吡啶骈他叮在害虫防治中的应用

技术领域

本发明属于农药技术领域，具体涉及吡啶骈他叮在害虫防治中的应用。

背景技术

草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)属动物界，节肢动物门，昆虫纲，鳞翅目，夜蛾科，最早发现于中南美洲的热带地区，主要以玉米、大豆、花生、棉花以及水稻等多种农作物为食，属杂食性昆虫。2016年该物种从美洲传至非洲，随后逐渐传入印度，2019年由缅甸传入我国南部，并逐渐沿着中国向北扩散。由于其具较强的迁飞、适应及繁殖能力，草地贪夜蛾被认为是世界上最严重的农作物害虫之一。如今这种害虫的分布范围在全球仍在扩大，对农业生产产生了巨大的损害，该昆虫在2020年和2023连续两年被收录到中华人民共和国农业农村部《一类农作物病虫害名录》。在草地贪夜蛾防控措施中，杀虫剂和转基因Bt毒素作物是主要措施，但由于化学杀虫剂和Bt毒素的广泛且长期的使用，草地贪夜蛾产生很强的农药抗性，且其抗药性的机制也逐渐多样化，所以目前迫切需要寻找到新的杀虫靶点，开发新型农药。

1953年，Watson和Crick提出了经典的右旋B-DNA双螺旋模型，随后A-DNA，Z-DNA和四链体DNA等结构被鉴定出来。G-四链体(G-quadruplex，G4)结构通常在富含鸟嘌呤的DNA或RNA序列中形成，其中四个鸟嘌呤碱基通过Hoogsteen氢键连接形成一个G四分体，多个G四分体垂直堆叠形成G4。G4结构具有重要的生物学功能，可以参与一系列重要的生物学过程的调控，例如，基因表达，DNA复制，端粒完整性，蛋白质翻译和减数分裂等细胞活动。在昆虫中的研究发现，G4参与家蚕翅膀发育的调控，导致家蚕脂肪含量和体重降低，调控果蝇基因的转录。研究表明G4结构调控的诸多基因是昆虫生长发育所必需的，所以G4结构有成为害虫防治的新靶标的巨大潜力，并且结合和调控G4结构的小分子化合物可以作为重要的害虫防治物质。

吡啶骈他叮(Pyridostatin，PDS)，化学名称，4-(2-氨基乙氧基)-N2,N6-二[4-(2-氨基乙氧基)-2-喹啉基]-2,6-吡啶二甲酰胺，又称RR82和PDS。该化合物的分子式是C

该化合物是一种高选择性的G4结构稳定剂(Kd＝490nM)。有文献报道称，吡啶骈他叮(PDS)对原代皮层神经元具有神经毒性，会导致DNA双链断裂(DSB)，可以下调神经元中的BRCA1基因。吡啶骈他叮可以与SRC基因中的G-四链体基序相互作用并改变受损基因的mRNA水平。在癌细胞系(HeLa、U2OS和HT1080)和正常细胞系(WI-38)中，吡啶骈他叮处理72小时后，可以显著抑制细胞生长。吡啶骈他叮还可以与端粒相关蛋白竞争结合，导致端粒功能障碍。研究表明吡啶骈他叮对G-四联体显示出很强的稳定效果，但同时不影响双链DNA。

发明内容

本发明第一方面的目的，在于提供吡啶骈他叮或其衍生物在防治害虫中的应用。

本发明第二方面的目的，在于提供吡啶骈他叮或其衍生物在制备防治害虫的产品中的应用。

本发明第三方面的目的，在于提供吡啶骈他叮或其衍生物在制备推迟鳞翅目昆虫化蛹时间的产品中的应用。

本发明第四方面的目的，在于提供吡啶骈他叮或其衍生物在调控代谢通路、甾类激素通路、调控P450解毒酶通路或Toll免疫通路中的应用。

本发明第五方面的目的，在于提供一种防治害虫的方法。

为了实现上述目的，本发明所采取的技术方案是：

本发明的第一个方面，提供吡啶骈他叮或其衍生物在防治害虫中的应用。

在本发明一些实施方式中，所述害虫包括鳞翅目昆虫。

在本发明一些实施方式中，所述害虫为斜纹夜蛾、烟草天蛾、棉铃虫、小菜蛾、甜菜夜蛾和草地贪夜蛾中的一种或多种。

在本发明一些优选实施方式中，所述害虫为草地贪夜蛾。

在本发明一些实施方式中，所述吡啶骈他叮或其衍生物通过与害虫体内的G4结构结合以达到防治害虫的目的。

在本发明一些实施方式中，所述吡啶骈他叮或其衍生物通过损伤害虫的肠道以达到防治害虫的目的。

在本发明一些实施方式中，所述衍生物包括药学上可接受的盐、水合物、溶剂化合物、多晶型物、互变异构体和前药。

在本发明一些实施方式中，所述药学上可接受的盐包括盐酸盐、氢溴酸盐、乙酸盐、柠檬酸盐、苯甲酸盐、琥珀酸盐、辛二酸盐、富马酸盐、乳酸盐、草酸盐、邻苯二甲酸盐、甲磺酸盐、苯磺酸盐、对甲苯磺酸盐、酒石酸盐、马来酸盐或三氟乙酸盐中至少一种。

在本发明一些实施方式中，所述吡啶骈他叮或其衍生物的含量为10～100μM；进一步为10～60μM。

本发明的第二个方面，提供吡啶骈他叮或其衍生物在制备防治害虫的产品中的应用。

在本发明一些实施方式中，所述害虫为鳞翅目昆虫。

在本发明一些实施方式中，所述害虫为斜纹夜蛾、烟草天蛾、棉铃虫、小菜蛾、甜菜夜蛾和草地贪夜蛾中的一种或多种。

在本发明一些实施方式中，所述害虫为草地贪夜蛾。

在本发明一些实施方式中，所述产品杀虫剂或者杀虫药物。

在本发明一些实施方式中，所述产品可以制备成常规剂型使用，例如干粉、可湿性粉剂、乳油、微乳剂、糊剂、颗粒剂或悬浮剂。

在本发明一些实施方式中，所述吡啶骈他叮或其衍生物通过与害虫体内的G4结构结合以达到防治害虫的目的。

在本发明一些实施方式中，所述吡啶骈他叮或其衍生物通过损伤害虫的肠道以达到防治害虫的目的。

在本发明一些实施方式中，所述吡啶骈他叮或其衍生物的含量为10～100μM；进一步为10～60μM。

在本发明一些实施方式中，所述衍生物包括药学上可接受的盐、水合物、溶剂化合物、多晶型物、互变异构体和前药。

在本发明一些实施方式中，所述药学上可接受的盐包括盐酸盐、氢溴酸盐、乙酸盐、柠檬酸盐、苯甲酸盐、琥珀酸盐、辛二酸盐、富马酸盐、乳酸盐、草酸盐、邻苯二甲酸盐、甲磺酸盐、苯磺酸盐、对甲苯磺酸盐、酒石酸盐、马来酸盐或三氟乙酸盐中至少一种。

本发明的第三个方面，提供吡啶骈他叮或其衍生物在制备推迟鳞翅目昆虫化蛹时间的产品中的应用。

吡啶骈他叮或其衍生物在推迟鳞翅目昆虫化蛹时间中的应用。

吡啶骈他叮或其衍生物在制备促进鳞翅目昆虫发育迟缓的产品中的应用。

吡啶骈他叮或其衍生物在促进鳞翅目昆虫发育迟缓中的应用。

吡啶骈他叮或其衍生物在制备促进鳞翅目昆虫发生肠道损伤的产品中的应用。

吡啶骈他叮或其衍生物在促进鳞翅目昆虫发生肠道损伤中的应用。

吡啶骈他叮或其衍生物在制备阻碍鳞翅目昆虫蜕皮的产品中的应用。

吡啶骈他叮或其衍生物在阻碍鳞翅目昆虫蜕皮中的应用。

在本发明一些实施方式中，所述鳞翅目昆虫为斜纹夜蛾、烟草天蛾、棉铃虫、小菜蛾、甜菜夜蛾和草地贪夜蛾中的一种或多种；进一步为草地贪夜蛾。

在本发明一些实施方式中，所述吡啶骈他叮或其衍生物的含量为10～100μM；进一步为10～60μM。

在本发明一些实施方式中，所述衍生物包括药学上可接受的盐、水合物、溶剂化合物、多晶型物、互变异构体和前药。

在本发明一些实施方式中，所述药学上可接受的盐包括盐酸盐、氢溴酸盐、乙酸盐、柠檬酸盐、苯甲酸盐、琥珀酸盐、辛二酸盐、富马酸盐、乳酸盐、草酸盐、邻苯二甲酸盐、甲磺酸盐、苯磺酸盐、对甲苯磺酸盐、酒石酸盐、马来酸盐或三氟乙酸盐中至少一种。

本发明的第四个方面，提供吡啶骈他叮或其衍生物在调控代谢通路、甾类激素通路、调控P450解毒酶通路或Toll免疫通路中的应用。

吡啶骈他叮或其衍生物在制备调控代谢通路、甾类激素通路、调控P450解毒酶通路或Toll免疫通路的产品中的应用。

在本发明一些实施方式中，所述代谢通路包括核酸酶代谢、核酸酶分解代谢，小分子代谢、羧酸代谢、药物代谢和嘌呤代谢中至少一种。

在本发明一些实施方式中，所述吡啶骈他叮或其衍生物的含量为10～100μM；进一步为10～60μM。

在本发明一些实施方式中，所述衍生物包括药学上可接受的盐、水合物、溶剂化合物、多晶型物、互变异构体和前药。

在本发明一些实施方式中，所述药学上可接受的盐包括盐酸盐、氢溴酸盐、乙酸盐、柠檬酸盐、苯甲酸盐、琥珀酸盐、辛二酸盐、富马酸盐、乳酸盐、草酸盐、邻苯二甲酸盐、甲磺酸盐、苯磺酸盐、对甲苯磺酸盐、酒石酸盐、马来酸盐或三氟乙酸盐中至少一种。

本发明的第五个方面，提供一种防治害虫的方法，包括将吡啶骈他叮或其衍生物施用于害虫或害虫栖息地。

在本发明一些实施方式中，将有效剂量的吡啶骈他叮或其衍生物施用于害虫或害虫栖息地。

本发明提供防治害虫的方法，包括将害虫、害虫的食品、害虫的生境或繁殖场(害虫正在生长或可以生长的土壤、区域、材料或环境，或者欲保护以免于害虫攻击或侵染的材料、栽培植物、植物繁殖材料(如种子)、土壤、表面或空间)用吡啶骈他叮或其衍生物处理。

一般而言，“有效量”意指实现对生长的可观察效果所需要的活性成分的量，所述可观察效果包括坏死、死亡、阻滞、预防和除去、破坏或者减少靶标有机体的存在和活性的效果。对于本发明所用的吡啶骈他叮或其衍生物来说，有效量可以变化。有效量的所述吡啶骈他叮或其衍生物也根据主要条件而变化，如希望的杀虫效果和持续时间、气候、靶标种类、所在地、施用模式等。

在本发明一些实施方式中，所述衍生物包括药学上可接受的盐、水合物、溶剂化合物、多晶型物、互变异构体和前药。

在本发明一些实施方式中，所述药学上可接受的盐包括盐酸盐、氢溴酸盐、乙酸盐、柠檬酸盐、苯甲酸盐、琥珀酸盐、辛二酸盐、富马酸盐、乳酸盐、草酸盐、邻苯二甲酸盐、甲磺酸盐、苯磺酸盐、对甲苯磺酸盐、酒石酸盐、马来酸盐或三氟乙酸盐中至少一种。

本发明的有益效果是：

本发明提供的吡啶骈他叮或其衍生物可有效延迟害虫幼虫化蛹的时间，使害虫幼虫发育延迟、蜕皮失败，具有杀虫的作用。实验表明，通过喂食吡啶骈他叮或其衍生物可对害虫(如草地贪夜蛾)幼虫中肠造成损伤(肠发生萎缩、肠上皮细胞、再生细胞、周围营养膜等发生退化)，说明吡啶骈他叮他可以通过损伤害虫幼虫中肠来达到杀虫效果。

吡啶骈他叮或其盐与G4结构结合后会使得害虫(草地贪夜蛾)体内多种代谢途径(核酸酶代谢、核酸酶分解代谢，小分子代谢、羧酸代谢、药物代谢、嘌呤代谢)、甾类激素通路、蛋白质消化吸收通路、P450解毒酶通路和Toll免疫通路发生变化，使得害虫幼虫发育延迟，蜕皮失败和死亡。

附图说明

图1为吡啶骈他叮处理草地贪夜蛾细胞的免疫荧光图。

图2为吡啶骈他叮处理草地贪夜蛾中肠组织的免疫荧光图。

图3为注射和喂食PDS的草地贪夜蛾的形态学观察；其中，A为1龄幼虫喂食吡啶骈他叮24h和48h的形态；B为6龄幼虫喂食吡啶骈他叮48h的形态；C为6龄幼虫注射吡啶骈他叮48h的形态；D为实验组和对照组生存率曲线统计。

图4为吡啶骈他叮对草地贪夜蛾中肠组织的HE染色。

图5为实验组和对照组草地贪夜蛾的差异表达基因数量图，图中，CK为对照组，PDS为实验组。

图6为实验组和对照组草地贪夜蛾的差异表达基因热图分析，图中，CK为对照组，PDS为实验组，每组三个重复。

图7为实验组和对照组草地贪夜蛾的差异基因的GO富集。

图8为实验组和对照组草地贪夜蛾差异基因的KEGG富集。

图9为实验组和对照组草地贪夜蛾差异基因的GSEA富集；其中，A为P450解毒酶通路，B为Toll免疫通路。

具体实施方式

现结合具体实施例对本发明进行详细说明，但不限制本发明的范围。

本实施例中所使用的材料、试剂等，如无特别说明，为从商业途径得到的材料和试剂。

实施例1吡啶骈他叮可以促进草地贪夜蛾细胞中G4结构的形成

为了研究吡啶骈他叮对草地贪夜蛾中G4结构的影响，发明人对草地贪夜蛾细胞(sf9细胞)进行吡啶骈他叮处理，通过细胞免疫染色实验来观察G4结构数量的变化。具体如下：

将sf9细胞传代到24孔细胞培养板中，随机分成两组，设置为实验组和对照组，每组各3个孔，其中实验组为10μM的吡啶骈他叮(PDS)处理；对照组为1μL无核酸酶水处理。实验组和对照组的草地贪夜蛾细胞(sf9细胞)均处于最合适培养条件下进行培养(温度为28±2℃)，将培养48h之后的实验组和对照组进行细胞免疫染色实验。将生长在爬片上的草地贪夜蛾细胞(sf9细胞)在4％多聚甲醛中固定10min，在室温下用PBST缓冲液渗透15min，然后在封闭缓冲液中在37℃封闭1h。为了进行G4染色，将细胞与1:500稀释的G4抗体(BG4，购买自Absolute Antibody，货号Ab00174-10.6)在1:10稀释的封闭缓冲液(购买自sigma-aldrich，货号101649792)中在4℃孵育过夜。次日，将细胞与一抗flag抗体(购买自CellSignaling Technology，货号14793，使用时1：2000稀释)在37℃孵育1h。将细胞与Alexa488二抗(购买自Thermo Fisher Scientific，货号A-11008，使用时1:2000稀释)在37℃孵育1h。每次操作前用PBST洗涤细胞3次。最后使用DAPI进行染色，将玻片在共聚焦显微镜下进行观察。

通过细胞免疫荧光实验，观察吡啶骈他叮(PDS)处理草地贪夜蛾细胞(sf9细胞)发现：吡啶骈他叮处理后的实验组(PDS)sf9细胞较对照组(CK)，G4数目(BG4红色亮点)明显增加(图1)，表明吡啶骈他叮能够稳定草地贪夜蛾细胞G4结构和促进G4结构的形成。

实施例2吡啶骈他叮可以促进草地贪夜蛾中肠中G4结构的形成

考虑到农药一般作用于害虫的肠道，发明人在草地贪夜蛾中肠中进行组织免疫染色实验，以此来观察吡啶骈他叮对草地贪夜蛾中肠中G4结构的形成的影响。

将10只1龄草地贪夜蛾幼虫各随机分成两组，设置为实验组和对照组，每组各5头幼虫，其中实验组为在0.5cm

通过组织免疫荧光实验，观察到吡啶骈他叮处理草地贪夜蛾中肠后，G4结构数目(BG4红色亮点)明显增加(图2)。这说明，吡啶骈他叮不仅能够稳定草地贪夜蛾细胞中的G4结构，也可以稳定草地贪夜蛾中肠组织中的G4结构，促进G4结构的形成。

实施例3吡啶骈他叮对草地贪夜蛾的杀虫效果

在确定吡啶骈他叮能稳定G4结构并促进G4结构的形成之后，发明人开始探究吡啶骈他叮对草地贪夜蛾杀虫效果，具体实验如下：

将1龄和6龄各30只草地贪夜蛾幼虫各随机分成两组，设置为实验组和对照组，每组各15头幼虫，其中实验组为在0.5cm

1龄草地贪夜蛾幼虫处理24h和48h后，草地贪夜蛾幼虫生存状态如图3中A所示。结果表明，喂养水的对照组草地贪夜蛾幼虫在24h和48h内均很少出现生病和死亡现象，致病率和死亡率极低，喂养吡啶骈他叮的实验组经过24h和48h之后，草地贪夜蛾幼虫明显发育延迟，且在48h时，草地贪夜蛾幼虫出现大范围死亡现象。随后统计了两组草地贪夜蛾幼虫处理0h，6h，12h，24h，36h和48h的虫体存活数量，并进行了生存曲线分析(图3中D)，生存曲线结果显示，在用吡啶骈他叮处理24h之后，实验组草地贪夜蛾的死亡率为26.67％，而对照组为6.67％；处理48h之后，实验组死亡率为100％，对照组为6.67％，这表明喂食吡啶骈他叮会导致草地贪夜蛾幼虫死亡。此外发明人记录了6龄草地贪夜蛾幼虫处理48h后的形态(如3中B)，结果表明，喂食水的对照组草地贪夜蛾幼虫在48h可正常化蛹，但是喂养吡啶骈他叮的实验组经过48h之后，草地贪夜蛾幼虫明显出现发育延迟，化蛹时期延长的现象。

为了进一步探究吡啶骈他叮对草地贪夜蛾的杀虫效果，发明人将8μL吡啶骈他叮(10mM)注射到6龄草地贪夜蛾幼虫体内，经过48h处理之后，草地贪夜蛾幼虫出现蜕皮失败的现象(图3中C)。

上述结果可以看出吡啶骈他叮不仅能使草地贪夜蛾幼虫明显发育延迟，也能让草地贪夜蛾幼虫死亡，由此可以说明吡啶骈他叮对草地贪夜蛾的生长发育有巨大影响，而且吡啶骈他叮对草地贪夜蛾幼虫有显著杀虫效果。

实施例4吡啶骈他叮对草地贪夜蛾中肠的影响

在确定吡啶骈他叮会影响草地贪夜蛾的生长发育，且会产生杀虫效果之后，为了进一步探究吡啶骈他叮(PDS)对草地贪夜蛾中肠的影响，我们将草地贪夜蛾幼虫石蜡包埋切片进行苏木精-伊红染色(hematoxylin-eosin staining，HE)，以此对吡啶骈他叮处理草地贪夜蛾幼虫的中肠组织进行观察。具体实验如下：

将10只1龄草地贪夜蛾幼虫随机分成两组，设置为实验组和对照组，每组各5头幼虫，其中实验组为在0.5cm

通过实验组和对照组草地贪夜蛾幼虫中肠的对比(图4)，结果表明吡啶骈他叮(PDS)会导致草地贪夜蛾中肠发生萎缩。其中，实验组的中肠上皮细胞、再生细胞、周围营养膜等发生退化。这表明喂食吡啶骈他叮会对草地贪夜蛾幼虫中肠造成损伤，由此可以说明吡啶骈他叮他可以通过损伤草地贪夜蛾幼虫中肠来达到杀虫效果。

实施例5吡啶骈他叮处理后的草地贪夜蛾幼虫的转录组分析

有研究报道表明在草地贪夜蛾全基因组中，启动子区含有潜在G4结构的基因富集在解毒酶家族(P450和CarE家族)。发明人进一步对实验组(吡啶骈他叮处理)和对照组(CK处理)的草地贪夜蛾幼虫进行转录组测序(RNA-sequencing)，并对测序结果进行了分析。具体流程如下：

将20只1龄草地贪夜蛾幼虫随机分成两组，设置为实验组和对照组，每组各10头幼虫，其中实验组为在0.5cm

通过对两组的草地贪夜蛾幼虫的转录组数据进行差异基因分析可以发现，实验组经吡啶骈他叮处理之后有一些基因发生了显著的变化(图5)，结果表明存在78个差异基因，其中有24个基因表达上调，54个基因表达下调，且差异表达的基因中实验组下调基因比上调基因多一倍，这表明吡啶骈他叮可能通过影响G4结构从而调控基因的表达。

为了探究吡啶骈他叮(PDS)所影响的具体基因类型，发明人对差异基因进行了热图分析，发现影响的基因中包含有免疫相关基因，如Galectin-4和C-terminal-bindingprotein等；还包含有解毒酶家族基因，如Cytochrome P450 6k1，Cytochrome P450 9e2，Cytochrome P450 4C1和Cytochrome P450 4d2等(图6)。这表明吡啶骈他叮可能通过影响G4结构来调控免疫基因和解毒酶基因的表达，从而导致草地贪夜蛾幼虫出现致死表型。

进一步对差异基因进行GO富集分析和KEGG富集分析，发明人发现差异基因前25条显著的GO条目主要富集在代谢和分解代谢过程(如核酸酶代谢、核酸酶分解代谢，小分子代谢和羧酸代谢等)(图7)，这些结果表明草地贪夜蛾幼虫出现发育延迟和死亡现象可能是由于代谢通路过程受到了吡啶骈他叮的影响导致的。

随后发明人对差异基因进行KEGG富集分析，发现前20条显著的通路结果与GO富集结果存在类似情况，主要富集在一些代谢通路(如药物代谢，嘌呤代谢等)，除此之外，还富集在甾类激素通路(Steroid hormone biosynthesis)，蛋白质消化吸收通路(Proteindigestion and absorption)和P450解毒酶家族(cytochrome P450)(图8)。有文献报道称20-羟基蜕皮酮(20E)就是该甾类激素通路中的一种，该激素在昆虫生长发育中发挥着至关重要的作用，可以调控器官发育和蜕皮变态过程，因此吡啶骈他叮(PDS)导致草地贪夜蛾幼虫发育延迟和死亡可能是吡啶骈他叮(PDS)与G4结构结合来调控了甾类激素通路的基因(如20E)表达，从而导致草地贪夜蛾幼虫发育异常，蜕皮失败和死亡。在富集的通路中还发现了P450解毒酶家族被显著影响，该结果与图6的结果相吻合，说明吡啶骈他叮(PDS)可能通过G4结构来调控P450基因的表达，从而降低草地贪夜蛾幼虫抵抗外界环境中有害因素的能力，从而导致幼虫出现死亡的现象。

考虑到传统KEGG(通路富集分析)和GO(功能富集)分析时，富集到的同一通路下的差异基因既有上调差异基因，也有下调差异基因。为了更为清楚的分析吡啶骈他叮(PDS)处理后的通路下调或上调的情况。发明人对差异基因进行GSEA富集分析(基因集富集)，结果表明吡啶骈他叮处理后，P450通路相对于对照组(CK)发生下调(图9中A)，该结果与KEGG富集分析(图8)和热图分析(图6)相吻合。此外，还发现吡啶骈他叮处理使草地贪夜蛾Toll免疫通路下调(图9中B)，有文献报道称Toll免疫通路是昆虫中极其重要的内在免疫通路和发育通路。由GSEA富集分析可以表明吡啶骈他叮(PDS)处理后会下调解毒酶P450家族通路和Toll免疫通路，从而导致草地贪夜蛾幼虫解毒能力下降和免疫系统损伤，使得幼虫出现死亡的表型。

综上所述，吡啶骈他叮(PDS)可以通过调控G4结构来调控相关基因的表达，从而导致代谢通路、甾类激素通路、P450解毒酶通路和Toll免疫通路的变化，使得草地贪夜蛾幼虫发育延迟，蜕皮失败和死亡，这表明吡啶骈他叮具有良好的杀虫作用，可以作为一种新型农药，或者作为农药增效剂和添加剂。

上面结合附图对本发明实施例作了详细说明，但是本发明不限于上述实施例，在所属技术领域普通技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本发明宗旨的前提下做出各种变化。此外，在不冲突的情况下，本发明的实施例及实施例中的特征可以相互组合。