靶向新冠病毒NTD的广谱性纳米抗体N103和N235、其构建体及其应用

技术领域

本发明涉及生物医药领域，具体涉及特异性靶向新冠病毒NTD结构域的广谱性纳米抗体N235和N103、其多价构建体及其应用。

背景技术

接种疫苗可有效预防严重传染疾病的发生，但是疫苗的适用对象为未感染人群，且研发周期长，临床研究过程复杂。而对于确诊患者而言，只能通过抗病毒药物进行治疗，其中一种抗病毒药物是治疗性抗体药物，其主要指中和抗体；中和抗体药物主要是通过与病原微生物表面的抗原结合，阻止病原微生物表达的特定分子与细胞表面受体结合，达到“中和”的效果。

新冠病毒(SARS-CoV-2)表面具有糖基化的刺突蛋白(spike protein，S蛋白)，该S蛋白能与宿主细胞受体蛋白ACE2相互作用并触发膜融合，因此，阻断S蛋白与ACE2 的结合是治疗新冠病毒感染的有效途径。

SARS-CoV-2病毒是RNA病毒，在其不断复制和传播的过程中，不断发生基因变异。尤其是，最近流行的Omicron系列变体，增加了病毒的传染性，从而发生免疫逃逸。迄今为止，已批准使用几种治疗性抗体均靶向新冠病毒的RBD结构域，但因对多种 SARS-CoV-2变体无效而被撤销。

近来，报道了靶向NTD的中和性抗体，使其成为另一个潜在靶点。靶向NTD的抗体也可以通过中和机制发挥其抗病毒作用，然而，其通常不是通过直接阻断受体结合，而是通过干扰受体结合或抑制融合前到融合后过渡所需的S蛋白构象变化而发挥抗病毒作用。因此，鉴定靶向NTD区域的中和抗体对于新冠感染的预防和治疗同样十分重要。

纳米抗体(nanobody)，又称单域抗体(single-domain antibody,VHH)，是来自骆驼科动物重链抗体的单域可变区。纳米抗体通常可以获得与常规抗体相当的抗原亲和力特性，同时又具有多种优点：分子量小(～15kDa)、免疫原性小、更好的溶解度和稳定性、较长的CDR3区，且可灵活地构建多种形式的抗体，近来备受关注，成为检测、预防和治疗病毒感染非常有前景的抗体药物。

因此，开发针对新型冠状病毒的纳米抗体药物具有潜在的临床应用价值与前景。

发明内容

发明目的

本发明的目的在于提供特异性靶向新型冠状病毒S蛋白NTD结构域的广谱性纳米抗体N235和N103、基于该纳米抗体的多价构建体、其编码核酸及有关产品、转化的细胞、药物组合物及其在新冠病毒的预防、治疗和/或检测中的应用。

本发明所提供的特异性靶向新冠病毒NTD结构域的广谱性纳米抗体及其多价构建体(特别是其IgM五聚体形式的构建体)能以高中和活性中和SARS-CoV-2原始毒株及一系列变异毒株的假病毒，并且对SARS-CoV-2原始毒株及一系列变异毒株的活病毒也具有很好的抑制效果，为新冠病毒原始毒株及其变异毒株感染的检测、预防和/或治疗提供了非常有效的新选择。

解决方案

为实现上述目的，本发明提供了如下技术方案：

第一方面，本发明提供了一种特异性靶向SARS-CoV-2NTD结构域的纳米抗体或其抗原结合片段，其包含选自以下的重链可变区：

1)所述重链可变区包含以下的CDR：

氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示(即，GLIISRYD)的CDR1，

氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示(即，TPIPAARP)的CDR2，以及

氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示(即，NLGPESQDHNYNY)的CDR3；

2)所述重链可变区包含以下的CDR：

氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示(即，VNLFIGAT)的CDR1，

氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示(即，IGAGGTT)的CDR2，以及

氨基酸序列如SEQ ID NO:6所示(即，NYGSMSNPRTSGPNAF)的CDR3。

在具体实施方案中，所述重链可变区还包括4个框架区FR1-4，所述FR1-4与所述CDR1、CDR2和CDR3按顺序交错排列；

在一个优选的具体实施方案中，所述FR1-4的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:7(即，QVQLQESGGGLVQPGGSLRLSCAAS)、SEQ ID NO:8(即，MSWYRQAPGKERELVAT)、 SEQ ID NO:9(即，QYADSVKGRFTISRDNAKNTVSLQMNSLKPEDTAVYYC)、SEQ ID NO:10(即，WGQGTQVTVSS)所示。

在另一个优选的具体实施方案中，所述FR1-4的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:7(即， QVQLQESGGGLVQPGGSLRLSCAAS)、SEQ ID NO:11(即， MAWYRQAPGNQRELVAT)、SEQ IDNO:12(即，NYADSVKGRFTASRDDAKKTIYLQMNSLTPEDTAVYYC)、SEQ ID NO:13(即，WGRGTQVTVSS)所示。

在优选的具体实施方案中，所述重链可变区具有如SEQ ID NO:14或15所示的氨基酸序列，或与如SEQ ID NO:14或15所示的氨基酸序列具有至少95％，96％，97％， 98％或99％序列同一性的氨基酸序列；优选地，所述重链可变区具有如SEQ ID NO:14 或15所示的氨基酸序列；

SEQ ID NO:14：

其中，下划线部分分别为框架区FR1-4，标黑部分分别为重链可变区的CDR1、CDR2和CDR3。

SEQ ID NO:15：

其中，下划线部分分别为框架区FR1-4，标黑部分分别为重链可变区的CDR1、CDR2和CDR3。

第二方面，本发明提供了一种多价纳米抗体，其包括两条以上、如上述第一方面所述的纳米抗体或其抗原结合片段。

在优选的具体实施方案I中，所述多价纳米抗体由两条以上、优选地三条如上述第一方面所述的纳米抗体或其抗原结合片段通过Linker连接构成；

其中，所述Linker为(GGGGS)n，其中，n＝1,2,3,或4，优选地，n＝2或3。

作为具体实施方案I的进一步优选，所述多价纳米抗体为三价纳米抗体，具有如SEQ ID NO:16或17所示的氨基酸序列。

SEQ ID NO:16：

QVQLQESGGGLVQPGGSLRLSCAASGLIISRYDMSWYRQAPGKERELVATTPIPA ARPQYADSVKGRFTISRDNAKNTVSLQMNSLKPEDTAVYYCNLGPESQDHNYNYWG QGTQVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSQVQLQESGGGLVQPGGSLRLSC AASGLIISRYDMSWYRQAPGKERELVATTPIPAARPQYADSVKGRFTISRDNAKNTVSL QMNSLKPEDTAVYYCNLGPESQDHNYNYWGQGTQVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSG GGGSGGGGSQVQLQESGGGLVQPGGSLRLSCAASGLIISRYDMSWYRQAPGKERELV ATTPIPAARPQYADSVKGRFTISRDNAKNTVSLQMNSLKPEDTAVYYCNLGPESQDHN YNYWGQGTQVTVSS；

SEQ ID NO:17：

QVQLQESGGGLVQPGGSLRLSCAASVNLFIGATMAWYRQAPGNQRELVATIGAG GTTNYADSVKGRFTASRDDAKKTIYLQMNSLTPEDTAVYYCNYGSMSNPRTSGPNAF WGRGTQVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSQVQLQESGGGLVQPGGSLR LSCAASVNLFIGATMAWYRQAPGNQRELVATIGAGGTTNYADSVKGRFTASRDDAKK TIYLQMNSLTPEDTAVYYCNYGSMSNPRTSGPNAFWGRGTQVTVSSGGGGSGGGGS GGGGSGGGGSGGGGSQVQLQESGGGLVQPGGSLRLSCAASVNLFIGATMAWYRQAP GNQRELVATIGAGGTTNYADSVKGRFTASRDDAKKTIYLQMNSLTPEDTAVYYCNYG SMSNPRTSGPNAFWGRGTQVTVSS。

在优选的具体实施方案II中，所述多价纳米抗体为由以下融合蛋白形成的IgM五聚体，所述融合蛋白从N端到C端的结构如式(I)所示：

A-L-B (I)

其中，

A为单条如上述第一方面所述的纳米抗体或其抗原结合片段，或者为如上述优选的具体实施方案I中所述的多价纳米抗体；

B为人源IgM的Fc片段；优选地，所述人源IgM的Fc片段具有如SEQ ID NO:18(即，VIAELPPKVSVFVPPRDGFFGNPRKSKLICQATGFSPRQIQVSWLREGKQVGSGVTTD QVQAEAKESGPTTYKVTSTLTIKESDWLGQSMFTCRVDHRGLTFQQNASSMCVPDQD TAIRVFAIPPSFASIFLTKSTKLTCLVTDLTTYDSVTISWTRQNGEAVKTHTNISESHPNA TFSAVGEASICEDDWNSGERFTCTVTHTDLPSPLKQTISRPKGVALHRPDVYLLPPARE QLNLRESATITCLVTGFSPADVFVQWMQRGQPLSPEKYVTSAPMPEPQAPGRYFAHSI LTVSEEEWNTGETYTCVVAHEALPNRVTERTVDKSTGKPTLYNVSLVMSDTAGTCY) 所示的氨基酸序列，或与SEQID NO:18所示的氨基酸序列具有至少95％，96％，97％， 98％或99％序列同一性的氨基酸序列；

L为(GGGGS)m，其中，m＝0,1,2,3,或4。

作为上述融合蛋白的优选实施方案，其具有如SEQ ID NO:19或20所示的氨基酸序列。

SEQ ID NO:19：

QVQLQESGGGLVQPGGSLRLSCAASGLIISRYDMSWYRQAPGKERELVATTPIPA ARPQYADSVKGRFTISRDNAKNTVSLQMNSLKPEDTAVYYCNLGPESQDHNYNYWG QGTQVTVSSVIAELPPKVSVFVPPRDGFFGNPRKSKLICQATGFSPRQIQVSWLREGKQ VGSGVTTDQVQAEAKESGPTTYKVTSTLTIKESDWLGQSMFTCRVDHRGLTFQQNAS SMCVPDQDTAIRVFAIPPSFASIFLTKSTKLTCLVTDLTTYDSVTISWTRQNGEAVKTHT NISESHPNATFSAVGEASICEDDWNSGERFTCTVTHTDLPSPLKQTISRPKGVALHRPD VYLLPPAREQLNLRESATITCLVTGFSPADVFVQWMQRGQPLSPEKYVTSAPMPEPQA PGRYFAHSILTVSEEEWNTGETYTCVVAHEALPNRVTERTVDKSTGKPTLYNVSLVMS DTAGTCY；

SEQ ID NO:20：

QVQLQESGGGLVQPGGSLRLSCAASVNLFIGATMAWYRQAPGNQRELVATIGAG GTTNYADSVKGRFTASRDDAKKTIYLQMNSLTPEDTAVYYCNYGSMSNPRTSGPNAF WGRGTQVTVSSVIAELPPKVSVFVPPRDGFFGNPRKSKLICQATGFSPRQIQVSWLRE GKQVGSGVTTDQVQAEAKESGPTTYKVTSTLTIKESDWLGQSMFTCRVDHRGLTFQQ NASSMCVPDQDTAIRVFAIPPSFASIFLTKSTKLTCLVTDLTTYDSVTISWTRQNGEAVK THTNISESHPNATFSAVGEASICEDDWNSGERFTCTVTHTDLPSPLKQTISRPKGVALH RPDVYLLPPAREQLNLRESATITCLVTGFSPADVFVQWMQRGQPLSPEKYVTSAPMPE PQAPGRYFAHSILTVSEEEWNTGETYTCVVAHEALPNRVTERTVDKSTGKPTLYNVSL VMSDTAGTCY。

第三方面，本发明提供了一种纳米抗体融合蛋白，所述纳米抗体融合蛋白从N端到C端的结构如式(I)所示：

A-L-B (I)

其中，

A为单条如上述第一方面所述的纳米抗体或其抗原结合片段，或者为如上述优选的具体实施方案I中所述的多价纳米抗体；

B为人源IgM的Fc片段；优选地，所述人源IgM的Fc片段具有如SEQ ID NO:18所示的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:18所示的氨基酸序列具有至少95％，96％，97％，98％或99％序列同一性的氨基酸序列；

L为(GGGGS)m，其中，m＝0,1,2,3,或4。

作为上述融合蛋白的优选实施方案，其具有如SEQ ID NO:19或20所示的氨基酸序列。

第四方面，本发明提供了一种多核苷酸，其编码如上述第一方面所述的纳米抗体或其抗原结合片段、如上述第二方面的多价纳米抗体，或者编码如上述第三方面所述的纳米抗体融合蛋白。

在具体实施方案中，所述多核苷酸为DNA或mRNA。

在一个具体实施方案中，所述多核苷酸编码如上述第一方面所述的纳米抗体或其抗原结合片段，优选地，所述多核苷酸包括如SEQ ID NO:21或22所示的核苷酸序列。

SEQ ID NO:21：

CAGGTGCAGCTGCAGGAGTCTGGAGGAGGCTTGGTGCAGCCTGGGGGGTCT CTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTGATAATCAGTAGATATGACATGAGTTGG TACCGCCAGGCTCCAGGGAAGGAGCGCGAGTTGGTCGCAACTACTCCGATTCCTG CTGCTAGGCCGCAGTACGCAGACTCCGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAATGCCAAGAATACGGTGTCGCTGCAAATGAACAGCCTGAAACCTGAGGACACG GCCGTGTATTACTGTAACCTGGGGCCCGAATCTCAGGATCATAACTACAACTACTG GGGCCAGGGGACCCAGGTGACCGTGAGCTCT；

SEQ ID NO:22：

CAGGTGCAGCTGCAGGAGAGCGGAGGAGGGCTGGTGCAGCCCGGAGGAAGC CTGAGACTGAGCTGCGCCGCCAGCGTTAATCTGTTTATTGGGGCTACCATGGCATG GTATAGACAGGCCCCTGGAAATCAGAGAGAGCTGGTGGCTACTATCGGAGCCGGC GGAACAACCAACTACGCCGACTCCGTGAAAGGAAGGTTCACCGCCAGCAGAGACGACGCCAAGAAGACAATTTACCTCCAGATGAACAGCCTGACTCCCGAAGACACCG CCGTGTACTACTGCAACTACGGCAGCATGAGCAACCCAAGAACAAGCGGCCCCAA CGCATTCTGGGGACGCGGCACCCAGGTGACAGTGAGCTCC。

在另一个具体实施方案中，所述多核苷酸编码如上述第三方面所述的纳米抗体融合蛋白，优选地，所述多核苷酸包括如SEQ ID NO:23或24所示的核苷酸序列。

SEQ ID NO:23：

CAGGTGCAGCTGCAGGAGTCTGGAGGAGGCTTGGTGCAGCCTGGGGGGTCT CTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTGATAATCAGTAGATATGACATGAGTTGG TACCGCCAGGCTCCAGGGAAGGAGCGCGAGTTGGTCGCAACTACTCCGATTCCTG CTGCTAGGCCGCAGTACGCAGACTCCGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAATGCCAAGAATACGGTGTCGCTGCAAATGAACAGCCTGAAACCTGAGGACACG GCCGTGTATTACTGTAACCTGGGGCCCGAATCTCAGGATCATAACTACAACTACTG GGGCCAGGGGACCCAGGTGACCGTGAGCTCTGTGATCGCCGAGCTGCCCCCCAAG GTGAGCGTGTTCGTGCCCCCTAGAGACGGCTTCTTCGGCAACCCTAGAAAGAGCA AGCTGATCTGCCAAGCCACCGGCTTCTCCCCTAGACAGATCCAAGTGAGCTGGCT GAGAGAGGGCAAGCAAGTGGGCAGCGGCGTCACAACAGACCAAGTGCAAGCCG AGGCCAAGGAGAGCGGCCCCACCACCTACAAGGTGACAAGCACCCTGACCATCA AGGAGAGCGACTGGCTGGGGCAGAGCATGTTCACCTGCAGAGTGGACCACAGAG GCCTGACCTTTCAGCAGAACGCTAGCAGCATGTGCGTGCCCGACCAAGACACCGC CATCAGAGTGTTCGCCATCCCCCCTAGCTTCGCTAGCATCTTCCTGACCAAGAGCA CCAAGCTGACCTGCCTCGTGACCGATCTGACCACCTACGACAGCGTGACCATCAG CTGGACAAGACAGAACGGCGAGGCCGTGAAGACCCACACCAACATCAGCGAGAG CCACCCCAACGCCACCTTCAGCGCCGTGGGCGAGGCTAGCATCTGCGAGGACGAC TGGAACAGCGGCGAGAGATTCACCTGCACCGTGACCCACACCGACCTGCCTAGCC CCCTGAAGCAGACCATCAGCAGACCCAAGGGCGTGGCCCTGCACAGACCCGACGTGTACCTGCTGCCCCCCGCTAGAGAGCAGCTGAACCTGAGAGAGAGCGCCACCAT CACCTGCCTGGTGACCGGCTTTAGCCCCGCTGACGTGTTCGTGCAGTGGATGCAG AGAGGGCAGCCCCTGAGCCCCGAGAAGTACGTGACAAGCGCCCCCATGCCCGAG CCCCAAGCCCCCGGCAGATACTTCGCCCACAGCATCCTGACCGTGAGCGAGGAAG AGTGGAACACCGGCGAGACCTACACCTGCGTGGTGGCCCACGAGGCCCTGCCCA ACAGAGTGACCGAGAGAACCGTGGACAAGAGCACCGGCAAGCCCACCCTGTACA ACGTGAGCCTGGTGATGAGCGACACCGCCGGCACCTGCTAC；

SEQ ID NO:24：

CAGGTGCAGCTGCAGGAGAGCGGCGGCGGCCTGGTGCAGCCCGGCGGCAGC CTGCGGCTGAGCTGCGCCGCCAGCGTGAACCTGTTCATCGGCGCCACCATGGCCT GGTACCGGCAGGCCCCCGGCAACCAGCGGGAGCTGGTGGCCACCATCGGCGCCG GCGGCACCACCAACTACGCCGACAGCGTGAAGGGCCGGTTCACCGCCAGCCGGG ACGACGCCAAGAAGACCATCTACCTGCAGATGAACAGCCTGACCCCCGAGGACAC CGCCGTGTACTACTGCAACTACGGCAGCATGAGCAACCCCCGGACCAGCGGCCCC AACGCCTTCTGGGGCCGGGGCACCCAGGTGACCGTGAGCAGCGTGATCGCCGAG CTGCCCCCCAAGGTGAGCGTGTTCGTGCCCCCCCGGGACGGCTTCTTCGGCAACC CCCGGAAGAGCAAGCTGATCTGCCAGGCCACCGGCTTCAGCCCCCGGCAGATCCA GGTGAGCTGGCTGCGGGAGGGCAAGCAGGTGGGCAGCGGCGTGACCACCGACCA GGTGCAGGCCGAGGCCAAGGAGAGCGGCCCCACCACCTACAAGGTGACCAGCAC CCTGACCATCAAGGAGAGCGACTGGCTGGGCCAGAGCATGTTCACCTGCCGGGTG GACCACCGGGGCCTGACCTTCCAGCAGAACGCCAGCAGCATGTGCGTGCCCGACC AGGACACCGCCATCCGGGTGTTCGCCATCCCCCCCAGCTTCGCCAGCATCTTCCTG ACCAAGAGCACCAAGCTGACCTGCCTGGTGACCGACCTGACCACCTACGACAGC GTGACCATCAGCTGGACCCGGCAGAACGGCGAGGCCGTGAAGACCCACACCAAC ATCAGCGAGAGCCACCCCAACGCCACCTTCAGCGCCGTGGGCGAGGCCAGCATCT GCGAGGACGACTGGAACAGCGGCGAGCGGTTCACCTGCACCGTGACCCACACCG ACCTGCCCAGCCCCCTGAAGCAGACCATCAGCCGGCCCAAGGGCGTGGCCCTGCA CCGGCCCGACGTGTACCTGCTGCCCCCCGCCCGGGAGCAGCTGAACCTGCGGGAG AGCGCCACCATCACCTGCCTGGTGACCGGCTTCAGCCCCGCCGACGTGTTCGTGC AGTGGATGCAGCGGGGCCAGCCCCTGAGCCCCGAGAAGTACGTGACCAGCGCCC CCATGCCCGAGCCCCAGGCCCCCGGCCGGTACTTCGCCCACAGCATCCTGACCGT GAGCGAGGAGGAGTGGAACACCGGCGAGACCTACACCTGCGTGGTGGCCCACGA GGCCCTGCCCAACCGGGTGACCGAGCGGACCGTGGACAAGAGCACCGGCAAGCC CACCCTGTACAACGTGAGCCTGGTGATGAGCGACACCGCCGGCACCTGCTAC。

第五方面，本发明提供了一种核酸构建体，其包含如上述第四方面所述的多核苷酸，以及任选地，与所述多核苷酸可操作地连接的至少一个表达调控元件。

第六方面，本发明提供了一种表达载体，其包含如上述第五方面所述的核酸构建体。

第七方面，本发明提供了一种转化的细胞，其中转化有如上述第四方面所述的多核苷酸、如上述第五方面所述的核酸构建体或如上述第六方面所述的表达载体。

第八方面，本发明提供了一种药物组合物，所述药物组合物包含如上述第一方面所述的纳米抗体或其抗原结合片段、如上述第二方面所述的多价纳米抗体、如上述第三方面所述的纳米抗体融合蛋白、如上述第四方面所述的多核苷酸、如上述第五方面所述的核酸构建体、如上述第六方面所述的表达载体或如上述第七方面所述的转化的细胞，以及药学上可接受的载体和/或赋形剂。

在具体实施方案中，所述药物组合物可以为鼻喷剂、口服制剂、栓剂或胃肠外制剂的形式；

优选地，所述鼻喷剂选自气雾剂、喷雾剂和粉雾剂；

优选地，所述口服制剂选自片剂、粉末剂、丸剂、散剂、颗粒剂、细粒剂、软/硬胶囊剂、薄膜包衣剂、小丸剂、舌下片和膏剂；

优选地，所述胃肠外制剂为经皮剂、软膏剂、硬膏剂、外用液剂、可注射或可推注制剂。

本发明的药物组合物的有效成分的给药量，根据给药对象、对象脏器、症状、给药方法等不同而存在差异，可以考虑剂型的种类、给药方法、患者的年龄和体重、患者的症状等，根据医生的判断来确定。

第九方面，本发明提供了如上述第一方面所述的纳米抗体或其抗原结合片段、如上述第二方面所述的多价纳米抗体、如上述第三方面所述的纳米抗体融合蛋白、如上述第四方面所述的多核苷酸、如上述第五方面所述的核酸构建体、如上述第六方面所述的表达载体、如上述第七方面所述的转化的细胞或如上述第八方面所述的药物组合物在制备用于预防、治疗和/或检测新型冠状病毒感染的药物中的应用。

第十方面，本发明提供了新型冠状病毒检测试剂盒，所述试剂盒包括如上述第一方面所述的纳米抗体或其抗原结合片段、如上述第二方面所述的多价纳米抗体、如上述第三方面所述的纳米抗体融合蛋白、如上述第四方面所述的多核苷酸、如上述第五方面所述的核酸构建体、如上述第六方面所述的表达载体或如上述第七方面所述的转化的细胞。

第十一方面，本发明提供了一种预防或治疗新冠病毒感染的方法，其包括：向有需要的受试者施用预防或治疗有效量的如上述第一方面所述的纳米抗体或其抗原结合片段、如上述第二方面所述的多价纳米抗体、如上述第三方面所述的纳米抗体融合蛋白、如上述第四方面所述的多核苷酸、如上述第五方面所述的核酸构建体、如上述第六方面所述的表达载体、如上述第七方面所述的转化的细胞或如上述第八方面所述的药物组合物。

所述“预防或治疗有效量”，根据给药对象、对象脏器、症状、给药方法等不同而存在差异，可以考虑剂型的种类、给药方法、患者的年龄和体重、患者的症状等，根据医生的判断来确定。

第十二方面，本发明提供了一种检测新冠病毒的方法，其包括使用如上述第一方面所述的纳米抗体或其抗原结合片段、如上述第二方面所述的多价纳米抗体或者如上述第三方面所述的纳米抗体融合蛋白。

对于以上所有方面，所述新型冠状病毒可以为SARS-CoV-2原始毒株和/或 SARS-CoV-2变异毒株；

优选地，所述SARS-CoV-2变异毒株为Alpha(B.1.1.7)、Beta(B.1.351)、Gamma(P.1)、 Kappa(B.1.617.1)、Delta(B.1.617.2)毒株、Omicron(B.1.1.529)亚型BA.1毒株或Omicron (B.1.1.529)亚型BA.1、BA.2、BA.2.12.1、BA.2.75、BA.3、BA.4和BA.5毒株，进一步优选为Delta(B.1.617.2)毒株、Omicron(B.1.1.529)亚型BA.1、BA.2、BA.2.12.1、BA.2.75、BA.3、BA.4和BA.5毒株。

有益效果

本发明的两种纳米抗体N235和N103及其多价构建体均能以高亲和力与 SARS-CoV-2NTD结合，能以高中和活性中和SARS-CoV-2原型毒株及其一系列变异毒株的假病毒和活病毒(特别是，本发明的基于纳米抗体N235的IgM五聚体形式具有明显更高的中和活性)，为新型冠状病毒的临床预防、治疗和检测提供了潜在的纳米抗体新药。

附图说明

一个或多个实施例通过与之对应的附图中的图片进行示例性说明，这些示例性说明并不构成对实施例的限定。在这里专用的词“示例性”意为“用作例子、实施例或说明性”。这里作为“示例性”所说明的任何实施例不必解释为优于或好于其它实施例。

图1是本发明实施例1中记载的SARS-CoV-2S蛋白分子筛层析和SDS-PAGE鉴定结果示意图；

图2是本发明实施例1中记载的SARS-CoV-2NTD蛋白分子筛层析和SDS-PAGE 鉴定结果示意图；

图3是本发明实施例4中记载的纳米抗体N103的分子筛层析和SDS-PAGE鉴定结果示意图；

图4是本发明实施例4中记载的纳米抗体N235的分子筛层析和SDS-PAGE鉴定结果示意图；

图5是本发明的单价纳米抗体和IgM五聚体形式的构建体的结构示意图。

图6是本发明实施例6中记载的纳米抗体MN235的分子筛层析洗脱曲线。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。除非另有其它明确表示，否则在整个说明书和权利要求书中，术语“包括”或其变换如“包含”或“包括有”等等将被理解为包括所陈述的元件或组成部分，而并未排除其它元件或其它组成部分。

另外，为了更好的说明本发明，在下文的具体实施方式中给出了众多的具体细节。本领域技术人员应当理解，没有某些具体细节，本发明同样可以实施。在一些实施例中，对于本领域技术人员熟知的原料、元件、方法、手段等未作详细描述，以便于凸显本发明的主旨。

以下，对本发明进行详述。

定义

“纳米抗体”，即“重链单域抗体”，该类抗体只包含一个重链可变区(VHH，variabledomain of heavy chain of heavy-chain antibody)，相比于其他抗体，轻链天然缺失。

由于纳米抗体自身的生物物理优势，可以很容易地对其进行雾化并通过吸入器直接递送到肺部，从而治疗呼吸系统病毒引起的感染，被认为是非常有潜力的抗体类药物。

当提及配体/受体、抗体/抗原或其它结合对时，“特异性”结合是指在蛋白和/或其它生物试剂的异质群体中确定是否存在所述蛋白例如本发明的纳米抗体与SARS-CoV-2RBD蛋白的结合反应。因此，在所指定的条件下，特定的配体/抗原与特定的受体/抗体结合，并且并不以显著量与样品中存在的其它蛋白结合。

本发明以下实施例中所使用的试剂、酶、培养基、抗生素和牛奶等化学材料均为市售产品，例如，TRIzol购自Invitrogen，Superscript II First-Strand Synthesis Systemfor RT-PCR试剂盒购自Invitrogen。

一些常用的生物材料，如感受态细胞、载体、辅助噬菌体、待转化的细胞等也为市售产品，例如，pCAGGS载体、293F细胞等购自Invitrogen；HEK293T细胞、Vero细胞等购自ATCC。

一些合成类生物材料，例如引物、序列等需要人工合成的材料，均委托合成公司完成。

实施例1：SARS-CoV-2S蛋白、NTD蛋白和NTD-hFc蛋白的表达与纯化

在SARS-CoV-2S蛋白编码序列的5’端连上信号肽(MHSSALLCCLVLLTGVRA， SEQ IDNO:25)的编码序列 ATGCACAGCAGCGCCCTGCTGTGCTGCCTGGTTCTGCTGACCGGAGTGAGGGCC (如SEQ ID NO:26所示)，3’端连上6个组氨酸标签(hexa-His-tag)的编码序列及翻译终止密码子TGA，通过EcoRI和XhoI限制性内切酶位点，将其构建入pCAGGS载体(购自 Invitrogen)中，转染至293F细胞(购自Invitrogen)中，进行SARS-CoV-2S-his蛋白的表达。含有目的蛋白的细胞培养液经镍离子亲和层析(HisTrap TM excel((GE Healthcare)) 和凝胶过滤层析(SuperoseTM 6Increase 10/300GL column(GE Healthcare))纯化后，可以获得较纯的目的蛋白。SARS-CoV-2S-his蛋白的SDS-PAGE鉴定大小为180KD左右，结果如图2。

在SARS-CoV-2NTD蛋白编码序列的5’端连上信号肽(MFVFLVLLPLVSSQCVNLT， SEQID NO:27)的编码序列 ATGTTCGTGTTCCTCGTGCTCCTGCCTCTGGTGTCTAGCCAGTGCGTGAACCTGACC(如SEQ ID NO:28所示)，3’端连上6个组氨酸标签(hexa-His-tag)的编码序列及翻译终止密码子TGA，通过EcoRI和XhoI限制性内切酶位点，将其构建入pCAGGS载体(购自Invitrogen)中，转染至293F细胞(购自Invitrogen)中，进行SARS-CoV-2NTD-his蛋白的表达。含有目的蛋白的细胞培养液经镍离子亲和层析(HisTrap

在SARS-CoV-2NTD蛋白编码序列(如SEQ ID NO:27所示)的5’端连上信号肽(MFVFLVLLPLVSSQCVNLT，SEQ ID NO:27)的编码序列(如SEQ ID NO:28所示)， 3’端连上人源Fc标签(hFc)的编码序列(如SEQ ID NO:29所示)及翻译终止密码子TGA，通过连接EcoRI和XhoI构建入pCAGGS载体(购自Invitrogen)中，转染至293F细胞(购自Invitrogen)中，进行SARS-CoV-2NTD-hFc蛋白的表达，其表达上清液用于表面等离子共振分析。

实施例2：羊驼免疫和抗体文库构建

实施例1中制备的带有6个组氨酸标签的SARS-CoV-2NTD(或SARS-CoV-2S)蛋白200μg，用PBS稀释至终体积1mL，加1ml完全弗氏佐剂(或MF59佐剂)乳化5min，皮下多点注射进行免疫；之后，每两周进行一次免疫，第四次免疫后的第12天，采集 50-60mL的血液，分离PBMCs(外周血单个核细胞)；将分离的PBMCs加入1mL TRIzol (购自Invitrogen)，按照说明书的步骤提取总RNA；以提取的总RNA为模板，使用 Superscript II First-StrandSynthesis System for RT-PCR试剂盒(购自Invitrogen)，用随机引物oligo-dT

使用双酶切法，通过限制性酶切位点PstⅠ和BstEⅡ，将VHHs片段连接入质粒pMES4。将纯化的克隆载体和电感受态E.coli TG1细胞混合，使用电转仪(BIO-RAD电转化仪MicroPulser)将克隆载体转化入电感受态E.coli TG1细胞，全部涂布在含有氨苄青霉素的选择性培养基上，37℃过夜培养后，收集所有的菌落于LB培养基中，离心并弃上清，用 LB重悬细胞，此为抗体文库。

表1.反应引物

实施例3：噬菌体展示技术筛选特异性的纳米抗体

取实施例2已转染重组质粒的E.coli TG1，以感染复数(multiplicity ofinfection,MOI) 约为20的比例，加入VCSM13辅助噬菌体，过夜培养后，离心取上清，使用PEG6000/NaCl 沉淀至少1小时，离心并弃上清，沉淀用PBS重悬，即为收集的噬菌体颗粒，测定噬菌体效价。

将上述收集的噬菌体与等体积的5％(w/v)脱脂牛奶混合，加到包被有SARS-CoV-2NTD-His抗原的96孔板中，室温孵育1h后，用0.2M甘氨酸洗脱特异性的噬菌体，并用 Tris-HCl(pH 9.1)中和洗脱的噬菌体。然后用该噬菌体感染E.coli TG1细胞，并对噬菌体进行扩增。再次准备包被有SARS-CoV-2NTD-His抗原的96孔板，进行第2轮淘选，来富集表达有特异性纳米抗体的噬菌体，共进行3轮淘选。每轮淘选后，从长有菌落的琼脂平板上随机挑选不同单一菌落，在37℃摇床中培养，随后加入VCSM13辅助噬菌体过夜扩培，第二天离心培养液，取噬菌体上清进行ELISA实验，当OD

表2.反应引物

实施例4：纳米抗体的表达

为了使纳米抗体的重链可变区更加完整，在实施例3获得的纳米抗体的核心编码序列的5’端连上QVQLQ的编码序列(CAGGTGCAGCTGCAG，SED ID NO:36)，3’端连上QVTVSS的编码序列(CAGGTGACCGTGAGCTCT，SED ID NO:37)，即为本发明纳米抗体的编码序列；然后在其后连上6个组氨酸标签(hexa-His-tag)的编码序列及翻译终止密码子TGA，通过限制性内切酶位点EcoRI和XhoI，将其构建入pCAGGS载体(购自Invitrogen)中，转染293F细胞，培养5天后，收集上清，经过5000rpm离心30min后，经过0.22μm滤膜过滤后，经镍离子亲和层析(HisTrap

根据上述步骤，获得了纯化的本发明纳米抗体N235和N103，其SDS-PAGE鉴定结果分别如图3、图4所示。

实施例5：表面等离子共振技术检测本发明纳米抗体与SARS-CoV-2NTD的结合能力

表面等离子共振分析利用Biacore 8K(Biacore Inc.)进行。具体步骤如下：

选用protein A芯片(购自GE Healthcare)，通过protein A芯片与hFc的亲和力，将实施例1得到的SARS-CoV-2NTD-hFc蛋白固定在芯片上，固定量约为100RU，用PBST缓冲液(2.7mM KCl，137mM NaCl，4.3mM Na

表1纳米抗体N235和N103与NTD之间的平衡解离常数(KD)

注：“-”表示抗体与抗原结合后不发生解离

实施例6：基于纳米抗体N235的IgM五聚体形式(MN235)抗体的构建、表达与纯化本发明中的单价纳米抗体和IgM五聚体形式的结构示意图如图5所示。

通过同源重组的方式，将纳米抗体N235的编码序列(如SEQ ID NO:22所示)与人源IgM抗体的Fc的编码序列(如SEQ ID NO:38所示)连接，在其5’端连接信号肽(MHSSALLCCLVLLTGVRA，SEQ ID NO:25)的编码序列(如SEQ ID NO:26所示)、3’端连上翻译终止密码子TGA，通过限制性内切酶位点EcoRI和XhoI，将其构建入pCAGGS 载体(购自Invitrogen)，获得pCAGGS-N235-IgM Fc重组表达载体。将J链(Joining chain) 的编码序列(如SEQ ID NO:39所示)的3’端连上翻译终止密码子TGA，通过限制性内切酶位点EcoRI和XhoI，将其构建入pCAGGS载体(购自Invitrogen)，获得pCAGGS-J chain 重组表达载体。将上述两种重组表达载体pCAGGS-N235-IgM Fc与pCAGGS-J chain共转染至293F细胞(购自Invitrogen)中，进行N235-IgM Fc融合蛋白和J链的表达，二者再进行自组装，形成IgM形式的MN235蛋白。所得MN235蛋白通过HiTrap

实施例7：SARS-CoV-2原始毒株及变异毒株假病毒的包装

1)分别将编码SARS-CoV-2原始毒株(PT)及变异毒株Delta(B.1.617.2)、Omicron亚型BA.1、BA.1.1、BA.2、BA.2.12.1、BA.2.75、BA.3、BA.4/5的S蛋白后18位氨基酸的基因去掉，S蛋白其余序列进行合成(由苏州金唯智提供合成服务)，得到SARS-CoV-2 PT-S-del18、B.1.617.2-S-del18、BA.1-S-del18、BA.1.1-S-del18、BA.2-S-del18、 BA.2.12.1-S-del18、BA.3-S-del18、BA.4/5-S-del18基因的核苷酸序列，分别如SEQ ID NO:40-SEQ IDNO:47所示。

2)分别将1)中获得的截短的S蛋白基因克隆到pCAGGS载体上，得到表达质粒pCAGGS-PT-S-del18、pCAGGS-B.1.617.2-S-del18、pCAGGS-BA.1-S-del18、 pCAGGS-BA.1.1-S-del18、pCAGGS-BA.2-S-del18、pCAGGS-BA.2.12.1-S-del18、 pCAGGS-BA.2.75-S-del18、pCAGGS-BA.3-S-del18、pCAGGS-BA.4/5-S-del18。

SARS-CoV-2原始毒株及变异毒株假病毒的包装步骤如下：

a.细胞准备：在10cm细胞培养皿中铺HEK293T细胞(购自ATCC CRL-3216)，使第二天细胞汇合密度至80％左右。培养液为含10％FBS的DMEM培养基。

b.转染：取上述步骤2)中的各S蛋白的表达质粒，用PEI转染30μg质粒/10cm细胞培养皿，目的质粒与PEI按1:3比例混匀后转染，4-6h换培养液(含10％FBS的DMEM 培养基)，37℃培养24h。

c.加毒：将假病毒包装骨架病毒G*VSV-delG(购自武汉枢密脑科学技术有限公司)加入上述转染后的HEK293T细胞，37℃孵育2h，换培养液(含10％FBS的DMEM培养基)，并加入VSV-G抗体(表达该抗体的杂交瘤细胞购自ATCC细胞库)，在培养箱中继续培养30h。

d.收毒：收上清3000rpm离心10min,在超净工作台中经0.45μm无菌滤器过滤，去除细胞碎片，分装，-80℃冰箱冻存。

分别得到SARS-CoV-2原始毒株(SARS-CoV-2PT)及变异毒株Delta(B.1.617.2)、Omicron亚型BA.1、BA.1.1、BA.2、BA.2.12.1、BA.2.75、BA.3、BA.4/5的假病毒。

实施例8：纳米抗体中和SARS-CoV-2假病毒感染的检测

将实施例4和6得到的纯化的纳米抗体从5μg/mL开始5倍倍比稀释至第9个梯度(2.56pg/mL)，与1.6×10

表3纳米抗体对新冠病毒的假病毒中和效果

*其中，IC

由表3可知，本发明纳米抗体N235和N103以及构建体MN235均能以高中和活性中和上述一系列SARS-CoV-2原始毒株及变异毒株的假病毒，说明：本发明纳米抗体及其构建体对于新冠病毒各型毒株具有广谱的、高中和活性。

实施例9：纳米抗体中和活病毒感染的检测

本实施例中，通过基于细胞病变效应(CPE)的活病毒中和试验，测定各纳米抗体对新冠病毒活病毒的中和效果。具体步骤如下：

将经纯化的抗体MN235(由实施例6制得)分别以2倍倍比稀释至第11个梯度，每个梯度4个重复孔，每孔50μL，将稀释液与等体积的100TCID50的SARS-CoV-2 原始毒株(Prototype，PT)或其变异毒株Delta、Omicron亚型BA.1、BA.1.1和BA.2于 37℃孵育；1小时后，将混合物加入到悬浮的Vero细胞中，并在37℃下继续孵育3天；观察和记录细胞病变情况。使用GraphPad Prism 7.0计算本发明纳米抗体及其构建体的 IC

MN235对新冠病毒原始毒株及其变异毒株的活病毒中和效果见以下表4，表4结果显示：MN235对新冠病毒原始毒株及变异毒株的活病毒均具有优异的抑制效果。

表4.MN235对SARS-CoV-2原始毒株及变异毒株的活病毒的中和能力(IC

*其中，IC

最后应说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。