根据制造商的说明，对ELISpot板进行处理以检测细胞IFN-γ产生。将与细胞IFN-γ分泌对应的斑点显影后，使用CTL S6微量分析仪(CTL)扫描板。使用ImmunoCapture和ImmunoSpot软件(CTL)对96孔板上的斑点进行计数。从含有肽刺激的孔的计数中减去仅含有PBMCS和培养基的阴性对照孔的计数。报告的值由跨一式三份孔的平均计数组成，并且表示为每百万个PBMC的斑点形成单位数。ELISpot测定先决条件确定，12个斑点形成单位(SFU)为检测下限。因此，任何高于该截止值者都被视为是抗原特异性细胞应答的信号。

统计分析

没有正式的功效分析适用于该试验。使用描述性统计来总结安全性端点：具有AE的比例、施用部位反应和8周内的AESI。还使用描述性统计数据来汇总免疫原性端点：对于细胞结果，使用中位数差异和相关联的非参数95％ CI，将干扰素-γELISpot应答幅度相对于基线的基线后增加在治疗组之间进行比较；以及使用几何平均倍数上升(GMFR)的比率和基于相关联的t分布的95％ CI，将中和抗体应答滴度相对于基线的基线后增加在治疗组之间进行比较。

结果

研究群体人口统计数据

筛选了总计619名参与者，其中筛选失败率为35％；并且将401名参与者随机分组到美国的十六个地点，每个地点有6至55名参与者入组。总计259名入组的参与者年龄为18-50岁。142名年龄为>51岁(32名年龄为65岁或以上)。将总计201名参与者随机分组以接受1.0mg剂量的INO-4800或安慰剂(两者均为单次注射)，并且将200名参与者随机分组以接受2.0mg剂量的INO-4800或安慰剂(两者均为每次访视2次注射)，其中在2剂量方案(第0和28天)中，每次注射后进行EP(图41和表20)。参与者中的52.6％(211/401)为女性并且大部分为白人(84.0％,337/401)，其中中位年龄为44.4岁(范围为18至80岁)。

表20：按治疗组的人口统计数据

*>51岁的子集

401名随机参与者中总计399名(99.5％)接受给药，并被纳入安全性群体。由于失访，两名随机参与者没有接受给药。在399名接受注射的参与者中，374名(93.3％)完成了两个剂量。未接受第2剂量的原因主要是选择接受紧急使用授权疫苗。总计374名参与者完成剂量2后至少28天的随访。总计23名参与者因受试者撤回而在第8周之前终止并失访。

向399名参与者总计施用了1153次ID注射，其中1131次(98％)在手臂中施用，并且22次在腿中施用(10名参与者)。

疫苗安全性和耐受性

截至第8周，在300名受试者中总计记录了1,679起AE。其中，在281名受试者中记录1,446起与治疗相关的AE。在超过5％的参与者中观察到的最常见的与治疗相关(即与研究性产品或EP相关)的AE(表21)为注射部位反应(瘙痒，1.0mg剂量中的42名参与者和2.0mg剂量中的65名参与者；疼痛，1.0mg剂量中的35名参与者和2.0mg剂量中的41名参与者；红斑，1.0mg剂量中的25名参与者和2.0mg剂量中的36名参与者；以及肿胀，1.0mg剂量中的16名参与者和2.0mg剂量中的23名参与者)、疲劳(1.0mg剂量中的37名参与者和2.0mg剂量中的48名参与者)、头痛(1.0mg剂量中的34名参与者和2.0mg剂量中的43名参与者)、肌痛/关节痛(1.0mg剂量中的37名参与者和2.0mg剂量中的67名参与者)和恶心(1.0mg剂量中的11名参与者和2.0mg剂量中的11名参与者)。

大多数AE的严重程度为1级和2级，并且在使用第二剂量的情况下发生频率没有表现出增加。报告了三起3级AE：关节痛(与治疗相关)以及宫颈发育不良和皮肤撕裂伤(均与治疗无关)。3级关节痛的单一案例发生在一名有肩关节镜检查史的参与者中，该患者的关节痛仅限于先前受伤的肩部。没有4级AE、AESI和相关的SAE。自然流产的单一SAE被评定为与治疗无关。经历每种最常见不良事件的参与者人数在两个给药组之间没有明显差异。(表21)。临床计划是在剂量2后对当前2期参与者进行12个月的随访，以确保长期安全性。

大多数AE的严重程度为1级，并且在使用第二剂量的情况下发生频率没有表现出增加(图42和43)。数据分类到3个年龄组中：18-50岁、51-64岁和≥65岁。AE的频率与年龄组成反比。260名18-50岁的受试者报告了4.5起AE/受试者，109名51-64岁的受试者报告了4.0起AE/受试者，并且32名≥65岁的受试者报告了2.4起AE/受试者。临床计划是在剂量2后对当前2期参与者进行12个月的随访以确保长期安全性，以及测量免疫应答的持久性

表21：按治疗组的治疗相关不良事件(>5％的参与者)总结。

*主要为1级和2级AE

**由于正在进行的盲法试验，未展示注射部位瘀伤。

注：参与者＝经历不良事件的受试者的独特数量。％＝经历事件的受试者除以安全性群体总数的比例。MedDRA 23.0版用于编码不良事件。

免疫原性

免疫原性分析包括评估结合抗体滴度(通过ELISA)、假病毒中和抗体滴度和干扰素-γ ELISpot斑点形成单位(SFU)从基线到第6周的变化。在剂量1之后至少25天用剂量2完成两个剂量且非NP阳性的受试者被纳入分析。分析中包括可评估基线样品和在剂量2之后至少6天且至多30天的可评估第6周样品。

体液免疫应答

针对与SARS-CoV-2的S1+S2刺突蛋白结合的能力，对来自安慰剂和INO-4800参与者的血清进行盲测。在第6周，1.0mg和2.0mg剂量组中结合抗体的几何平均滴度(GMT)(log10的SD)分别为938.8(0.76)和2210.0(0.75)单位/ml(U/ml)，相比之下，基线GMT(SD)分别为123.3(0.68)和93.5(0.48)U/ml；在此时间点，1次和2次注射安慰剂组中的结合抗体的GMT(SD)分布为92.8(0.43)和145.6(0.54)U/ml，相比之下，基线GMT(SD)分别为110.2(0.51)和123.8(0.52)U/ml(表22)。与1次注射安慰剂组相比，1.0mg剂量组中的几何平均倍数上升(GMFR)(95％ CI)统计学显著地高出8.34(4.92,14.14)，并且与2次注射安慰剂组相比，2.0mg剂量组中的几何平均倍数上升(GMFR)(95％ CI)统计学显著地高出19.99(11.74,34.03)。与1.0mg剂量组相比，2.0mg剂量组中的几何平均倍数上升(GMFR)(95％ CI)统计学显著地高出3.03(2.04,4.44)。

表22：在所有年龄组中，根据ELISA测定的结合抗体应答

缩写：GMT＝几何平均滴度，GMFR＝几何平均倍数上升注意：基线定义为第一次治疗施用之前的最后一次测量。GMT计算为抗log

a

COVID-19恢复期供体血浆的GMT(SD)为19444.3(0.53)。

还测试了血清中和SARS-CoV-2-δCT假病毒的能力。在第6周，1.0mg和2.0mg剂量组中的中和抗体的几何平均滴度(GMT)(log10的SD)分别为93.6(0.47)和150.6(0.46)，相比之下，基线GMT(SD)分别为32.2(0.38)和35.8(0.45)(表23)。在第6周，1.0mg和2.0mg剂量组中的中和抗体相对于基线的GMFR(SD)分别为2.9(0.45)和4.3(0.53)；在此时间点，1次和2次注射安慰剂组中的中和抗体的GMFR(SD)分别为1.2(0.32)和1.0(0.34)(表23)。与1.0mg剂量组相比，2.0mg剂量组中的GMFR(95％ CI)统计学显著地高出1.47(1.12,1.92)。结合抗体和中和抗体应答在不同年龄组之间是相似的。表提供了在18至50岁年龄组(表24)、≥51岁年龄组(表25)和≥65岁年龄组(表26)中，通过ELISA评定的结合抗体应答；以及在18至50岁年龄组(表27)、≥51岁年龄组(表28)和≥65岁年龄组(表29)中的假中和数据。

表23：在所有年龄组中，通过假型病毒中和试验评定的中和抗体应答

缩写：GMT＝几何平均滴度，GMFR＝几何平均倍数上升

注意：基线定义为第一次治疗施用之前的最后一次测量。

GMT计算为抗log

GMFR计算为抗log

a

COVID-19恢复期供体血浆的GMT(SD)为921.5(0.51)。

表24：在18至50岁年龄组中，根据ELISA的结合抗体应答

/>

缩写：GMT＝几何平均滴度，GMFR＝几何平均倍数上升

注意：基线定义为第一次治疗施用之前的最后一次测量。

GMT计算为抗log

GMFR计算为抗log

a

表25：在≥51岁年龄组中，根据ELISA的结合抗体应答

缩写：GMT＝几何平均滴度，GMFR＝几何平均倍数上升

注意：基线定义为第一次治疗施用之前的最后一次测量。

GMT计算为抗log

GMFR计算为抗log

a

表26：在≥65岁年龄组中，根据ELISA的结合抗体应答

缩写：GMT＝几何平均滴度，GMFR＝几何平均倍数上升

注意：基线定义为第一次治疗施用之前的最后一次测量。GMT计算为抗log

GMFR计算为抗log

a

表27：在18至50岁年龄组中，通过假型病毒中和试验评定的中和抗体应答

/>

缩写：GMT＝几何平均滴度，GMFR＝几何平均倍数上升

注意：基线定义为第一次治疗施用之前的最后一次测量。GMT计算为抗log

GMFR计算为抗log

a

表28：在≥51岁年龄组中，通过假型病毒中和试验评定的中和抗体应答

缩写：GMT＝几何平均滴度，GMFR＝几何平均倍数上升

注意：基线定义为第一次治疗施用之前的最后一次测量。GMT计算为抗log

GMFR计算为抗log

a

表29：在≥65岁年龄组中，通过假型病毒中和试验评定的中和抗体应答

缩写：GMT＝几何平均滴度，GMFR＝几何平均倍数上升

注意：基线定义为第一次治疗施用之前的最后一次测量。GMT计算为抗log

其中

Yi为受试者i的剂量后测定结果，并且Bi为受试者i的基线测定结果。

a

酶联免疫斑点(ELISpot)

使用IFN-γELISpot测定对从研究参与者收集的外周血单核细胞(PBMC)进行盲法测试，以测量T细胞免疫应答。在1次和2次注射安慰剂组两者中，从基线到第6周的中位增加均为0.00，其中在1次和2次注射组中观察到的最大增加分别为每10

表30：在所有年龄组中，根据ELISpot的T细胞免疫应答

注意：基线定义为第一次治疗施用之前的最后一次测量。

a

表31：在18至50岁群体中，通过ELISpot测定评定的T细胞免疫应答

/>

注意：基线定义为第一次治疗施用之前的最后一次测量。

a

表32：在≥51岁群体中，通过ELISpot测定评定的T细胞免疫应答

/>

注意：基线定义为第一次治疗施用之前的最后一次测量。

a

表33：在≥65岁群体中，通过ELISpot评定的T细胞免疫应答

注意：基线定义为第一次治疗施用之前的最后一次测量。

a

讨论

大多数不良事件(AE)的严重程度为1级和2级，并且在使用第二剂量的情况下发生频率没有明显地表现出增加。大多数AE的严重程度为1级，并且重要的是，在使用第二剂量的情况下发生频率没有表现出增加。一例与治疗相关的3级AE为关节痛。自然流产的单一SAE被认为与治疗无关。

在测试的所有年龄组中，在第6周测量到，与在第0天(剂量前)的基线水平相比或者与在第6周的安慰剂受试者相比，INO-4800在1.0mg和2.0mg剂量水平两者下产生了平衡的体液和细胞免疫应答。INO-4800在每个INO-4800剂量组中诱导抗体应答，这些抗体应答能够进行结合和中和两者(表22和23)。在第6周，1.0mg和2.0mg剂量组两者均具有统计学显著地高于各自相应安慰剂组的GMFR值，并且2.0mg剂量组的GMFR值在统计学上高于1.0mg剂量组。

在第6周，中和抗体的结果相似，其中1.0mg和2.0mg剂量组的GMFR分别统计学显著地高于1次和2次注射安慰剂组。2.0mg剂量组中的中和抗体水平的GMFR统计学显著地高于1.0mg剂量组。与1.0mg剂量组相比，通过ELISpot测定测量的T细胞免疫应答在2.0mg剂量组中也较高(表30)。总体而言，在2期中，2.0mg剂量组生成的结合和中和抗体应答统计学显著地高于1.0mg剂量组，而在2.0mg剂量组中观察到的T细胞应答具有高于1.0mg剂量组中观察到的T细胞应答的趋势。

实例8SARS-CoV-2DNA疫苗INO-4800的一剂量或两剂量方案在非人灵长类动物(NHP)攻击模型中针对呼吸道疾病负担进行保护

在恒河猴模型中评估了INO-4800(一种编码SARS-CoV-2刺突抗原的合成DNA候选疫苗)的安全性、免疫原性和功效。评估单剂量和两剂量疫苗接种方案。疫苗接种诱导了针对SARS-CoV-2的结合抗体和中和抗体两者以及产生IFN-γ的T细胞。使用高剂量的SARS-CoV-2Victoria01毒株(5x 10^6pfu)来专门地评定INO-4800疫苗接种对于肺部疾病负担的影响，以提供疫苗安全性和功效数据两者。通过应用组织病理学、肺部疾病评分度量系统、原位杂交、病毒RNA RT-PCR和计算机断层扫描术(CT)扫描来测量广泛的下呼吸道疾病参数，以提供了解疫苗诱导的免疫对保护性功效和潜在的疫苗增强疾病(VED)的影响。

本实例描述对SARS-CoV-2DNA疫苗INO-4800在严格的高剂量非人灵长类动物攻击模型中的免疫原性、功效和安全性评定。在2剂量方案和次优1剂量方案两者中，向恒河猴皮内递送1mg INO-4800诱导了针对SARS-CoV-2刺突抗原的体液和T细胞应答。在整个研究过程中，动物中没有记录到明显的临床事件。在高剂量SARS-CoV-2攻击之后，观察到1剂量和2剂量疫苗组两者中的病毒载量和肺部疾病负担降低，支持INO-4800的功效。重要的是，即使在1剂量组中，也没有观察到疫苗增强疾病(VED)。

方法

疫苗。使用Inovio专有计算机基因优化算法创建编码SARS-CoV-2IgELS-刺突的优化DNA序列，以增强表达和免疫原性。合成经优化的DNA序列，用BamHI和XhoI消化，并且在人巨细胞病毒立即早期启动子和牛生长激素聚腺苷酸化信号的控制下克隆到表达载体pGX0001中。

动物。本研究中使用了十八只原产于印度的恒河猴(Macaca mulatta)。研究组包括每个物种的三只雄性和三只雌性，在攻击时全部为年龄在2.5至3.5岁之间的成年体并且体重>4Kg。在实验开始之前，将社会相容动物随机分配到攻击组，以尽量减少偏倚。根据英国内政部《为科学程序饲养、供应或使用的动物饲养和护理实践守则》(2014)和国家细化、减少和替换委员会(NC3R)《灵长类动物住宿、护理和使用指南》(2006年8月)，将动物以相容社会组圈养在笼中。[Salguero,F.J.等人Comparison of Rhesus and Cynomolgusmacaques as an authentic model for COVID-19.bioRxiv,2020:p.2020.09.17.301093。]中描述了攻击之前和攻击期间的圈养。所有实验工作均在英国内政部批准的项目许可证(PDC57C033)的授权下进行，该许可证已由动物福利和伦理审查机构(AWERB)在PHE Porton Down进行当地伦理审查，并且根据内政部《动物(科学程序)法(1986)》的要求获得批准。通过肌肉内(IM)注射盐酸氯胺酮(Ketaset，100mg/ml，FortDodge Animal Health Ltd,Southampton,UK；10mg/kg)对动物进行镇静，以进行需要从动物圈舍中移出的程序。这些动物之前无一被用于实验程序。

疫苗施用。动物仅在第28天(1剂量组)或在第0和28天(2剂量组)通过皮内注射接受1mg SARS-CoV-2DNA疫苗INO-4800，然后使用带有3P阵列的CELLECTRA

收集血清和肝素化全血，同时在疫苗接种期期间以两周间隔对动物进行镇静。在D56攻击当天还收集了鼻拭子和咽拭子。攻击之后，在1、3、5dpc并且在捕杀(6、7或8dpc-由于程序中涉及高水平的劳动力而错开)时收集鼻拭子、咽拭子和血清，其中在3dpc并且在捕杀时收集肝素化全血。如[Salguero,F.J.等人，Comparison of Rhesus and Cynomolgusmacaques as an authentic model for COVID-19.bioRxiv,2020:p.2020.09.17.301093。]所述获得鼻拭子和咽拭子。

临床观察结果。每天多次监测动物的行为和临床变化。针对包括抑郁、从群组中退出、攻击性、喂养方式的改变、呼吸方式、呼吸频率和咳嗽的禁忌指标来评估行为。在整个研究过程中，对动物的活动和健康状况进行如下观察和评分。关键：活动水平：A0＝活跃且警觉；A1＝仅在被操作员刺激时活跃；A2＝即使受到刺激也不活跃/不动；H＝健康；S＝打喷嚏，C＝咳嗽，Nd＝鼻分泌物，Od＝眼分泌物，Rn＝呼吸噪音，Lb＝呼吸困难，L＝嗜睡，Di＝腹泻，Ax＝食欲不振，Dx＝脱水，RD＝呼吸窘迫。在整个研究过程中测量并记录动物体重、温度和血红蛋白水平。

病毒和细胞

SARS-CoV-2Victoria/01/2020[Caly,L.等人，Isolation and rapid sharing ofthe 2019novel coronavirus(SARS-CoV-2)from the first patient diagnosed withCOVID-19in Australia.Med J Aust,2020.212(10):p.459-462]由澳大利亚墨尔本的Doherty研究所使其在Vero/hSLAM细胞中原代生长并且随后在PHE Porton Down在Vero/hSLAM细胞中传代两次之后以P1慷慨提供[ECACC 04091501]。用约0.0005MOI的病毒感染细胞，并且在第4天通过与无菌5mm硼硅酸盐珠一起轻轻摇动分离剩余的附着细胞、然后通过以1,000x g离心10分钟进行澄清来采集细胞。使用Nanopore和Illumina两者对P3攻击种群进行全基因组测序，如Lewandowski,K.等人Metagenomic Nanopore Sequencing ofInfluenza Virus Direct from Clinical Respiratory Samples.J Clin Microbiol,2019.58(1)中所述。通过Vero/E6细胞[ECACC 85020206]上的测定来确定攻击种群的病毒滴度。细胞系获自欧洲认证细胞培养物保藏中心(ECACC)PHE,Porton Down,UK。细胞培养物在37℃在补充有10％胎牛血清(FBS)(Sigma,Dorset,UK)和25mM HEPES(LifeTechnologies,California,USA)的最低必需培养基(MEM)(Life Technologies,California,USA)中维持。此外，Vero/hSLAM培养物补充有0.4mg/ml遗传霉素(Invitrogen)以维持表达质粒。攻击物质稀释在磷酸盐缓冲盐水(PBS)中执行。通过气管内途径(2ml)和鼻内滴注(总计1.0ml，每个鼻孔0.5ml)递送接种物(5x 10

临床体征和通过计算机断层扫描的活体成像

CT扫描在SARS-CoV2攻击之前两周和攻击之后五天进行。使用16片Lightspeed CT扫描仪(General Electric Healthcare,Milwaukee,WI,USA)对镇静的动物进行俯卧位和仰卧位两者的CT成像，并且由呼吸系统疾病医学医学放射科专家评估扫描结果(如先前所述[Salguero,F.J.等人，Comparison of Rhesus and Cynomolgus macaques as anauthentic model for COVID-19.2020:p.2020.09.17.301093。])。为了提供区分疾病体积较小(即肺部受累<25％)的单个NHP之间的差异的功效，设计了一个精细化评分系统，其中评分归因于人类患者中具备COVID独有的异常特征(COVID模式评分)以及归因于特征在肺部的分布(肺野评分)。根据下列系统，将COVID模式评分计算为分配给已鉴定的结节数量以及具备GGO和实变及其程度的评分的总和：结节：1个为1分，2或3个为2分，4个或更多个为3分；GGO：根据下列对每个受影响区域赋予评分：如果测量区域<1cm则为1分，如果测量区域为1至2cm则为2分，如果测量区域为2至3cm则为3分，如果测量区域>3cm则为4分，并且将GGO的每个区域的评分相加得出GGO总评分；实变：根据下列对每个受影响区域赋予评分：如果测量面积<1cm则为1分，如果测量区域为1至2cm则为2分，如果测量区域为2至3cm则为3分，如果测量区域>3cm则为4分，并且将实变的每个区域的评分相加得出实变总评分。为了考虑将实变与GGO相比，评估的另外疾病对宿主的影响，通过将分配给实变的评分加倍来对评分系统进行加权。为了确定肺野评分，将肺分为12个肺野，并且将肺的每一侧(从上到下)分为三个肺野：上肺野(隆突上方)、中肺野(从隆突到下肺静脉)和下肺野(下肺静脉下方)。每个肺野又分为两个区域：前区域(在矢状位中膈肌中点垂线之前的区域)和后区域(在矢状位中膈肌中点垂线之后的区域)。这产生总计12个肺野，其中每个含有结构变化的肺野被赋予一分。将COVID模式评分和肺野相加以提供CT总评分。

验尸和组织病理学。在6、7和8dpc的3个不同时间点对动物进行安乐死，每组六只(包括每个物种和性别各一只动物)。尸检时从右肺收集支气管肺泡灌洗液(BAL)。在收集BAL之前解剖左肺并用于后续组织病理学和病毒学程序。在尸检时，采集鼻拭子和咽拭子、肝素化全血和血清以及组织样品用于组织病理学分析。将来自左颅和左尾肺叶以及脾、肾、肝、纵隔和腋窝淋巴结、小肠(十二指肠)、大肠(结肠)、气管、喉部接种部位和引流淋巴结的样品通过浸没在10％中性缓冲福尔马林中并按常规处理到石蜡中来进行固定。切下四μm切片，并且用苏木精和曙红(H&E)染色并在显微镜下检查。使用肺组织病理学评分系统[Salguero,F.J.等人，Comparison of Rhesus and Cynomolgus macaques as anauthentic model for COVID-19.bioRxiv,2020:p.2020.09.17.301093]来评估影响气道和实质的病变。使用来自每个左肺叶的三个组织切片来评估肺组织病理学。此外，使用RNAscope技术对样品进行染色，以鉴定肺组织切片中的SARS-CoV-2病毒RNA。简而言之，组织用以下进行预处理：过氧化氢，10分钟(RT)；目标恢复，15分钟(98℃至102℃)；以及蛋白酶加，30分钟(40℃)(高级细胞诊断)。将V-nCoV2019-S探针(SARS-CoV-2刺突基因特异性)在组织上于40℃孵育两小时。此外，使用RNAscope技术对样品进行染色以鉴定SARS-CoV-2病毒RNA。使用RNAscope 2.5HD检测试剂盒-红色(高级细胞诊断，Biotechne)遵循RNAscope方案进行信号放大。所有H&E和ISH染色的载玻片均使用全景3D-Histech扫描仪进行数字扫描，并使用CaseViewer v2.4软件查看。使用全肺组织切片载玻片通过ISH来评估病毒RNA的存在。通过使用Nikon-NIS-Ar软件包，在RNAscope标记的载玻片上进行数字图像分析，以查明病变内染色的细胞的百分比。

通过RT-qPCR进行病毒载量定量。从鼻拭子和咽拭子分离RNA。样品在AVL(Qiagen)和乙醇中灭活。然后按照制造商的说明使用BioSprint

使用靶向SARS-CoV-2核衣壳(N)基因的区的逆转录定量聚合酶链反应(RT-qPCR)来确定病毒载量，并且使用TaqPath

使用TaqMan

2019-nCoV_sgE-正向，5'CGATCTCTTGTAGATCTGTTCTC 3'(SEQ ID NO:21)；

2019-nCoV_sgE-反向，5'ATATTGCAGCAGTACGCACACA 3'(SEQ ID NO:22)；

2019-nCoV_sgE-探针，5'FAM-ACACTAGCCATCCTTACTGCGCTTCG-BHQ1 3'(SEQ IDNO:23)。

循环条件为：50℃持续10分钟，95℃持续2分钟，然后是95℃持续10秒和60℃持续30秒的45个循环。RT-qPCR扩增子针对全长SARS-CoV-2E ORF(登录号NC_045512.2)的体外转录的RNA标准品进行定量，该标准品前面是由Wolfel等人[

斑块降低中和测试。在热灭活(56℃，30分钟)的血清样品中测量中和病毒滴度。将SARS-CoV-2稀释至1.4x 10

抗原结合ELISA。通过ELISA确定重组SARS-CoV-2刺突和RBD特异性IgG应答。由Lake Pharma供应全长三聚体和稳定版本的SARS-CoV-2刺突蛋白(#46328)。重组SARS-CoV-2受体结合结构域(319-541)Myc-His由MassBiologics开发并慷慨提供。用每孔50μl 2μg/ml刺突三聚体(S1+S2)或RBD在1x PBS(Gibco)中包被高结合96孔板(Nunc Maxisorp，442404)，并在4℃孵育过夜。将ELISA板洗涤并且用1x PBS/0.1％ Tween 20中的5％胎牛血清(FBS，Sigma，F9665)在室温阻断1小时。在疫苗接种之后从动物收集的血清具有1/50的起始稀释度，然后进行8次两倍连续稀释。攻击后样品在0.5％triton中灭活并且具有1/100的起始稀释度，然后进行8次三倍连续稀释。在1x PBS/0.1％Tween 20中的10％ FBS中进行连续稀释。将板洗涤之后，将50μl/孔的各血清稀释液一式两份添加至抗原包被的板中，并且在室温孵育2小时。洗涤后，将与HRP缀合的抗猴IgG(Invitrogen，PA1-84631)在1X PBS/0.1％ Tween 20中的10％ FBS中稀释(1:10,000)，并以100μl/孔添加至板中。然后将板在室温孵育1小时。洗涤之后，制备1mg/ml邻苯二胺二盐酸盐溶液(Sigma P9187)并且每孔添加100μl。用每孔50μl 1M盐酸(Fisher Chemical，J/4320/15)停止显色，并且使用Softmax(版本7.0)在Molecular DevicesVersamax读板仪上读取490nm处的吸光度。使用端点滴度测定方法确定滴度。对于每个样品，端点滴度定义为给出高于截止值的读数(OD)的最高样品稀释度的倒数。对于每个实验组，截止值确定为原初样品的平均OD+3SD。

外周血单核细胞分离和复苏。使用标准方法从用肝素(每8720ml血液132单位)(BDBiosciences,Oxford,UK)抗凝的全血分离PBMC。从组织分离的PBMC在-180℃储存。对于复苏，将PBMC解冻，在含有1U/ml DNA酶(Sigma)的R10培养基(由补充有2mM L-谷氨酰胺、50U/ml青霉素、50μg/ml链霉素和10％热灭活FBS的RPMI 1640组成)中洗涤，并且重新悬浮于R10培养基中并在37℃、5％ CO

ELISpot。使用IFNγELISpot测定来评估PBMC中的SARS-CoV-2特异性T细胞的频率和IFNγ产生能力，该测定使用人/猿IFNγ试剂盒(MabTech,Nacka.瑞典)如先前所述[Sibley,L.S.等人，ELISPOT Refinement Using Spot Morphology for Assessing HostResponses to Tuberculosis.Cells,2012.1(1):p.5-14。]进行。以每孔2x 10

统计：使用GraphPad Prism 7或8软件(加利福尼亚州拉荷亚(La Jolla,CA))进行所有统计学分析。如果p<0.05，这些数据被视为是显著的。所进行的统计分析类型在图例中详细说明。没有样品或动物被排除在分析之外。

结果：

INO-4800的一剂量和两剂量方案的免疫原性。十二只(6只雄性和6只雌性)恒河猴分别在第28天或在第0天和第28天接种1个剂量(6只动物)或2个剂量(6只动物)的INO-4800(图22A)。对于每次治疗，皮内施用1mg INO-4800，然后进行CELLECTRA-ID EP。另外六只年龄和性别匹配的动物没有接种疫苗并且提供对照组。在研究持续时间内观察动物并评分为警觉和健康，并且在动物中没有记录到不良事件或临床异常(图23)。在第0天与第56天之间，每两周测量一次所有动物中SARS-CoV-2刺突抗原反应性IgG抗体的血清滴度。在单一剂量组(INO-4800X1)中，在疫苗接种之后14天，针对SARS-CoV-2刺突抗原三聚体S1+S2 ECD形式的平均端点滴度为467，针对RBD抗原的平均端点滴度为442，并且活病毒(与攻击菌株匹配的Victoria/01/2020)中和滴度为239(图22B、22C、22D)。在2剂量组(INO-4800X2)中，在第2次疫苗接种之后14天，测量到针对S1+S2 ECD的平均端点滴度为2,142，针对RBD抗原的平均端点滴度为1,538，并且活病毒中和滴度为2,199(图22B、22C、22D)。如通过IFN-γELISpot测量的，用INO-4800进行疫苗接种在PBMC群体中诱导了SARS-CoV-2刺突抗原特异性Th1 T细胞应答(图22E)。总之，INO-4800的皮内递送诱导了针对SARS-CoV-2刺突蛋白的功能性体液和T细胞应答，该应答在第二剂量之后加强。在病毒攻击当天(第56天)，与对照组相比，接种疫苗的组中的血清中SARS-CoV-2中和抗体的水平显著较高(p＝0.015)。病毒攻击后，在第56天与第62-64天之间，所有组中的SARS-CoV-2刺突结合和中和抗体滴度均略微增加(图22B、22C、22D)。在对照组中，在病毒攻击之后，对跨越SARS-CoV-2刺突抗原的肽的细胞免疫应答增加，但在接种疫苗的组中几乎没有变化，这可能是由于宿主免疫系统的体液臂控制病毒感染所致(图22F)。

在SARS-CoV-2攻击之后，上呼吸道和下呼吸道中的病毒载量

在第56天，所有动物均用被递送至上呼吸道和下呼吸道两者的总计5x10^6pfuSARS-CoV-2进行攻击。在任何动物的攻击持续期间(6至8天)没有观察到明显的临床症状(图23A至23C)。在指示的时间点从动物收集鼻拭子和咽拭子。通过RT-qPCR测量表示复制病毒的SARS-CoV-2病毒基因组(病毒RNA)和亚基因组(sgmRNA)(图24A和25A)。对咽中病毒RNA曲线下面积(AUC)水平的分析揭示，接种疫苗的组中的病毒RNA水平显著降低(图24B)。此外，与对照组相比，在INO-4800X2组中测得的峰值病毒载量水平显著降低(图24C)。分析揭示了咽病毒载量与中和和抗RBD IgG滴度之间的显著负相关(图15A至15D)。SARS-CoV-2sgmRNA数据揭示了与对照组相比，接种疫苗的组中的病毒载量降低的相似趋势(图25A至25C)。鼻区室中的分析揭示，与对照相比，接种疫苗的组中的病毒RNA和sgmRNA降低和加速清除的趋势，但没有达到显著水平(图24D至24F和25D至25F)。分析揭示了在第3天而非第1天，鼻病毒载量与中和和抗RBD IgG滴度之间的显著负相关(图15E至15H)。

在尸检时(攻击后6至8天)，从每只动物收集BAL液体。对SARS-CoV-2病毒RNA和sgmRNA水平的测量揭示，接种疫苗的组中的平均病毒减少，尽管各组内的水平根据尸检日期而有所不同(图26A、26B)。还对在尸检时收集的组织进行RT-qPCR。在攻击后的这些时间点，在除肺外的大多数组织中检测到的SARS-CoV-2病毒RNA水平均低于定量限(图27)。对在肺组织样品中检测到的SARS-CoV-2病毒mRNA和sgmRNA水平的测量指示，接种疫苗的动物中的平均病毒载量降低(图26C和26D)。

总之，数据显示，在接种疫苗的组中，咽中的病毒载量显著降低，并且肺中的病毒载量有降低的趋势。在攻击之后不同的时间点(第6、7或8天)收集BAL和肺组织样品可能会增加观察到的影响统计分析的组内变异性。RT-qPCR病毒载量数据指示，INO-4800疫苗接种对于降低用高剂量SARS-CoV-2攻击的恒河猴中的病毒载量具有积极作用，一般来说，与一剂疫苗组相比，在2剂疫苗组中测得的病毒水平较低。

在SARS-CoV-2攻击之后的肺部疾病负担。

对在攻击之后6至8天尸检时采集的肺组织进行肺部疾病负担评定。以双盲方式对研究中的所有动物进行分析。对多个器官组织进行肺组织的组织病理学分析，但只有肺显示了明显的病变，与SARS-CoV-2感染相符。在来自未接种疫苗的对照的动物的肺中观察到与SARS-CoV-2感染一致的肺部病变，而在接种疫苗的组中，观察到降低的肺部病变水平。代表性的组织病理学图像提供在图28中。简而言之，肺实质由多病灶合并的肺炎区域组成，周围环绕着未受影响的肺实质。肺泡损伤伴肺细胞坏死是受影响区域中的一个显著特征。肺泡空间和肺泡间隔含有混合炎症细胞(包括巨噬细胞、淋巴细胞、活的和退化的中性粒细胞以及偶尔的嗜酸性粒细胞)和水肿。在远端细支气管和细支气管-肺泡连接处也观察到II型肺细胞增生。在较大的气道中，偶尔在呼吸道上皮中观察到局灶性上皮退化和脱落。少量混合炎症细胞，包括中性粒细胞、淋巴细胞和偶尔的嗜酸性粒细胞，浸润支气管和细支气管壁。在一些气道的管腔中，可以看到粘液中混有退化的细胞，主要是中性粒细胞和上皮细胞。在实质内，还观察到血管周围和细支气管周围的套囊，主要是构成浸润的淋巴细胞。

应用组织病理学评分和SARS-CoV-2RNA阳性的组织面积百分比来定量疾病负担。与接种疫苗的组相比，未接种疫苗的组显示出最高的肺部组织病理学评分(图29A和29C)。与未接种疫苗的动物相比，来自接种疫苗的组的动物显示降低的病理学，但来自INO-4800X1组的动物#10A除外，该动物的组织病理学评分与未接种疫苗的动物相似。为了检测肺组织中SARS-CoV-2RNA的存在，进行了原位杂交(ISH)。在接种疫苗的动物中，在组织病理学病变内的肺细胞和炎症细胞中观察到病毒RNA，其频率降低(图29B)。

进行CT扫描以提供活体、公正且可定量的肺部疾病指标。针对以下COVID-19疾病特征的存在并且针对肺栓塞对在用SARS-CoV-2攻击之后5天进行的肺部CT成像结果进行了评估：磨玻璃样混浊(GGO)、实变、碎石路征、结节、小叶周围实变；分布-上、中、下、中央2/3、外周、支气管中心。医学放射科医生对动物的治疗和临床状况一无所知。使用针对COVID疾病开发的评分系统来评估和定量肺部受累程度。评分系统参数提供在材料和方法部分中。在INO-4800一剂量组或两剂量组中分别在6只动物中的3只和6只动物中的2只中、以及在对照组中在6只未接种疫苗的动物中的5只中观察到COVID-19疾病的肺异常特征(代表性CT扫描图像提供在图30中)。患有疾病的动物的肺部受累程度低于25％，并且被认为是低水平疾病(图29D)。存在疾病评分在未接种疫苗的对照组中最高的趋势，而INO-4800一剂量组和两剂量组中的疾病评分降低(图29E至29G)。组间评分的比较未达到统计学差异(INO-4800两剂量组与无疫苗组之间p＝0.0584，Mann Whitney检验)。INO-4800X1组中的一只离群动物(10A)评分高于其他动物。然而，疾病水平仍然被认为较低，并且在相同条件下进行的其他NHP SARS-CoV-2攻击研究中观察到了相当的疾病负担。总之，CT扫描为恒河猴中SARS-CoV-2诱导的疾病提供了有用的测量方法。SARS-CoV-2感染后第5天，据报道存在低水平的异常(受累肺部<25％)。来自CT扫描的证据表明组间存在肺部疾病负担差异的趋势，其中未接种疫苗的对照组的疾病负担最高。

总之，在对非人灵长类动物进行高剂量SARS-CoV-2攻击之后，接受两剂量INO-4800疫苗方案的单剂量的动物的疾病负担降低。即使在接受次优一剂量疫苗接种方案的动物中，也没有疫苗增强疾病的迹象。

讨论

本实例描述对SARS-CoV-2DNA疫苗INO-4800在严格的高剂量非人灵长类动物攻击模型中的安全性、免疫原性和功效评定。在2剂量方案和1剂量方案两者中，向恒河猴皮内递送1mg INO-4800诱导了针对SARS-CoV-2刺突抗原的体液和T细胞应答两者。在整个研究过程中，动物中没有记录到明显的临床事件。在高剂量SARS-CoV-2攻击之后，观察到1剂量和2剂量疫苗组两者中的病毒载量和肺部疾病负担降低，支持INO-4800的功效。重要的是，即使在1剂量组中，也没有观察到疫苗增强疾病(VED)。

恒河猴模型已成为用于评定针对SARS-CoV-2的医学对策的广泛采用的模型。重要的是，野生型非适应性SARS-CoV-2在恒河猴的呼吸道中复制，并且该动物呈现出在具有轻度COVID-19症状的人类中观察到的一些特征[Salguero,F.J.等人，Comparison of Rhesusand Cynomolgus macaques as an authentic model for COVID-19.2020:p.2020.09.17.301093；

重要的是，数据指示，增强的呼吸道疾病(ERD)与以1剂量或2剂量方法进行INO-4800免疫无关联。在INO-4800X1剂量组中，一只动物(10A)确实呈现出最高的肺组织病理学评分和CT扫描评分。然而，动物10A中的多灶性病变显示出与来自未接种疫苗的组的动物中观察到的相似的组织病理学模式，其中浸润中没有明显的不同炎症细胞亚群的流入。疫苗增强疾病的一个潜在标志为炎症细胞诸如嗜酸性粒细胞的流入增加[Bolles,M.等人，Adouble-inactivated severe acute respiratory syndrome coronavirus vaccineprovides incomplete protection in mice and induces increased eosinophilicproinflammatory pulmonary response upon challenge.J Virol,2011.85(23):p.12201-15；Yasui,F.等人，Prior Immunization with Severe Acute RespiratorySyndrome(SARS)-Associated Coronavirus(SARS-CoV)Nucleocapsid Protein CausesSevere Pneumonia in Mice Infected with SARS-CoV.The Journal of Immunology,2008.181(9):p.6337-6348。]。动物10A的CT扫描和组织病理学数据据信与ERD无关联，而是与未接种疫苗的动物相似的疾病评分和模式。在接受其他候选疫苗的恒河猴中，在攻击之后7或8天分析的样品中，报告了相似的肺组织病理学炎症评分，范围从极轻-轻度到轻度-中度[Corbett,K.S.等人，Evaluation of the mRNA-1273Vaccine against SARS-CoV-2inNonhuman Primates.New England Journal of Medicine,2020.383(16):p.1544-1555]。目前，VED仍然是用SARS-CoV-2进行疫苗接种的理论上关切问题，并且尝试使用福尔马林灭活的SARS-CoV-2全病毒制剂诱导增强疾病，但未能重复先前报道的关于其他灭活呼吸系统病毒疫苗的肺部病理学[Bewley,K.R.等人，Immunological and pathological outcomesof SARS-CoV-2challenge after formalin-inactivated vaccine immunization offerrets and rhesus macaques.2020:p.2020.12.21.423746]。

该数据补充了NHP SARS-CoV-2攻击研究，该研究证明了在INO-4800免疫之后几个月，LRT病毒载量降低(实例9)。然而，这些研究之间存在不同的差异，包括用于攻击种群的不同剂量和变种，以及攻击的时机。在此实例中描述的研究中，动物在最后一次疫苗接种之后四个星期在存在高水平的循环中和抗体的时间点受到攻击。在另一项研究中，在攻击时血清SARS-CoV-2中和抗体水平较低，保护表现出依赖于记忆应答的召回，其中在动物中检测到针对SARS-CoV-2刺突抗原的强烈体液和细胞应答。这里没有观察到相似幅度的抗体再生应答，表明保护可能已经由在攻击时存在于循环中的抗体介导，血清SARS-CoV-2靶向抗体水平与病毒载量降低之间的相关性支持这一点(图15)。

总之，严格的临床前SARS-CoV-2动物模型的结果为DNA疫苗INO-4800作为针对COVID-19的预防性措施的功效和安全性提供了进一步支持。重要的是，作为单一剂量免疫进行测试，我们观察到对肺部疾病负担的积极影响，并且没有VED。结合INO-4800临床数据，INO-4800由于其高稳定性，在安全性、功效和物流可行性方面具有许多属性，无需挑战用于全球准入的冷链分销要求。此外，合成DNA疫苗技术适合高度加速的开发时间线，允许快速设计和测试针对新SARS-CoV-2变种的候选疫苗，这些变种展示出免疫逃逸的潜力[Wibmer,C.K.等人，SARS-CoV-2 501Y.V2 escapes neutralization by South African COVID-19donor plasma.2021:p.2021.01.18.427166；Moore,J.P.和P.A.Offit,SARS-CoV-2Vaccines and the Growing Threat of Viral Variants.JAMA,2021。]。

实例9SARS-COV-2DNA疫苗诱导体液和细胞免疫，导致记忆应答，这在恒河猴攻击中提供抗体再生保护

编码SARS-CoV-2刺突蛋白的合成DNA疫苗的免疫原性先前已在小鼠和豚鼠中得到证实(实例1)。在此实例中，证明了INO-4800在恒河猴中诱导的免疫应答的持久性。在恒河猴中施用ID-EP诱导了对SARS-Cov-2 S蛋白的细胞和体液应答，以及与SARS-CoV-1S蛋白的另外的交叉反应性。证明了最终免疫后3个多月的保护性功效，证明在接种疫苗的猕猴中建立了抗体再生性免疫应答并降低了病毒载量。在病毒攻击之后，与对照动物相比，经由皮内(ID)递送施用1mg(DNA剂量的1/5)时观察到亚基因组信使RNA(sgmRNA)BAL病毒载量的降低。这与在细胞和体液免疫臂两者中诱导快速召回应答相关联，支持INO-4800候选物缓解疾病的潜力。在疫苗组中的动物中没有观察到不良事件或疫苗增强疾病(VED)的证据。观察到下肺中降低的病毒亚基因组RNA载量和较低的VL。在鼻子中，观察到较低VL的趋势。这些数据支持，使用这种候选DNA疫苗进行免疫限制活跃的病毒复制并且具有降低疾病严重程度的的潜力和降低的鼻腔中的病毒脱落。

值得注意的是，本研究中在对照动物中检测到的初始病毒载量平均比在相同条件(约10

这项研究显示，与部分结构域和截短的免疫原相比，使用针对全长SARS-CoV-2刺突蛋白的候选疫苗进行DNA疫苗接种可能增加T细胞免疫显性表位的可用性，从而产生更广泛、更有效的免疫应答。在这项研究中，观察到T细胞与SARS-CoV-1的交叉反应性。

除了T细胞外，INO-4800还诱导持久的抗体应答，这种应答在SARS-CoV-2攻击后迅速增强。进一步表明，INO-4800诱导针对D614 G614 SARS-CoV-2变种的强烈中和抗体应答。虽然D/G 614位点位于RBD外部，但有人认为这种偏移有可能影响疫苗引发的抗体(KorberB等人，2020,Cell 182:1-16)。其他研究报道，G614变体表现出增强的SARS-CoV-2感染性(Hu等人，2020,bioRxiv 2020.06.20.161323；Ozono S,2020,bioRxiv2020.06.15.151779)。数据显示，在D614与G614变体之间诱导了相当的中和滴度，并且这些应答在SARS-CoV-2攻击后被相似地召回。

材料和方法

非人灵长类动物免疫、IFNγELISpot和ELISA

DNA疫苗，INO-4800：使用Inovio专有计算机基因优化算法创建编码SARS-CoV-2IgE-刺突的优化DNA序列，以增强表达和免疫原性(Smith et al.,2020,Nat Commun 11,2601)。合成经优化的DNA序列，用BamHI和XhoI消化，并且在人巨细胞病毒立即早期启动子和牛生长激素聚腺苷酸化信号的控制下克隆到表达载体pGX0001中。

动物：所有恒河猴实验均得到Bioqual机构动物护理和使用委员会(Rockville,Maryland)的批准，Bioqual是实验动物护理评估和认证协会(AAALAC)国际认可的机构。收集血液用于血液化学、PBMC分离、血清学分析。在第8周收集BAL以测定肺部抗体水平，并且在攻击后第1、2、4、7天收集BAL以测定肺部病毒载量。

免疫、样品收集和病毒攻击。将十只中国恒河猴(体重范围4.55kg至5.55kg)随机分配到免疫的(3只雄性和2只雌性)或原初(2只雄性和3只雌性)研究中。免疫的猕猴在第0和4周通过使用带有3P阵列的CELLECTRA

外周血单核细胞分离。将每只猕猴的血液收集到柠檬酸钠细胞制备管(CPT，BDBiosciences)中。根据制造商的方案，将试管离心以分离血浆和淋巴细胞。样品通过冷包装在当天从Bioqual运输至Wistar研究所进行PBMC分离。洗涤PBMC并且使用氯化铵钾(ACK)裂解缓冲液去除残留的红细胞。使用ViCell计数器(Beckman Coulter)对细胞进行计数，并且重新悬浮于补充有10％胎牛血清(Atlas)和1％青霉素/链霉素(Gibco)的RPMI 1640(Corning)中。然后将新鲜细胞铺板进行IFNγELISpot测定和流式细胞术。

IFN-γ酶联免疫斑点(ELISpot)。进行猴干扰素γ(IFN-γ)ELISpot测定来检测细胞应答。猴IFN-γELISpotPro(碱性磷酸酶)板(Mabtech,Sweeden，Cat#3421M-2APW-10)用补充有10％ FBS和1％青霉素/链霉素的RPMI 1640(Corning)阻断至少2小时(R10)。分离PBMC之后，在以下项的存在下将来自猕猴的200,000个细胞添加到每个孔中：1)对应于SARS-CoV-1、SARS-CoV-2或MERS-CoV刺突蛋白(5μg/mL/孔终浓度)的重叠肽池(15聚体和9聚体重叠)，2)含DMSO的R10(阴性对照)，3)或抗CD3阳性对照(Mabtech，1:1000稀释)。所有样品以一式三份的方式铺板。将板在37℃、5％ CO

抗原结合ELISA。在每个时间点收集血清和BAL，针对所指示的结合滴度进行评估。用1ug/mL重组SARS-CoV-2S1+S2 ECD蛋白(Sino Biological 40589-V08B1)、S1蛋白(SinoBiological 40591-V08H)、S2蛋白(Sino Biological 40590-V08B)或受体结合结构域(RBD)蛋白(Sino Biological 40595-V05H)在DPBS中将九十六孔免疫吸附板(NUNC)在4℃包被过夜。还用1ug/mL重组SARS-CoV S1蛋白(Sino Biological 40150-V08B1)和RBD蛋白(Sino Biological 40592-V08B)或MERS-CoV刺突(Sino Biological 40069-V08B)包被ELISA板。用PBS+0.05％ Tween20(PBS-T)将板洗涤四次，并且用PBS-T(5％ SM)中的5％脱脂奶在37℃阻断90分钟。将来自经INO-4800疫苗接种的猕猴的血清或BAL在5％SM中连续稀释，添加至经洗涤的ELISA板中，并且在37℃孵育1小时。孵育后，用PBS-T和缀合至辣根过氧化物酶的抗猴IgG(Southern Biotech 4700-5)将板洗涤4次。用PBS-T将板洗涤4次并且向板中添加一步TMB溶液(Sigma)。用等体积的2N硫酸终止反应。在显色30分钟内，使用BiotekSynergy2读板仪在450nm和570nm处读板。

ACE2竞争ELISA-非人类灵长类动物。将96孔半区板(Corning)用1μg/mL PolyRab抗His抗体(ThermoFisher，PA1-983B)在室温包被3小时，然后用含有1x PBS、5％脱脂牛奶、1％ FBS和0.2％ Tween-20的阻断缓冲液阻断过夜。然后将板与10μg/mL His6x标记的SARS-CoV-2(“His6x”公开为SEQ ID NO:25)、S1+S2 ECD(Sinobiological，40589-V08B1)在室温孵育1至2小时。NHP血清(第0天或第6周)用含有1％ FBS和0.2％tween的1XPBS连续稀释3倍，并且以0.4ug/ml的恒定浓度与huACE2-IgMu预混合。然后将预混合物添加至板中并在RT孵育1至2小时。将板进一步与山羊抗小鼠IgG H+L HRP(A90-116P，BethylLaboratories)以1:20,000稀释度在室温孵育1小时，然后添加一步TMB ultra底物(ThermoFisher)，并且然后用1M H

基于流式细胞术的ACE2受体结合抑制测定。使用逆转录病毒转导来生成稳定表达ACE2-GFP的HEK-293T细胞。转导后，基于GFP表达对细胞进行流式分选，以分离GFP阳性细胞。对这些细胞进行单细胞克隆，以生成具有同等ACE2-GFP表达的细胞系。为了检测对刺突与ACE2的结合的抑制，将S1+S2 ECD-his标签(Sino Biological，目录号#40589-V08B1)与在指定时间点从接种疫苗的动物收集的血清以及浓度为2.5μg/ml的稀释液在冰上孵育60分钟。然后将该混合物转移至150,000个293T-ACE2-GFP细胞中并在冰上孵育90分钟。此后，用PBS洗涤细胞2次，然后用

假病毒中和测定。使用经GeneJammer(Agilent)转染的HEK293T细胞，使用IgE-SARS-CoV-2 S质粒(Genscript)和pNL4-3.Luc.R-E-质粒(NIH AIDS reagent)，以1:1比率产生SARS-CoV-2假病毒。转染后四十八小时，收集转染上清液，用FBS富集至12％终体积，无菌过滤(Millipore Sigma)，并在-80℃等分储存。使用D10培养基(补充有10％FBS和1X青霉素-链霉素的DMEM)以96孔形式建立SARS-Cov-2假病毒中和测定。使用稳定表达Ace2的CHO细胞作为靶细胞(Creative Biolabs，目录号VCeL-Wyb019)。在72小时的感染之后，SARS-Cov-2假病毒的滴度达到仅细胞对照相对发光单位(RLU)的20倍以上。为了建立中和测定，将10,000个CHO-ACE2细胞铺板到96孔板中的100ul D10培养基中，并在37℃和5％CO2下静置过夜24小时。第二天，将来自经INO-4800疫苗接种的组和对照组的猴和兔血清热灭活并按需要连续稀释。将血清与固定量的SARS-Cov-2假病毒在RT一起孵育90分钟。从铺板的含有CHO-Ace2细胞的孔中移除50ul培养基。90分钟后，将混合物添加至铺板的CHO-Ace2细胞中，并且在标准培养箱(37％湿度，5％CO2)中孵育72小时。72小时后，使用britelite plus发光报告基因测定系统(Perkin Elmer目录号6066769)裂解细胞，并且使用Biotek读板仪测量RLU。中和滴度(ID50)使用GraphPad Prism 8计算，并且定义为在减去细胞对照孔中的背景RLU之后，与病毒对照孔中的RLU相比，RLU降低50％的倒数血清稀释度。

病毒RNA测定。利用RT-PCR测定来监测病毒载量，基本上如先前所述(Abnink P等人2019 Science)。简而言之，使用QIAcube HT(Qiagen,Germany)和Cador病原体HT试剂盒从支气管肺泡灌洗(BAL)上清液和鼻拭子中提取RNA。使用superscript VILO(Invitrogen)对RNA进行逆转录，并根据制造商的说明使用QuantStudio 6和7 Flex实时PCR系统(Applied Biosystems)进行重复运行。病毒载量按每mL或每拭子的病毒RNA拷贝计算，并且测定灵敏度为50个拷贝。用于扩增的靶标为SARS-CoV2 N(核衣壳)基因。用于靶标的引物和探针为：2019-nCoV_N1-F：5'-GACCCCAAAATCAGCGAAAT-3'(SEQ ID NO:18)；2019-nCoV_N1-R：5'-TCTGGTTACTGCCAGTTGAATCTG-3'(SEQ ID NO:19)；2019-nCoV_N1-P：5'-FAM-ACCCCGCATTACGTTTGGTGGACC-BHQ1-3'(SEQ ID NO:20)。

亚基因组mRNA测定。使用与先前所述(Wolfel等人2020,Nature,581,465-469)相似的方法，通过RT-PCR评定SARS-CoV-2E基因亚基因组mRNA(sgmRNA)。为了生成标准曲线，将SARS-CoV-2E基因sgmRNA克隆到pcDNA3.1表达质粒中；使用AmpliCap-Max T7高产信息制作试剂盒(Cellscript)转录此插入片段以获得标准RNA。在RT-PCR之前，根据制造商的说明，使用Superscript III VILO(Invitrogen)对从受攻击的动物收集的样品或标准品进行逆转录。使用靶向E基因sgmRNA(18)的序列设计了Taqman定制基因表达测定(ThermoFisherScientific)。根据制造商的规定，在QuantStudio6和7Flex实时PCR系统(AppliedBiosystems)上进行反应。使用标准曲线来计算每ml或每拭子的sgmRNA拷贝；定量测定灵敏度为每ml或每拭子50个拷贝。

结果

在经INO-4800免疫的非人灵长类动物中诱导记忆性体液和细胞免疫应答。非人灵长类动物(NHP)是COVID-19疫苗和治疗剂的开发中的宝贵模型，因为它们可以感染野生型SARS-CoV-2，并呈现出与人类相似的病理学(Chandrashekar et al.,2020,Science,eabc4776；Qin et al.,2005,J Pathol 206,251-259；Yao et al.,2014,J Infect Dis209,236-242；Yu et al.,2020,Science,eabc6284)。恒河猴(n＝5)在第0周和第4周接受INO-4800(1mg)的两次免疫(图33A)。原初对照动物(n＝5)未接受疫苗。进行对于记忆应答的初次免疫后的15周(约4个月)内，监测体液和细胞免疫应答。所有动物在单次INO-4800免疫后发生血清转化，其中检测到针对SARS-CoV-2S蛋白的全长S1+S2细胞外结构域(ECD)、S1、S2和RBD区的血清IgG滴度(图33B和图33C)。还检测到针对SARS-CoV S1蛋白和RBD的交叉反应性抗体，但未检测到针对MERS-CoV的交叉反应性抗体(图34)。免疫后第8周，在支气管肺泡灌洗(BAL)洗出液中检测到针对ECD和RBD的SARS-CoV-2反应性IgG(图34)。

在免疫后>4个月的时间内，在动物的血清样品中检测到SARS-CoV-2假病毒中和活性(图33D)，表明记忆滴度与其他报告的在猕猴中的急性保护研究(Gao et al.,2020,Science 369,77-81；Tian et al.,2020,Emerg Microbes Infect,9:382-385；vanDoremalen et al.,2020,bioRxiv 2020.05.13.093195；Yu et al.,2020,Science,eabc6284)中观察到的和针对恢复期人类报告的那些相当(Ni et al.,2020,Immunity 52,971-977e973；Robbiani et al.,2020,Nature,s41586-020-2456-9)。在COVID-19大流行期间，出现了D614G SARS-CoV-2刺突变种，该变种具有潜在的更强感染性，目前占新分离株的>80％(Korber B et al.,2020,Cell 182:1-16)。有人担心，在该变种出现之前开发的疫苗可能无法中和D614G病毒。因此，使用表达G614刺突蛋白的经修饰的假病毒来评估针对该新变种的中和作用(图33E)。针对D614和G614刺突两者观察到相似的中和ID50滴度，支持INO-4800诱导针对目前占主导地位的SARS-CoV-2变种的功能性抗体应答。

为了进一步研究中和活性，还使用ACE2竞争ELISA测试了血清，其中来自80％的经免疫的NHP的血清抑制了SARS-CoV-2刺突-ACE2相互作用(图33F)。100％的猕猴在流式细胞术ACE2-293T抑制测定中有应答，其中在1:10稀释度下对刺突-ACE2相互作用有53％-96％的抑制，在1:30稀释度下有24％-53％的抑制(图33G)。

INO-4800免疫还诱导针对所有5个肽池的SARS-CoV-2S抗原反应性T细胞应答，其中T细胞应答在第6周即第二次免疫后两周达到峰值(0-518SFU/百万个细胞)(图33H)。检测到针对RBD和S2区的不同的免疫原性表位应答(图33B)。还检测到针对SARS-CoV刺突蛋白的交叉反应性T细胞应答(图36A)。然而，没有观察到对于MERS-CoV刺突肽的交叉反应性，这支持SARS-CoV-2与MERS-CoV之间的较低序列同源性(图36B)。

在非人类灵长类动物中，疫苗在SARS-CoV-2攻击时诱导记忆召回。最终免疫后13周(约3个月)，用SARS-CoV-2攻击经疫苗免疫的猕猴以及未接种疫苗的对照(研究第17周，图37A)。如先前所述，NHP通过鼻内和气管内接种来接受1.1x10

在攻击之前和之后评估细胞应答。在第15周，IFN-γELISpot应答自在第6周观察到的峰值应答以来显著收缩。攻击后，疫苗接种组的T细胞应答增加(约218.36SFU/百万个细胞)，意味着免疫学T细胞记忆的召回(图38和图39)。

SARS-CoV-2攻击后的保护功效。在病毒输入攻击后的较早时间点，病毒mRNA检测无法在输入攻击接种物与主动感染之间进行区分，而sgmRNA水平更可能表示活跃的细胞SARS-CoV-2复制(Wolfel et al.,2020,Nature,581,465-469；Yu et al.,2020,Science,eabc6284)。在用1.1x10

应当理解，前述详细描述和所附实施例仅是说明性的，并且不应被视为对本发明范围的限制，本发明的范围仅由所附权利要求书及其等同物限定。

对公开的实施例的各种改变和修改对于本领域的技术人员来说将是显而易见的。可以在不脱离本发明的精神和范围的情况下进行此类变化和修改，包含但不限于与本发明的化学结构、取代基、衍生物、中间体、合成、组合物、调配物或使用方法有关的变化和修改。

序列

pGX9501的SARS-CoV-2共有刺突抗原氨基酸插入序列(SEQ ID NO:1)(IgE前导序列加下划线)：

1

61 FLPFFSNVTW FHAIHVSGTN GTKRFDNPVL PFNDGVYFAS TEKSNIIRGW IFGTTLDSKT

121 QSLLIVNNAT NVVIKVCEFQ FCNDPFLGVY YHKNNKSWME SEFRVYSSAN NCTFEYVSQP

181 FLMDLEGKQG NFKNLREFVF KNIDGYFKIY SKHTPINLVR DLPQGFSALE PLVDLPIGIN

241 ITRFQTLLAL HRSYLTPGDS SSGWTAGAAA YYVGYLQPRT FLLKYNENGT ITDAVDCALD

301 PLSETKCTLK SFTVEKGIYQ TSNFRVQPTE SIVRFPNITN LCPFGEVFNA TRFASVYAWN

361 RKRISNCVAD YSVLYNSASF STFKCYGVSP TKLNDLCFTN VYADSFVIRG DEVRQIAPGQ

421 TGKIADYNYK LPDDFTGCVI AWNSNNLDSK VGGNYNYLYR LFRKSNLKPF ERDISTEIYQ

481 AGSTPCNGVE GFNCYFPLQS YGFQPTNGVG YQPYRVVVLS FELLHAPATV CGPKKSTNLV

541 KNKCVNFNFN GLTGTGVLTE SNKKFLPFQQ FGRDIADTTD AVRDPQTLEI LDITPCSFGG

601 VSVITPGTNT SNQVAVLYQD VNCTEVPVAI HADQLTPTWR VYSTGSNVFQ TRAGCLIGAE

661 HVNNSYECDIPIGAGICASY QTQTNSPRRA RSVASQSIIA YTMSLGAENS VAYSNNSIAI

721 PTNFTISVTT EILPVSMTKT SVDCTMYICG DSTECSNLLL QYGSFCTQLN RALTGIAVEQ

781 DKNTQEVFAQ VKQIYKTPPI KDFGGFNFSQ ILPDPSKPSK RSFIEDLLFN KVTLADAGFI

841 KQYGDCLGDI AARDLICAQK FNGLTVLPPL LTDEMIAQYT SALLAGTITS GWTFGAGAAL

901 QIPFAMQMAY RFNGIGVTQN VLYENQKLIA NQFNSAIGKIQDSLSSTASA LGKLQDVVNQ

961 NAQALNTLVK QLSSNFGAIS SVLNDILSRL DKVEAEVQID RLITGRLQSL QTYVTQQLIR

1021 AAEIRASANL AATKMSECVL GQSKRVDFCG KGYHLMSFPQ SAPHGVVFLHVTYVPAQEKN

1081 FTTAPAICHD GKAHFPREGV FVSNGTHWFV TQRNFYEPQI ITTDNTFVSGNCDVVIGIVN

1141 NTVYDPLQPE LDSFKEELDK YFKNHTSPDV DLGDISGINA SVVNIQKEIDRLNEVAKNLN

1201 ESLIDLQELG KYEQYIKWPW YIWLGFIAGL IAIVMVTIML CCMTSCCSCLKGCCSCGSCC

1261 KFDEDDSEPV LKGVKLHYT

pGX9501的DNA插入序列(SEQ ID NO:2)(IgE前导序列加下划线)：

1

61 TGTGTGAACC TGACCACCAG AACACAGCTG CCTCCTGCCT ACACCAACAG CTTCACCAGA

121 GGAGTCTACT ACCCAGACAA AGTCTTCAGA AGCTCTGTGC TGCACAGCAC CCAGGACCTG

181 TTCCTGCCTT TCTTCAGCAA CGTGACCTGG TTCCACGCCA TCCACGTGTC TGGCACCAAC

241 GGCACCAAGA GATTTGACAA CCCTGTTCTT CCTTTCAATG ATGGCGTGTA CTTTGCCAGC

301 ACAGAGAAGA GCAACATCAT CCGAGGCTGG ATCTTTGGCA CCACCCTGGA CAGCAAAACC

361 CAGAGCCTGC TGATCGTGAA CAACGCCACC AACGTGGTCA TCAAGGTGTG TGAGTTCCAG

421 TTCTGCAATG ACCCTTTCCT GGGCGTGTAC TACCACAAGA ACAACAAGTC CTGGATGGAG

481 TCTGAGTTCA GAGTCTACAG CTCTGCCAAC AACTGCACAT TTGAATATGT GTCCCAGCCT

541 TTCCTGATGG ACCTGGAGGG CAAGCAGGGC AACTTTAAGA ACCTGAGAGA ATTTGTGTTC

601 AAGAACATCG ATGGCTACTT CAAGATCTAC AGCAAGCACA CACCCATCAA CCTGGTGAGA

661 GACCTGCCTC AGGGCTTCTC TGCCCTGGAG CCTCTGGTGG ACCTGCCCAT CGGCATCAAC

721 ATCACCAGAT TCCAGACCCT GCTGGCCCTG CACAGAAGCT ACCTGACCCC AGGAGACAGC

781 AGCAGCGGCT GGACAGCTGG AGCTGCTGCC TACTACGTGG GCTACCTGCA GCCCAGGACC

841 TTCCTGCTGA AGTACAACGA AAATGGCACC ATCACAGATG CTGTTGACTG TGCCCTGGAC

901 CCTCTTAGCG AGACCAAGTG CACCCTGAAG TCCTTCACAG TGGAGAAAGG CATCTACCAG

961 ACCAGCAACT TCCGAGTGCA GCCAACAGAG AGCATCGTGA GATTTCCAAA CATCACCAAC

1021 CTGTGCCCTT TTGGAGAAGT CTTCAATGCC ACCAGATTTG CTTCTGTGTACGCCTGGAAC

1081 AGAAAAAGAA TCAGCAACTG TGTGGCTGAC TACTCTGTGC TGTACAACTCTGCCTCCTTC

1141 TCCACCTTCA AGTGCTATGG AGTCTCTCCA ACCAAGCTGA ATGACCTGTGCTTCACCAAC

1201 GTGTATGCTG ACAGCTTTGT GATCAGAGGA GATGAAGTGC GGCAGATTGCTCCTGGCCAG

1261 ACAGGCAAGA TTGCTGACTA CAACTACAAG CTGCCTGATG ACTTCACAGGCTGTGTCATC

1321 GCCTGGAACA GCAACAACCT GGACAGCAAG GTGGGCGGCA ACTACAACTACCTGTACAGA

1381 CTTTTCAGGA AGAGCAACCT GAAGCCTTTT GAAAGAGACA TCTCCACAGAGATCTACCAG

1441 GCTGGCAGCA CACCCTGCAA TGGTGTGGAA GGCTTCAACT GCTACTTCCCTCTGCAGAGC

1501 TACGGCTTCC AGCCAACAAA TGGCGTGGGC TACCAGCCTT ACAGAGTGGTGGTGCTGTCC

1561 TTTGAGCTGC TGCACGCCCC TGCCACAGTG TGTGGCCCCA AGAAGAGCACCAACCTGGTG

1621 AAGAACAAAT GTGTGAACTT CAATTTCAAT GGCCTGACAG GCACAGGAGTGCTGACAGAG

1681 AGCAACAAGA AGTTTCTTCC TTTCCAGCAG TTTGGAAGAG ACATTGCTGACACCACAGAT

1741 GCTGTGAGAG ATCCTCAGAC CCTGGAGATC CTGGATATCA CACCCTGCTCCTTTGGAGGA

1801 GTTTCTGTCA TCACACCTGG CACCAATACC AGCAACCAAG TGGCTGTGCTGTACCAAGAT

1861 GTGAATTGCA CAGAAGTGCC TGTGGCCATC CACGCTGACC AGCTGACACCCACCTGGAGA

1921 GTGTACAGCA CAGGCAGCAA TGTTTTCCAG ACAAGAGCTG GCTGCCTGATTGGAGCAGAG

1981 CACGTGAACA ACAGCTATGA ATGTGACATC CCTATTGGAG CTGGCATCTGTGCCAGCTAC

2041 CAGACCCAAA CCAACAGCCC AAGAAGAGCC AGATCTGTGG CCAGCCAGAGCATCATCGCC

2101 TACACCATGA GCCTGGGAGC TGAGAACTCT GTGGCCTACA GCAACAACAGCATCGCCATC

2161 CCCACCAACT TCACCATCTC TGTGACCACA GAGATCCTGC CTGTGTCCATGACCAAGACA

2221 TCTGTGGACT GCACCATGTA CATCTGTGGA GACAGCACAG AATGCAGCAACCTGCTGCTG

2281 CAGTACGGCT CCTTCTGCAC CCAGCTGAAC AGAGCCCTGA CAGGCATCGCTGTGGAGCAG

2341 GACAAGAACA CACAGGAAGT GTTTGCCCAG GTGAAGCAGA TCTACAAAACACCACCCATC

2401 AAGGACTTTG GAGGCTTCAA TTTCTCCCAA ATCCTGCCTG ACCCCAGCAAGCCTTCCAAG

2461 AGAAGCTTCA TTGAAGACCT GCTGTTCAAC AAAGTGACCC TGGCTGATGCTGGCTTCATC

2521 AAGCAGTATG GAGACTGCCT GGGAGACATT GCTGCCAGAG ACCTGATCTGTGCCCAGAAG

2581 TTTAATGGCC TGACTGTGCT GCCTCCTCTG CTGACAGATG AAATGATCGCCCAGTACACA

2641 TCTGCCCTGC TGGCTGGCAC CATCACCAGT GGCTGGACAT TTGGAGCTGGAGCTGCCCTG

2701 CAGATCCCTT TTGCCATGCA GATGGCCTAC AGATTTAATG GCATCGGCGTGACCCAGAAC

2761 GTGCTGTACG AGAACCAGAA GCTGATCGCC AACCAGTTCA ACTCTGCCATCGGCAAGATC

2821 CAGGACAGCC TGAGCAGCAC AGCCTCTGCC CTGGGCAAGC TGCAGGATGTGGTGAACCAA

2881 AACGCCCAGG CCCTGAACAC CCTGGTGAAG CAGCTGAGCA GCAACTTTGGAGCCATCTCC

2941 TCTGTGCTGA ATGACATCCT GAGCCGGCTG GACAAGGTGG AAGCAGAAGTGCAGATCGAC

3001 AGACTCATCA CAGGCCGCCT GCAGAGCCTG CAGACCTACG TGACCCAGCAGCTGATCAGA

3061 GCTGCTGAGA TCCGGGCCTC TGCCAACCTG GCTGCCACCA AGATGTCAGAATGTGTGCTG

3121 GGCCAGAGCA AAAGAGTGGA CTTCTGTGGC AAAGGCTACC ACCTGATGTCCTTCCCTCAG

3181 TCTGCTCCTC ACGGCGTGGT GTTCCTGCAC GTGACCTACG TGCCTGCCCAGGAGAAGAAC

3241 TTCACCACAG CTCCTGCCAT CTGCCACGAT GGCAAGGCCC ACTTCCCAAGAGAAGGTGTC

3301 TTTGTGTCCA ATGGCACCCA CTGGTTCGTG ACCCAGAGAA ACTTCTACGAGCCTCAGATC

3361 ATCACCACAG ACAACACATT TGTGTCTGGC AACTGTGATG TGGTCATCGGCATCGTGAAC

3421 AACACAGTTT ATGACCCTCT GCAGCCTGAG CTGGACAGCT TCAAAGAAGAGCTGGACAAG

3481 TACTTCAAGA ACCACACATC TCCAGATGTG GACCTGGGAG ACATCTCTGGCATCAATGCC

3541 TCTGTGGTGA ACATCCAGAA GGAAATTGAC AGGCTGAACG AAGTGGCCAAGAACCTGAAC

3601 GAAAGCCTCA TCGACCTGCA GGAGCTGGGC AAGTACGAGC AGTACATCAAGTGGCCTTGG

3661 TACATCTGGC TGGGCTTCAT CGCTGGCCTC ATCGCCATCG TGATGGTGACCATCATGCTG

3721 TGCTGCATGA CCAGCTGCTG CTCTTGCCTG AAGGGCTGCT GCAGCTGTGGCAGCTGCTGC

3781 AAGTTTGATG AAGATGACTC TGAGCCTGTG CTGAAGGGCG TGAAGCTGCA CTACACA

pGX9501的单链DNA序列(SEQ ID NO:3)：

1 gctgcttcgc gatgtacggg ccagatatac gcgttgacat tgattattga ctagttatta

61 atagtaatca attacggggt cattagttca tagcccatat atggagttcc gcgttacata

121 acttacggta aatggcccgc ctggctgacc gcccaacgac ccccgcccat tgacgtcaat

181 aatgacgtat gttcccatag taacgccaat agggactttc cattgacgtc aatgggtgga

241 gtatttacgg taaactgccc acttggcagt acatcaagtg tatcatatgc caagtacgcc

301 ccctattgac gtcaatgacg gtaaatggcc cgcctggcat tatgcccagt acatgacctt

361 atgggacttt cctacttggc agtacatcta cgtattagtc atcgctatta ccatggtgat

421 gcggttttgg cagtacatca atgggcgtgg atagcggttt gactcacggg gatttccaag

481 tctccacccc attgacgtca atgggagttt gttttggcac caaaatcaac gggactttcc

541 aaaatgtcgt aacaactccg ccccattgac gcaaatgggc ggtaggcgtg tacggtggga

601 ggtctatata agcagagctc tctggctaac tagagaaccc actgcttact ggcttatcga

661 aattaatacg actcactata gggagaccca agctggctag cgtttaaact taagcttggt

721 accgagctcg gatccgccac catggattgg acttggattc tctttctcgt tgctgcagcc

781 acacgcgttc atagcagcca gtgtgtgaac ctgaccacca gaacacagct gcctcctgcc

841 tacaccaaca gcttcaccag aggagtctac tacccagaca aagtcttcag aagctctgtg

901 ctgcacagca cccaggacct gttcctgcct ttcttcagca acgtgacctg gttccacgcc

961 atccacgtgt ctggcaccaa cggcaccaag agatttgaca accctgttct tcctttcaat

1021 gatggcgtgt actttgccag cacagagaag agcaacatca tccgaggctggatctttggc

1081 accaccctgg acagcaaaac ccagagcctg ctgatcgtga acaacgccaccaacgtggtc

1141 atcaaggtgt gtgagttcca gttctgcaat gaccctttcc tgggcgtgtactaccacaag

1201 aacaacaagt cctggatgga gtctgagttc agagtctaca gctctgccaacaactgcaca

1261 tttgaatatg tgtcccagcc tttcctgatg gacctggagg gcaagcagggcaactttaag

1321 aacctgagag aatttgtgtt caagaacatc gatggctact tcaagatctacagcaagcac

1381 acacccatca acctggtgag agacctgcct cagggcttct ctgccctggagcctctggtg

1441 gacctgccca tcggcatcaa catcaccaga ttccagaccc tgctggccctgcacagaagc

1501 tacctgaccc caggagacag cagcagcggc tggacagctg gagctgctgcctactacgtg

1561 ggctacctgc agcccaggac cttcctgctg aagtacaacg aaaatggcaccatcacagat

1621 gctgttgact gtgccctgga ccctcttagc gagaccaagt gcaccctgaagtccttcaca

1681 gtggagaaag gcatctacca gaccagcaac ttccgagtgc agccaacagagagcatcgtg

1741 agatttccaa acatcaccaa cctgtgccct tttggagaag tcttcaatgccaccagattt

1801 gcttctgtgt acgcctggaa cagaaaaaga atcagcaact gtgtggctgactactctgtg

1861 ctgtacaact ctgcctcctt ctccaccttc aagtgctatg gagtctctccaaccaagctg

1921 aatgacctgt gcttcaccaa cgtgtatgct gacagctttg tgatcagaggagatgaagtg

1981 cggcagattg ctcctggcca gacaggcaag attgctgact acaactacaagctgcctgat

2041 gacttcacag gctgtgtcat cgcctggaac agcaacaacc tggacagcaaggtgggcggc

2101 aactacaact acctgtacag acttttcagg aagagcaacc tgaagccttttgaaagagac

2161 atctccacag agatctacca ggctggcagc acaccctgca atggtgtggaaggcttcaac

2221 tgctacttcc ctctgcagag ctacggcttc cagccaacaa atggcgtgggctaccagcct

2281 tacagagtgg tggtgctgtc ctttgagctg ctgcacgccc ctgccacagtgtgtggcccc

2341 aagaagagca ccaacctggt gaagaacaaa tgtgtgaact tcaatttcaatggcctgaca

2401 ggcacaggag tgctgacaga gagcaacaag aagtttcttc ctttccagcagtttggaaga

2461 gacattgctg acaccacaga tgctgtgaga gatcctcaga ccctggagatcctggatatc

2521 acaccctgct cctttggagg agtttctgtc atcacacctg gcaccaataccagcaaccaa

2581 gtggctgtgc tgtaccaaga tgtgaattgc acagaagtgc ctgtggccatccacgctgac

2641 cagctgacac ccacctggag agtgtacagc acaggcagca atgttttccagacaagagct

2701 ggctgcctga ttggagcaga gcacgtgaac aacagctatg aatgtgacatccctattgga

2761 gctggcatct gtgccagcta ccagacccaa accaacagcc caagaagagccagatctgtg

2821 gccagccaga gcatcatcgc ctacaccatg agcctgggag ctgagaactctgtggcctac

2881 agcaacaaca gcatcgccat ccccaccaac ttcaccatct ctgtgaccacagagatcctg

2941 cctgtgtcca tgaccaagac atctgtggac tgcaccatgt acatctgtggagacagcaca

3001 gaatgcagca acctgctgct gcagtacggc tccttctgca cccagctgaacagagccctg

3061 acaggcatcg ctgtggagca ggacaagaac acacaggaag tgtttgcccaggtgaagcag

3121 atctacaaaa caccacccat caaggacttt ggaggcttca atttctcccaaatcctgcct

3181 gaccccagca agccttccaa gagaagcttc attgaagacc tgctgttcaacaaagtgacc

3241 ctggctgatg ctggcttcat caagcagtat ggagactgcc tgggagacattgctgccaga

3301 gacctgatct gtgcccagaa gtttaatggc ctgactgtgc tgcctcctctgctgacagat

3361 gaaatgatcg cccagtacac atctgccctg ctggctggca ccatcaccagtggctggaca

3421 tttggagctg gagctgccct gcagatccct tttgccatgc agatggcctacagatttaat

3481 ggcatcggcg tgacccagaa cgtgctgtac gagaaccaga agctgatcgccaaccagttc

3541 aactctgcca tcggcaagat ccaggacagc ctgagcagca cagcctctgccctgggcaag

3601 ctgcaggatg tggtgaacca aaacgcccag gccctgaaca ccctggtgaagcagctgagc

3661 agcaactttg gagccatctc ctctgtgctg aatgacatcc tgagccggctggacaaggtg

3721 gaagcagaag tgcagatcga cagactcatc acaggccgcc tgcagagcctgcagacctac

3781 gtgacccagc agctgatcag agctgctgag atccgggcct ctgccaacctggctgccacc

3841 aagatgtcag aatgtgtgct gggccagagc aaaagagtgg acttctgtggcaaaggctac

3901 cacctgatgt ccttccctca gtctgctcct cacggcgtgg tgttcctgcacgtgacctac

3961 gtgcctgccc aggagaagaa cttcaccaca gctcctgcca tctgccacgatggcaaggcc

4021 cacttcccaa gagaaggtgt ctttgtgtcc aatggcaccc actggttcgtgacccagaga

4081 aacttctacg agcctcagat catcaccaca gacaacacat ttgtgtctggcaactgtgat

4141 gtggtcatcg gcatcgtgaa caacacagtt tatgaccctc tgcagcctgagctggacagc

4201 ttcaaagaag agctggacaa gtacttcaag aaccacacat ctccagatgtggacctggga

4261 gacatctctg gcatcaatgc ctctgtggtg aacatccaga aggaaattgacaggctgaac

4321 gaagtggcca agaacctgaa cgaaagcctc atcgacctgc aggagctgggcaagtacgag

4381 cagtacatca agtggccttg gtacatctgg ctgggcttca tcgctggcctcatcgccatc

4441 gtgatggtga ccatcatgct gtgctgcatg accagctgct gctcttgcctgaagggctgc

4501 tgcagctgtg gcagctgctg caagtttgat gaagatgact ctgagcctgtgctgaagggc

4561 gtgaagctgc actacacatg ataactcgag tctagagggc ccgtttaaacccgctgatca

4621 gcctcgactg tgccttctag ttgccagcca tctgttgttt gcccctcccccgtgccttcc

4681 ttgaccctgg aaggtgccac tcccactgtc ctttcctaat aaaatgaggaaattgcatcg

4741 cattgtctga gtaggtgtca ttctattctg gggggtgggg tggggcaggacagcaagggg

4801 gaggattggg aagacaatag caggcatgct ggggatgcgg tgggctctatggcttctact

4861 gggcggtttt atggacagca agcgaaccgg aattgccagc tggggcgccctctggtaagg

4921 ttgggaagcc ctgcaaagta aactggatgg ctttcttgcc gccaaggatctgatggcgca

4981 ggggatcaag ctctgatcaa gagacaggat gaggatcgtt tcgcatgattgaacaagatg

5041 gattgcacgc aggttctccg gccgcttggg tggagaggct attcggctatgactgggcac

5101 aacagacaat cggctgctct gatgccgccg tgttccggct gtcagcgcaggggcgcccgg

5161 ttctttttgt caagaccgac ctgtccggtg ccctgaatga actgcaagacgaggcagcgc

5221 ggctatcgtg gctggccacg acgggcgttc cttgcgcagc tgtgctcgacgttgtcactg

5281 aagcgggaag ggactggctg ctattgggcg aagtgccggg gcaggatctcctgtcatctc

5341 accttgctcc tgccgagaaa gtatccatca tggctgatgc aatgcggcggctgcatacgc

5401 ttgatccggc tacctgccca ttcgaccacc aagcgaaaca tcgcatcgagcgagcacgta

5461 ctcggatgga agccggtctt gtcgatcagg atgatctgga cgaagagcatcaggggctcg

5521 cgccagccga actgttcgcc aggctcaagg cgagcatgcc cgacggcgaggatctcgtcg

5581 tgacccatgg cgatgcctgc ttgccgaata tcatggtgga aaatggccgcttttctggat

5641 tcatcgactg tggccggctg ggtgtggcgg accgctatca ggacatagcgttggctaccc

5701 gtgatattgc tgaagagctt ggcggcgaat gggctgaccg cttcctcgtgctttacggta

5761 tcgccgctcc cgattcgcag cgcatcgcct tctatcgcct tcttgacgagttcttctgaa

5821 ttattaacgc ttacaatttc ctgatgcggt attttctcct tacgcatctgtgcggtattt

5881 cacaccgcat caggtggcac ttttcgggga aatgtgcgcg gaacccctatttgtttattt

5941 ttctaaatac attcaaatat gtatccgctc atgagacaat aaccctgataaatgcttcaa

6001 taatagcacg tgctaaaact tcatttttaa tttaaaagga tctaggtgaagatccttttt

6061 gataatctca tgaccaaaat cccttaacgt gagttttcgt tccactgagcgtcagacccc

6121 gtagaaaaga tcaaaggatc ttcttgagat cctttttttc tgcgcgtaatctgctgcttg

6181 caaacaaaaa aaccaccgct accagcggtg gtttgtttgc cggatcaagagctaccaact

6241 ctttttccga aggtaactgg cttcagcaga gcgcagatac caaatactgttcttctagtg

6301 tagccgtagt taggccacca cttcaagaac tctgtagcac cgcctacatacctcgctctg

6361 ctaatcctgt taccagtggc tgctgccagt ggcgataagt cgtgtcttaccgggttggac

6421 tcaagacgat agttaccgga taaggcgcag cggtcgggct gaacggggggttcgtgcaca

6481 cagcccagct tggagcgaac gacctacacc gaactgagat acctacagcgtgagctatga

6541 gaaagcgcca cgcttcccga agggagaaag gcggacaggt atccggtaagcggcagggtc

6601 ggaacaggag agcgcacgag ggagcttcca gggggaaacg cctggtatctttatagtcct

6661 gtcgggtttc gccacctctg acttgagcgt cgatttttgt gatgctcgtcaggggggcgg

6721 agcctatgga aaaacgccag caacgcggcc tttttacggt tcctggccttttgctggcct

6781 tttgctcaca tgttctt

pGX9503的SARS-CoV-2异常刺突抗原氨基酸插入序列(SEQ ID NO:4)(IgE前导序列加下划线):

1

61 FLPFFSNVTW FHAIHVSGTN GTKRFDNPVL PFNDGVYFAS TEKSNIIRGW IFGTTLDSKT

121 QSLLIVNNAT NVVIKVCEFQ FCNDPFLGVY YHKNNKSWME SEFRVYSSAN NCTFEYVSQP

181 FLMDLEGKQG NFKNLREFVF KNIDGYFKIY SKHTPINLVR DLPQGFSALE PLVDLPIGIN

241 ITRFQTLLAL HRSYLTPGDS SSGWTAGAAA YYVGYLQPRT FLLKYNENGT ITVAVACALD

301 PLSETKCTLK SFTVEKGIYQ TSNFRVQPTE SIVRFPNITN LCPFGEVFNA TRFASVYAWN

361 RKRISNCVAD YSVLYNSASF STFKCYGVSP TKLNDLCFTN VYADSFVIRG DEVRQIAPGQ

421 TGKIADYNYK LPDDFTGCVI AWNSNNLDSK VGGNYNYLYR LFRKSNLKPF ERDISTEIYQ

481 AGSTPCNGVE GFNCYFPLQS YGFQPTNGVG YQPYRVVVLS FELLHAPATV CGPKKSTNLV

541 KNKCVNFNFN GLTGTGVLTE SNKKFLPFQQ FGRDIADTTD AVRDPQTLEI LDITPCSFGG

601 VSVITPGANT SNQVTVLYQD VNCTEVPVAI HADQLTPTWR VYSTGSNVFK TRAGCLIGAE

661 HVNNSYECDIPIGAGICASY QTQTNSPRRA RSTASQSIIA YTMSLGAENS VAYSNNSIVI

721 PTNFTISVTT EILPVSMTKT SVDCTMYICSDSTECSNPLL QYGSFCTQLN RALTGIAVEQ

781 DKNTQEVFAQ VKQIYKTPPI KDFGGFNFSQ ILPDPSKPSK RSFIEDLLFN KVTLADAGFI

841 KQYGDCLGDI AARDLICAQK FNGLTVLPPL LTDEMIAQYT SALLAGTITS GWTFGAGAAL

901 QIPFAMQMAY RFNGIRVTQN VLYENQKLIA NQFNSAIGKIQDSLSSTASA LGKLQDVVNQ

961 NAQALNTLVK QLSSTFSTIS SVLNDILSRL DKVEAEVQID RLITGRLQSL QTYVTQQLIR

1021 AAEIRASANL KATKMSECVL GQSKRVDFCG KGYHLMSFPQ SAPHGVVFLHVTYVPAQEKN

1081 FTTAPATCHD GKAHFPREGV FVSNGTHWFV TQRNFDEPQI ITTDNTFVSGNCDVVIGIVN

1141 NTVYDPLQPE LDSFKEELDK YFKNHTSPDV DLGDISGINA SVVNIQKEIDRLNEVAKNLN

1201 ESLIDLQELG KYEQYIKWPW YIWLGFIAGL IAIVMVTIML CCMTSCCSCLKGCCSCGSCC

1261 KFDEDDSEPV LKGVKLHYT

pGX9503的DNA插入序列(SEQ ID NO:5)(IgE前导序列加下划线)：

1

61 TGTGTGAACC TGACCACCAG AACACAGCTG CCTCCTGCCT ACACCAACAG CTTCACCAGA

121 GGAGTCTACT ACCCAGACAA GGTGTTCAGA AGCTCTGTGC TGCACAGCAC CCAGGACCTC

181 TTCCTGCCTT TCTTCAGCAA CGTGACCTGG TTCCACGCCA TCCACGTGTC TGGCACCAAC

241 GGCACCAAGA GATTTGACAA CCCTGTGCTG CCTTTCAATG ATGGTGTGTA CTTTGCCAGC

301 ACAGAGAAGA GCAACATCAT CCGAGGCTGG ATCTTTGGCA CCACCCTGGA CAGCAAAACA

361 CAGAGCCTGC TGATCGTGAA TAATGCCACC AACGTGGTCA TCAAGGTGTG TGAGTTCCAG

421 TTCTGCAATG ACCCTTTCCT GGGCGTGTAC TACCACAAGA ACAACAAGTC CTGGATGGAG

481 TCTGAGTTCC GAGTGTACAG CTCTGCCAAC AACTGCACAT TTGAATATGT GTCCCAGCCT

541 TTCCTGATGG ACCTGGAGGG CAAGCAGGGC AATTTCAAGA ACCTGAGAGA ATTTGTGTTC

601 AAGAACATCG ATGGCTACTT CAAGATCTAC AGCAAGCACA CACCCATCAA CCTGGTGAGA

661 GATCTTCCTC AGGGCTTCTC TGCCCTGGAG CCTCTGGTGG ACCTGCCCAT CGGCATCAAC

721 ATCACCCGCT TTCAGACCCT GCTGGCCCTG CACAGAAGCT ACCTGACCCC AGGAGACAGC

781 AGCAGCGGCT GGACAGCTGG AGCTGCTGCC TACTACGTGG GCTACCTGCA GCCAAGAACC

841 TTCCTGCTGA AGTACAACGA AAATGGCACC ATCACTGTGG CTGTGGCCTG TGCCCTGGAC

901 CCTCTTTCTG AGACCAAGTG CACCCTGAAG TCCTTCACAG TGGAGAAAGG CATCTACCAG

961 ACCAGCAACT TCAGAGTTCA GCCAACAGAG AGCATCGTGA GATTTCCAAA CATCACCAAC

1021 CTGTGTCCTT TTGGAGAAGT CTTCAATGCC ACCAGATTTG CTTCTGTGTACGCCTGGAAC

1081 AGAAAAAGAA TCAGCAACTG TGTGGCTGAC TACTCTGTGC TGTACAACTCTGCCTCCTTC

1141 TCCACCTTCA AGTGCTACGG TGTGTCTCCT ACCAAGCTGA ATGACCTGTGCTTCACCAAC

1201 GTGTATGCTG ACAGCTTTGT CATCAGAGGA GATGAAGTGC GGCAGATCGCCCCTGGCCAG

1261 ACAGGCAAGA TTGCTGACTA CAACTACAAG CTGCCTGATG ACTTCACAGGCTGTGTCATC

1321 GCCTGGAACA GCAACAACCT GGACAGCAAG GTGGGCGGCA ACTACAACTACCTGTACAGA

1381 C TT TTCAGGA AGAGCAACC T GAAGCC T T T T GAAAGAGACA TC TCCACAGAGATCTACCAG

1441 GCTGGCAGCA CACCCTGCAA TGGAGTGGAA GGC TTCAAC T GC TACT TCCCTCTGCAGAGC

1501 TACGGCT TCC AGCCCACCAA TGGCGTGGGC TACCAGCCT T ACAGAGTGGT GGTGCTGTCC

1561 T TTGAGC TGC TGCACGCCCC TGCCACAGTG TGTGGCCCCA AGAAGAGCAC CAACCTGGTG

1621 AAGAACAAAT GTGTGAAC T T CAAT T TCAAT GGCCTGACAG GCACAGGAGTGCTGACAGAG

1681 AGCAACAAGA AGTTCC TGCC T T TCCAGCAG T TTGGAAGAG ACAT TGCTGACACCACAGAT

1741 GCTGTGAGAG ATCC TCAGAC CC TGGAGATC C TGGACATCA CACCCTGC TC C TTTGGAGGA

1801 GTT TC TGTCA TCACACC TGG AGCCAACACC AGCAACCAAG TGACAGTGCTGTACCAAGAT

1861 GTGAACTGCA CAGAAGT TCC TGTGGCCATC CACGC TGACC AGCTGACCCCAACCTGGAGA

1921 GTC TACAGCA CAGGCAGCAA CGTGT T TAAA ACAAGAGCTG GC TGCC TGATTGGAGCAGAG

1981 CACGTGAACA ACAGCTATGA ATGTGACATC CCTAT TGGAG CTGGCATC TG TGCCAGCTAC

2041 CAGACCCAAA CCAACAGCCC AAGAAGAGCC AGGAGCACAG CCAGCCAGAGCATCATCGCC

2101 TACACCATGA GCCTGGGAGC AGAGAAC TC T GTGGCCTACA GCAACAACAGCATCGTCATC

2161 CCCACCAAC T TCACCATC TC TGTGACCACA GAGATCC TGC CTGTGTCCATGACCAAGACA

2221 TCTGTGGAC T GCACCATGTA CATC TGCAGT GACAGCACAG AATGCAGCAA CCC TCTGCTG

2281 CAGTACGGC T CC TTCTGCAC CCAGC TGAAC AGAGCCC TGA CAGGCATCGCTGTGGAGCAG

2341 GACAAGAACA CACAGGAAGT GT T TGCCCAG GTGAAGCAGA TC TACAAAACACCACCCATC

2401 AAGGACT TTG GAGGCT TCAA C T TC TCCCAG ATCCTGCCTG ACCCCAGCAAGCCCAGCAAG

2461 AGAAGCT TCA TTGAAGACC T GC TGT TCAAC AAAGTGACCC TGGC TGATGCTGGCT TCATC

2521 AAACAATATG GAGACTGCC T GGGAGACAT T GCTGCCAGAG ACCTGATC TGTGCCCAGAAG

2581 T TTAATGGCC TGAC TGTGC T GCC TCC TC TG C TGACAGATG AAATGATCGCCCAGTACACA

2641 TCTGCCC TGC TGGC TGGCAC CATCACATC T GGC TGGACAT TTGGAGCTGG AGCTGCCCTG

2701 CAGATCCCT T TTGCCATGCA GATGGCC TAC AGATT TAATG GCATCAGAGTGACCCAGAAC

2761 GTGCTGTATG AAAACCAGAA GC TGATCGCC AACCAGT TCA AC TC TGCCATCGGCAAGATC

2821 CAGGACAGCC TGAGCAGCAC AGCC TC TGCC C TGGGCAAGC TGCAGGATGTGGTGAACCAA

2881 AATGCCCAGG CCCTGAACAC CC TGGTGAAG CAGCTGAGCA GCACCT TC TCCACCATC TCC

2941 AGCGTGC TGA ATGACATCC T GAGCCGGC TG GACAAGGTGG AAGC TGAGGTGCAGATCGAC

3001 AGACTCATCA CAGGCCGGC T GCAGAGCC TG CAGACCTACG TGACCCAGCAGCTGATCAGA

3061 GCTGC TGAGA TCAGAGC T TC TGCCAACC TG AAGGCCACCA AGATGTCAGAATGTGTGCTG

3121 GGCCAGAGCA AGAGAGTGGA C T TC TGTGGC AAAGGCTACC ACCTGATGTC CTTCCCTCAG

3181 TCTGC TCCTC ACGGCGTGGT GT TCC TGCAC GTGACCTACG TGCC TGCCCAGGAGAAGAAC

3241 T TCACCACAG CTCC TGCCAC C TGCCACGAT GGCAAAGCCC AC TTCCCAAGAGAAGGCGTC

3301 T TTGTGTCCA ATGGCACCCA C TGGT TCGTG ACCCAGAGAA AC TT TGATGA GCCTCAGATC

3361 ATCACCACAG ACAACACAT T TGT T TC TGGC AAC TGTGATG TGGTCATCGGCATCGTGAAC

3421 AACACAGTT T ATGACCC TC T GCAGCC TGAG C TGGACAGC T TCAAAGAAGAGCTGGACAAG

3481 TAC TTCAAGA ACCACACATC TCCAGATGTG GACCTGGGAG ACATCTCTGGCATCAATGCC

3541 TCTGTGGTGA ACATCCAGAA GGAAAT TGAC AGGCTGAACG AAGTGGCCAA GAACCTGAAC

3601 GAAAGCC TCA TCGACC TGCA GGAGC TGGGC AAGTACGAGC AGTACATCAAGTGGCCT TGG

3661 TACATCTGGC TGGGCT TCAT TGC TGGCC TC ATCGCCATCG TGATGGTGACCATCATGCTG

3721 TGC TGCATGA CCAGCTGC TG C TC T TGCC TG AAGGGCTGC T GCAGCTGTGGCAGCTGC TGC

3781 AAGTTTGATG AAGATGACTC TGAGCCTGTG CTGAAGGGCG TGAAGCTGCA CTACACA

pGX9503(SEQ ID NO:6)的单链DNA序列：

1 gctgcttcgc gatgtacggg ccagatatac gcgttgacat tgattattga ctagttatta

61 atagtaatca attacggggt cattagttca tagcccatat atggagttcc gcgttacata

121 acttacggta aatggcccgc ctggctgacc gcccaacgac ccccgcccat tgacgtcaat

181 aatgacgtat gttcccatag taacgccaat agggactttc cattgacgtc aatgggtgga

241 gtatttacgg taaactgccc acttggcagt acatcaagtg tatcatatgc caagtacgcc

301 ccctattgac gtcaatgacg gtaaatggcc cgcctggcat tatgcccagt acatgacctt

361 atgggacttt cctacttggc agtacatcta cgtattagtc atcgctatta ccatggtgat

421 gcggttttgg cagtacatca atgggcgtgg atagcggttt gactcacggg gatttccaag

481 tctccacccc attgacgtca atgggagttt gttttggcac caaaatcaac gggactttcc

541 aaaatgtcgt aacaactccg ccccattgac gcaaatgggc ggtaggcgtg tacggtggga

601 ggtctatata agcagagctc tctggctaac tagagaaccc actgcttact ggcttatcga

661 aattaatacg actcactata gggagaccca agctggctag cgtttaaact taagcttggt

721 accgagctcg gatccgccac catggattgg acctggattc tttttctcgt tgcagctgct

781 acacgcgttc atagcagcca gtgtgtgaac ctgaccacca gaacacagct gcctcctgcc

841 tacaccaaca gcttcaccag aggagtctac tacccagaca aggtgttcag aagctctgtg

901 ctgcacagca cccaggacct cttcctgcct ttcttcagca acgtgacctg gttccacgcc

961 atccacgtgt ctggcaccaa cggcaccaag agatttgaca accctgtgct gcctttcaat

1021 gatggtgtgt actttgccag cacagagaag agcaacatca tccgaggctggatctttggc

1081 accaccctgg acagcaaaac acagagcctg ctgatcgtga ataatgccaccaacgtggtc

1141 atcaaggtgt gtgagttcca gttctgcaat gaccctttcc tgggcgtgtactaccacaag

1201 aacaacaagt cctggatgga gtctgagttc cgagtgtaca gctctgccaacaactgcaca

1261 tttgaatatg tgtcccagcc tttcctgatg gacctggagg gcaagcagggcaatttcaag

1321 aacctgagag aatttgtgtt caagaacatc gatggctact tcaagatctacagcaagcac

1381 acacccatca acctggtgag agatcttcct cagggcttct ctgccctggagcctctggtg

1441 gacctgccca tcggcatcaa catcacccgc tttcagaccc tgctggccctgcacagaagc

1501 tacctgaccc caggagacag cagcagcggc tggacagctg gagctgctgcctactacgtg

1561 ggctacctgc agccaagaac cttcctgctg aagtacaacg aaaatggcaccatcactgtg

1621 gctgtggcct gtgccctgga ccctctttct gagaccaagt gcaccctgaagtccttcaca

1681 gtggagaaag gcatctacca gaccagcaac ttcagagttc agccaacagagagcatcgtg

1741 agatttccaa acatcaccaa cctgtgtcct tttggagaag tcttcaatgccaccagattt

1801 gcttctgtgt acgcctggaa cagaaaaaga atcagcaact gtgtggctgactactctgtg

1861 ctgtacaact ctgcctcctt ctccaccttc aagtgctacg gtgtgtctcctaccaagctg

1921 aatgacctgt gcttcaccaa cgtgtatgct gacagctttg tcatcagaggagatgaagtg

1981 cggcagatcg cccctggcca gacaggcaag attgctgact acaactacaagctgcctgat

2041 gacttcacag gctgtgtcat cgcctggaac agcaacaacc tggacagcaaggtgggcggc

2101 aactacaact acctgtacag acttttcagg aagagcaacc tgaagccttttgaaagagac

2161 atctccacag agatctacca ggctggcagc acaccctgca atggagtggaaggcttcaac

2221 tgctacttcc ctctgcagag ctacggcttc cagcccacca atggcgtgggctaccagcct

2281 tacagagtgg tggtgctgtc ctttgagctg ctgcacgccc ctgccacagtgtgtggcccc

2341 aagaagagca ccaacctggt gaagaacaaa tgtgtgaact tcaatttcaatggcctgaca

2401 ggcacaggag tgctgacaga gagcaacaag aagttcctgc ctttccagcagtttggaaga

2461 gacattgctg acaccacaga tgctgtgaga gatcctcaga ccctggagatcctggacatc

2521 acaccctgct cctttggagg agtttctgtc atcacacctg gagccaacaccagcaaccaa

2581 gtgacagtgc tgtaccaaga tgtgaactgc acagaagttc ctgtggccatccacgctgac

2641 cagctgaccc caacctggag agtctacagc acaggcagca acgtgtttaaaacaagagct

2701 ggctgcctga ttggagcaga gcacgtgaac aacagctatg aatgtgacatccctattgga

2761 gctggcatct gtgccagcta ccagacccaa accaacagcc caagaagagccaggagcaca

2821 gccagccaga gcatcatcgc ctacaccatg agcctgggag cagagaactctgtggcctac

2881 agcaacaaca gcatcgtcat ccccaccaac ttcaccatct ctgtgaccacagagatcctg

2941 cctgtgtcca tgaccaagac atctgtggac tgcaccatgt acatctgcagtgacagcaca

3001 gaatgcagca accctctgct gcagtacggc tccttctgca cccagctgaacagagccctg

3061 acaggcatcg ctgtggagca ggacaagaac acacaggaag tgtttgcccaggtgaagcag

3121 atctacaaaa caccacccat caaggacttt ggaggcttca acttctcccagatcctgcct

3181 gaccccagca agcccagcaa gagaagcttc attgaagacc tgctgttcaacaaagtgacc

3241 ctggctgatg ctggcttcat caaacaatat ggagactgcc tgggagacattgctgccaga

3301 gacctgatct gtgcccagaa gtttaatggc ctgactgtgc tgcctcctctgctgacagat

3361 gaaatgatcg cccagtacac atctgccctg ctggctggca ccatcacatctggctggaca

3421 tttggagctg gagctgccct gcagatccct tttgccatgc agatggcctacagatttaat

3481 ggcatcagag tgacccagaa cgtgctgtat gaaaaccaga agctgatcgccaaccagttc

3541 aactctgcca tcggcaagat ccaggacagc ctgagcagca cagcctctgccctgggcaag

3601 ctgcaggatg tggtgaacca aaatgcccag gccctgaaca ccctggtgaagcagctgagc

3661 agcaccttct ccaccatctc cagcgtgctg aatgacatcc tgagccggctggacaaggtg

3721 gaagctgagg tgcagatcga cagactcatc acaggccggc tgcagagcctgcagacctac

3781 gtgacccagc agctgatcag agctgctgag atcagagctt ctgccaacctgaaggccacc

3841 aagatgtcag aatgtgtgct gggccagagc aagagagtgg acttctgtggcaaaggctac

3901 cacctgatgt ccttccctca gtctgctcct cacggcgtgg tgttcctgcacgtgacctac

3961 gtgcctgccc aggagaagaa cttcaccaca gctcctgcca cctgccacgatggcaaagcc

4021 cacttcccaa gagaaggcgt ctttgtgtcc aatggcaccc actggttcgtgacccagaga

4081 aactttgatg agcctcagat catcaccaca gacaacacat ttgtttctggcaactgtgat

4141 gtggtcatcg gcatcgtgaa caacacagtt tatgaccctc tgcagcctgagctggacagc

4201 ttcaaagaag agctggacaa gtacttcaag aaccacacat ctccagatgtggacctggga

4261 gacatctctg gcatcaatgc ctctgtggtg aacatccaga aggaaattgacaggctgaac

4321 gaagtggcca agaacctgaa cgaaagcctc atcgacctgc aggagctgggcaagtacgag

4381 cagtacatca agtggccttg gtacatctgg ctgggcttca ttgctggcctcatcgccatc

4441 gtgatggtga ccatcatgct gtgctgcatg accagctgct gctcttgcctgaagggctgc

4501 tgcagctgtg gcagctgctg caagtttgat gaagatgact ctgagcctgtgctgaagggc

4561 gtgaagctgc actacacatg ataactcgag tctagagggc ccgtttaaacccgctgatca

4621 gcctcgactg tgccttctag ttgccagcca tctgttgttt gcccctcccccgtgccttcc

4681 ttgaccctgg aaggtgccac tcccactgtc ctttcctaat aaaatgaggaaattgcatcg

4741 cattgtctga gtaggtgtca ttctattctg gggggtgggg tggggcaggacagcaagggg

4801 gaggattggg aagacaatag caggcatgct ggggatgcgg tgggctctatggcttctact

4861 gggcggtttt atggacagca agcgaaccgg aattgccagc tggggcgccctctggtaagg

4921 ttgggaagcc ctgcaaagta aactggatgg ctttcttgcc gccaaggatctgatggcgca

4981 ggggatcaag ctctgatcaa gagacaggat gaggatcgtt tcgcatgattgaacaagatg

5041 gattgcacgc aggttctccg gccgcttggg tggagaggct attcggctatgactgggcac

5101 aacagacaat cggctgctct gatgccgccg tgttccggct gtcagcgcaggggcgcccgg

5161 ttctttttgt caagaccgac ctgtccggtg ccctgaatga actgcaagacgaggcagcgc

5221 ggctatcgtg gctggccacg acgggcgttc cttgcgcagc tgtgctcgacgttgtcactg

5281 aagcgggaag ggactggctg ctattgggcg aagtgccggg gcaggatctcctgtcatctc

5341 accttgctcc tgccgagaaa gtatccatca tggctgatgc aatgcggcggctgcatacgc

5401 ttgatccggc tacctgccca ttcgaccacc aagcgaaaca tcgcatcgagcgagcacgta

5461 ctcggatgga agccggtctt gtcgatcagg atgatctgga cgaagagcatcaggggctcg

5521 cgccagccga actgttcgcc aggctcaagg cgagcatgcc cgacggcgaggatctcgtcg

5581 tgacccatgg cgatgcctgc ttgccgaata tcatggtgga aaatggccgcttttctggat

5641 tcatcgactg tggccggctg ggtgtggcgg accgctatca ggacatagcgttggctaccc

5701 gtgatattgc tgaagagctt ggcggcgaat gggctgaccg cttcctcgtgctttacggta

5761 tcgccgctcc cgattcgcag cgcatcgcct tctatcgcct tcttgacgagttcttctgaa

5821 ttattaacgc ttacaatttc ctgatgcggt attttctcct tacgcatctgtgcggtattt

5881 cacaccgcat caggtggcac ttttcgggga aatgtgcgcg gaacccctatttgtttattt

5941 ttctaaatac attcaaatat gtatccgctc atgagacaat aaccctgataaatgcttcaa

6001 taatagcacg tgctaaaact tcatttttaa tttaaaagga tctaggtgaagatccttttt

6061 gataatctca tgaccaaaat cccttaacgt gagttttcgt tccactgagcgtcagacccc

6121 gtagaaaaga tcaaaggatc ttcttgagat cctttttttc tgcgcgtaatctgctgcttg

6181 caaacaaaaa aaccaccgct accagcggtg gtttgtttgc cggatcaagagctaccaact

6241 ctttttccga aggtaactgg cttcagcaga gcgcagatac caaatactgttcttctagtg

6301 tagccgtagt taggccacca cttcaagaac tctgtagcac cgcctacatacctcgctctg

6361 ctaatcctgt taccagtggc tgctgccagt ggcgataagt cgtgtcttaccgggttggac

6421 tcaagacgat agttaccgga taaggcgcag cggtcgggct gaacggggggttcgtgcaca

6481 cagcccagct tggagcgaac gacctacacc gaactgagat acctacagcgtgagctatga

6541 gaaagcgcca cgcttcccga agggagaaag gcggacaggt atccggtaagcggcagggtc

6601 ggaacaggag agcgcacgag ggagcttcca gggggaaacg cctggtatctttatagtcct

6661 gtcgggtttc gccacctctg acttgagcgt cgatttttgt gatgctcgtcaggggggcgg

6721 agcctatgga aaaacgccag caacgcggcc tttttacggt tcctggccttttgctggcct

6781 tttgctcaca tgttctt

SEQ ID NO:7pGX9501正向引物

CAGGACAAGAACACACAGGAA

SEQ ID NO:8pGX9501反向引物

CAGGCAGGATTTGGGAGAAA

SEQ ID NO:9pGX9501探针

ACCCATCAAGGACTTTGGAGG

SEQ ID NO:10pGX9503正向引物

AGGACAAGAACACACAGGAAG；

SEQ ID NO:11pGX9503反向引物

CAGGATCTGGGAGAAGTTGAAG

SEQ ID NO:12pGX9503探针

ACACCACCCATCAAGGACTTTGGA

SEQ ID NO:13β-肌动蛋白正向引物

GTGACGTGGACATCCGTAAA

SEQ ID NO:14β-肌动蛋白反向引物

CAGGGCAGTAATCTCCTTCTG

SEQ ID NO:15β-肌动蛋白探针

TACCCTGGCATTGCTGACAGGATG

SEQ ID NO:16

PHGVVFLH

SEQ ID NO:17

VVFLHVTVYV

SEQ ID NO:18:2019-nCoV_N1-F

5’-GACCCCAAAATCAGCGAAAT-3’

SEQ ID NO:19:2019-nCoV_N1-R

5’-TCTGGTTACTGCCAGTTGAATCTG-3’

SEQ ID NO:20:2019-nCoV_N1-P

5’-FAM-ACCCCGCATTACGTTTGGTGGACC-BHQ1-3’

SEQ ID NO:21:2019-nCoV_sgE-正向

5’CGATCTCTTGTAGATCTGTTCTC 3’

SEQ ID NO:22:2019-nCoV_sgE-反向

5’ATATTGCAGCAGTACGCACACA 3’

SEQ ID NO:23:2019-nCoV_sgE-探针

5’FAM-ACACTAGCCATCCTTACTGCGCTTCG-BHQ1 3’。