一种芒草耐盐基因MsMYB112及其应用

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体公开了一种芒草耐盐基因及其应用。

背景技术

当前，土壤盐碱化已经成为一个全球性的问题。我国现有盐碱地面积约9913万hm

芒草（Miscanthus）是禾本科的多年生C4类草本植物，具有生物质产量高、纤维素含量丰富，种植成本低、适应能力强等特点，近年来备受人们的关注，被认为是一种开发潜力巨大的理想能源植物。芒草在中国种类丰富，分布广，芒草根系发达，有助于保持水土和改良土壤，对水肥依赖小，非常适合在干旱、盐碱等边际土地种植，从而实现不与粮争地。在提供生物质能源的同时，也具有良好的生态效应。选育耐盐碱芒草品种，增大盐碱地芒草种植面积，是解决我国“粮油争地”矛盾，保障食用油脂安全的一个有效途径。耐盐基因的挖掘是芒草抗性育种的基础。因此，耐盐基因的功能鉴定及分子机制研究，对借助转基因技术或分子辅助育种选育耐盐碱芒草品种，从而提高盐碱地利用效率具有重要意义。

MYB是植物转录因子中最大的家族之一，大多数植物的MYB以在其N端含有一段约51-52个氨基组成的MYB结构域为共同特征，MYB蛋白的分类主要是根据这个高度保守的DNA结合结构域，这个结构域通常是由至多4个氨基酸残基序列的重复组成，每一个都形成3个α-螺旋，每一个重复的第二个和第三个螺旋形成一个带有3个有规律的间隔色氨酸残疾（或疏水的）的螺旋-转角-螺旋（HTH）结构，形成一个3D（HTH）疏水核心结构，对维持HTH的构型有极为重要的意义。MYB转录因子的生物学功能很广泛，已经在拟南芥，水稻等中有很多报道，主要集中于次植物初生和次生代谢的调控，控制细胞的成长和分化，调控植物体对生物和非生物胁迫反应，参与植物生长过程的信号转导等。目前，芒草中已经明确具有耐盐功能的基因尚少。亟需挖掘鉴定芒草耐盐基因，为芒草分子辅助育种提供基因资源和理论基础。

发明内容

为了克服现有技术的缺陷，利用转基因技术，将MsMYB112基因转到拟南芥中进行过表达，该基因的转入显著降低了转基因拟南芥的耐盐性。同时，利用VIGS技术，将芒草中的MsMYB112基因进行沉默，沉默MsMYB112基因的芒草，其耐盐性显著增加。该发明提供了一种芒草耐盐基因及其应用。

本发明提供了一种芒草耐盐基因，所述芒草耐盐基因的核苷酸序列为SEQ IDNo.1，所述芒草耐盐基因的氨基酸序列为SEQ ID No.2。

进一步的，所述耐盐基因的开放阅读框为1056bp，共编码351个氨基酸。

本发明还公开了一种芒草耐盐基因的应用，以芒草幼嫩叶片的提取RNA，并反转录为cDNA，以此cDNA为模板，利用引物MsMYB112-F和MsMYB112-R进行PCR扩增，构建MsMYB112的过表达载体，采用农杆菌介导的花序浸染法转化拟南芥，分析并鉴定转基因拟南芥的耐盐性。

进一步的，所述引物MsMYB112-F和MsMYB112-R的序列分别为：

MsMYB112-F：5’-

MsMYB112-R：5’-

进一步的，所述PCR扩增体系为ddH2O、含Mg2+的缓冲液、dNTP、MsMYB112-F、MsMYB112-R、高保真PCR酶和芒草cDNA模板。

进一步的，所述PCR扩增引物的反应条件为：95℃预变性30s；95℃变性10s，55℃退火10s，75℃ 40s，36个循环；75℃后延伸10min。

进一步的，所述芒草耐盐基因在转基因拟南芥中的表达量上升。

进一步的，所述芒草耐盐基因可应用于降低转基因拟南芥的耐盐性。

本发明还公开了一种芒草耐盐基因的应用，其步骤如下：以芒草幼嫩叶片为材料提取RNA，并反转录为cDNA，以此cDNA为模板，利用引物MsMYB112-vigs-F和MsMYB112-vigs-R进行PCR扩增，构建MsMYB112的病毒介导的基因沉默（VIGS）载体，用于芒草的侵染，分析并鉴定芒草的耐盐性。

进一步的，所述引物MsMYB112-VIGS-F和MsMYB112-R的序列分别为：

MsMYB112-VIGS-F：

MsMYB112-VIGS-R：

进一步的，所述PCR扩增体系为ddH2O、含Mg2+的缓冲液、dNTP、MsMYB112-VIGS-F、MsMYB112-VIGS-R、高保真PCR酶和芒草cDNA模板。

进一步的，所述PCR扩增引物的反应条件为：95℃预变性30s；95℃变性10s，55℃退火10s，72℃ 30s，36个循环；72℃后延伸5min。

进一步的，所述芒草耐盐基因

进一步的，所述芒草耐盐基因可应用于提高转基因芒草的耐盐性。

与现有技术相比，本发明的优点和技术效果是：利用转基因技术，将芒草基因

附图说明

图1 MsMYB12-OX载体示意图

图2 MYB112-OX转基因拟南芥与野生型的生长状况对比图

图3 MYB112-OX转基因拟南芥与野生型绿叶率统计

图4 pTRV2-MsMYB112芒草基因沉默植株表达量鉴定

图5 MsMYB112基因沉默芒草与对照在NaCl处理下的表型

图6 盐胁迫下MsMYB112基因沉默芒草与对照的存活率

具体实施方式

下面结合实施例对本发明的技术方案做进一步的说明，但并不局限于此，凡是对本发明技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，均应涵盖在本发明的保护范围中。

实施例1：芒草

（1）芒草总RNA提取及cDNA合成

为了得到

根据phytozome公布的中国芒序列，使用NCBI Primer-BLAST在线网站设计正向和反向的特异性引物，引物名称：MsMYB112-F和MsMYB112-R，引物序列如下：

MsMYB112-F：5’-

MsMYB112-R：5’-

以芒草cDNA为模板，使用特异引物MsMYB112-F和MsMYB112-R进行扩增，通过PCR的方法分离克隆MsMYB112基因的编码区即CDS序列(序列见SEQ ID NO：1)，其蛋白质序列如SEQ ID NO:2所示。

在优选地实施方式中，所述芒草为南荻或者中国芒 。

实施例2：植物过表达载体的构建

以质粒pCambia1301作为载体，对该载体采用BamH I进行单酶切，随后利用同源重组酶对PCR扩增产物与BamH I酶切产物进行连接；10μL连接体系如下：2×同源重组酶混合物：5μl，BamH I单酶切后的载体：1μl；PCR扩增产物：4μl；50℃反应15分钟后，降至4℃或立即置于冰上冷却。在冰上解冻DH5α感受态细胞，将上述10μl重组产物加入到100μl感受态细胞中，轻弹管壁混匀(请勿振荡混匀)，冰上静置30min。42℃水浴热激45sec后，立即置于冰上冷却2-3min。

加入900μl不添加抗生素的LB培养基，37℃摇菌1h(转速200-250rpm)。

将含有卡那霉素抗性的LB固体培养基平板在37℃培养箱中预热。5,000rpm离心5min，弃掉900μl上清。用剩余培养基将菌体重悬，用无菌涂布棒在含有50mg/L卡那霉素抗性的平板上轻轻涂匀。37℃培养箱中倒置培养12-16h。

将菌落PCR鉴定为阳性的菌落，接种至含有卡那霉素的液体LB培养基中培养过夜，提取质粒进行测序。所得的表达载体命名为

实施例3

取1μg实施例2中得到的

将鉴定为阳性的农杆菌单菌落接种于含50mg/L卡那霉素和25mg/L的利福平的YEB抗性液体培养基中，在28℃、220rpm下培养20小时，取1mL菌液接种于含50mg/L卡那霉素和25mg/L的利福平的300mL YEB抗性液体培养基中，在28℃、200rpm下培养至OD＝0.7。培养结束后，5000rpm离心15分钟收集菌体，再将沉淀溶于300mL含有5％蔗糖的MS侵染液中，慢慢摇匀，将已经去果荚的野生型拟南芥花倒置入侵染液进行侵染，种子经过50mg/L的潮霉素筛选，得到转化MsMYB112基因的拟南芥。获取T2代

实施例4：转

得到的阳性拟南芥种子，在分别含有100mM和150mM NaCl的1/2 MS固体培养基上进行耐盐情况的表型观察。图2为过表达

实施例5：MsMYB112的基因沉默载体的构建

将TRV2载体用KpnI和NcoI双酶切，并回收酶切产物；随后利用同源重组酶对PCR扩增获得的产物片段与KpnI和NcoI双酶切后的载体片段进行连接；10μL连接体系设计如下：2×同源重组酶混合液：5μl，KpnI和NcoI双酶切后的载体片段：1μl；PCR扩增产物片段：4μl；50℃反应15分钟，降至4℃或立即置于冰上冷却。在冰上解冻DH5α感受态细胞，将上述10μl重组产物加入到100μl感受态细胞中，轻弹管壁混匀(请勿振荡混匀)，冰上静置30min，42℃水浴热激45sec后，立即置于冰上冷却2-3min。加入900μl不添加抗生素的LB培养基，37℃摇菌1h(转速200-250rpm)。5,000rpm离心5min，弃掉900μl上清。用剩余培养基将菌体重悬，用无菌涂布棒在含有50mg/L卡那霉素抗性的平板上轻轻涂匀。37℃培养箱中倒置培养12-16h。

将菌落PCR鉴定为阳性的菌落，接种至含有卡那霉素的液体LB培养基中培养过夜，提取质粒进行测序。所得的载体命名为pTRV2-MsMYB112。

实施例6：病毒介导的MsMYB112基因沉默

取1μg实施例5中得到的pTRV2-MsMYB112重组质粒加入到100μ GV3101农杆菌感受态中，轻轻混匀；电击转化后，加入600μL YEB液体培养基（不含抗生素），28℃ 180rpm复苏4h；5000 rpm离心5min后，弃掉部分上清，剩余150 μL重悬菌体，涂于YEB平板（含50 mg/LKan）；28℃倒置培养2-3d。

将鉴定为阳性的农杆菌单菌落接种于含50mg/L卡那霉素和25mg/L的利福平的YEB抗性液体培养基中，在28度、220rpm下培养20小时，取1mL菌液接种于含50mg/L卡那霉素和25mg/L的利福平的300mL LB抗性培养液体中，在28度、200rpm下培养达到OD＝0.7。同时，将pTRV1接种于含50mg/L卡那霉素和25mg/L的利福平的300mL LB抗性培养液体中进行培养达到OD＝0.7。然后将TRV1和pTRV2-MsMYB112菌液照1：1的比例进行等体积混合，在上述混合液中加入100μM乙酰丁香酮，3.3mM半胱氨酸，5mg/L吐温20，用于后续的侵染。

选取饱满的的芒草种子，播种到有2层湿润滤纸的培养皿中，然后放置于30℃的培养箱中进行萌发至芽长度0.5-1.0mm，进行下一步的实验。

将发芽的芒草种子浸入到混合液中，使用真空设备（LabServ LS-VO50）进行抽真空渗透侵染，真空压力为-0.095Mpa，时间为90min，然后放入28℃，200rpm/m的摇床中共培养5小时。共培养结束后将种子放在湿润的滤纸上或者土壤中进行生长，放入18℃生长箱中进行培养。

实施例：MsMYB112基因的表达量分析

采用Trizol法提取芒草总RNA，利用Nano Drop微量分光光度计检测总RNA的质量，并保存于-80℃备用；采用TransScript®One-Step gRemoval and c DNA SynthesisSuper Mix试剂盒(北京全式金生物技术有限公司)，反转录为cDNA。使用荧光定量PCR仪(Thermofisher ABI QuantStudio 1)进行实时荧光RT-PCR反应。PCR反应体系：模板cDNA 2μl，2×SYBR PCR Mix 10μl,Primer F 0.8μL,Primer R 0.8μl，加水补足至20μl。

引物如下：RT-MsMYB112F：5’-TGTTGATGAACGGCGGAGAT-3’，RT-MsMYB112R:5’-TGAGCTCCGGGTCTTGAAAC-3’

相对表达量的计算采用2-ΔΔCt法，以Actin1为内参基因，其引物如下Rt-MsActin1F: CACCTGAACCTTTCTGACCCAA

RT-MsActin1R: CTCGCCTATGTTGCCCTTGA

采用转pTRV1和pTRV2空载体作为对照，命名为pTRV:00，从图4中可以看出，经过病毒侵染的植株，MsMYB112基因表达量明显下降。

实施例8：

通过病毒介导的基因沉默，获得MsMYB112基因降低的植株，使用100mM进行处理，图5显示为基因沉默的植株与对照相比在100mM的NaCl处理下的表型，MsMYB112基因沉默后，芒草表现出较强的耐盐表型，图6统计了盐胁迫下的芒草的存活率，可以看出，MsMYB112基因沉默显著高于对照。这一结果表明，MsMYB112基因与芒草的耐性表型相关，而基于这一结果，可为芒草耐盐新品种培育奠定一定技术和理论基础。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

SEQ ID No.1

ATGGCCGCAACACAGCAGATCAGGAGCAGGAGCAGCGCCGCCGCCGCCGCCAAGGCTGCTGCTTGCTCCCGGCCGGCCGTTGCTCCCGTTGATGAGGTCGTCGACGAGGAGCACGGCGGCCACCGCCGCCAGCAGGGAGGTGGAGCGCAGGAGGAGGCCGAGAAGAAGCCGGAGCTCCGGCGTGGCCCGTGGACCGTAGACGAGGACCTCACCCTCGTCAACTACATCGCCGACAACGGCGAGGGCCGCTGGAACAACCTCGCCCGCGCCGCCGGTCTGAAGCGGACGGGCAAGAGCTGCCGCCTGCGGTGGCTCAACTACCTCCGGCCCGACGTGAAGCGCGGCAACTTCAGCGCCGACGAGCAGCTGCTCATCCTCGACCTCCACACACGCTGGGGCAACCGGTGGTCAAAGATCGCGCAGCACCTGCCGGGGAGGACGGACAACGAGATCAAGAACTACTGGAGGACCCGGGTGCAGAAGCACGCCAAGCAGCTCAACTGCGACGCCAACAGCAAGCGCTTCAAGGACGCCATGCGCTACCTCTGGATGCCACACCTCGTCGACATCGACATCGCCGCTGCTGCGGCCGACGACCACCACCTACGCCTCCTCCACCACCAGCAGCATGCTGCGGCCGCCGGCGCTGGCAACGACCTCGCTGGTGGCTACGCTGCCGCTGACGTCCAGCTGCATGCGCTGTCGTCGGGCATGGCGGCGATGACGACGACTACGTCGTCGTCCGACTCGCTCGCGTCGGAGTCGTACGAGGACGGCGGCGGCCTCTTCGCGAACGTGCGCGCCGGCGAGATGTTGATGAACGGCGGAGATTGGGCGGCGCAGGAGGCCAACCACCAGGGGCTATGGCCGTCGTCTGATCATGATCAGTCGGCCGTGCAGGTGCAGGCTACTACCGGTGGGCAGTTTCAAGACCCGGAGCTCAGTGGATGGGTGCAAGGCTTCTCCGAGAGCATTACCGACAACTTTTGGCCGGGCCTTGGAGGAAATTTGGAAGATGCAATGAGCAATTTTACGTTTTACACATCCAAAGACTGA

SEQ ID No.2

MAATQQIRSRSSAAAAAKAAACSRPAVAPVDEVVDEEHGGHRRQQGGGAQEEAEKKPELRRGPWTVDEDLTLVNYIADNGEGRWNNLARAAGLKRTGKSCRLRWLNYLRPDVKRGNFSADEQLLILDLHTRWGNRWSKIAQHLPGRTDNEIKNYWRTRVQKHAKQLNCDANSKRFKDAMRYLWMPHLVDIDIAAAAADDHHLRLLHHQQHAAAAGAGNDLAGGYAAADVQLHALSSGMAAMTTTTSSSDSLASESYEDGGGLFANVRAGEMLMNGGDWAAQEANHQGLWPSSDHDQSAVQVQATTGGQFQDPELSGWVQGFSESITDNFWPGLGGNLEDAMSNFTFYTSKD*。