白茅种子内生真菌DF101及其应用

技术领域

本发明属于微生物技术领域，具体涉及一株种子内生真菌（

背景技术

由于矿山开采与冶炼、化肥农药的大量使用、农田污灌以及固体废弃物弃置等人类活动，土壤重金属污染越来越严重。我国土壤总超标率为16.1%，其中镉、汞、砷等8种重金属超标点位数占全部超标点位的82.8%。在各种重金属污染物中，镉（Cd）因其强大的生物毒性和高转移风险而被确定为最重要的污染物之一。土壤中过量的重金属不仅会抑制作物生长，还会通过食物链产生毒性放大作用，严重威胁着人类健康。因此，修复土壤中的重金属污染已迫在眉睫。

在所有修复方法中，植物修复因其原位、环保、费用低、操作简单而在重金属污染土壤修复中展现出较好的应用前景。然而，在实际应用中，植物修复仍存在修复效率低、费时等问题，植物-微生物联合修复有望解决这些问题。因为许多微生物能通过产生植物生长素、改善植物的营养吸收、改变土壤中重金属的生物有效性等促进植物在重金属污染环境的生长，从而增加其生物量，提高修复效率。

种子是植物的繁殖器官，种子内定殖有一定数量的内生菌。研究表明，许多作物的种子，包括水稻、小麦、棉花、玉米等都含有内生菌，内生菌不但可以促进宿主植物的生长发育还可以保护其免受病原体的侵害。由于部分种子内生菌是通过种子进行垂直传播并成为新生植物体内最早定殖的微生物，因而对宿主植物来说，种子内生菌具有更重要的生态学意义。例如，Mastretta等证明了接种抗镉内生菌的烟草种子可以在镉胁迫下生长，该种子内生菌降低了镉对烟草的重金属毒性；Johnston-Monje 等发现来源于玉米种子的内生菌，可通过固氮、分泌铁载体等功能刺激宿主植物，使其能够快速适应包括重金属胁迫在内的恶劣环境；Truyens等研究表明，在镉胁迫下拟南芥（

发明内容

本发明提供了一株植物种子内生真菌DF101，分类命名为

本发明另一目的是提供上述植物种子内生真菌DF101的新用途，即将其应用在镉污染的生物修复中，本发明白茅种子内生真菌DF101具有产IAA、产铁载体的能力、较高的解磷能力，具有较强的镉耐受性，在镉胁迫下能促进种子萌发、提高幼苗存活率、增强其镉抗性。

为了实现以上目的，本发明采取以下技术方案：

1、将采集自云南省建水市普雄乡的白茅（

2、从植物样品中随机挑选出种子600粒，按下列程序进行表面消毒：体积浓度75%的乙醇表面消毒2次，每次时间为1min，然后用无菌水冲洗5次，置于无菌滤纸上吸干水分。之后将表面消毒后的种子贴到PDA平板上，25℃培养，隔天观察，培养期间见组织块周围有真菌长出，则挑取、纯化；同时，通过漂洗液检验法检验种子表面消毒是否彻底；

3、配制含不同Cd

4、菌株DF101的鉴定

（1）DF101形态学特征：培养初期菌落边缘整齐呈白色，长有茂密的灰色菌丝，呈棉絮状，近圆形，不透明，6d后菌落开始变成黄褐色；

（2）分子鉴定：采用MoBio PowerSoil® DNA试剂盒提取该菌株总DNA，经检测后送测序公司进行序列测定，将测序结果与NCBI上序列进行比对；结合形态学特征和分子鉴定结果，最终将该菌株鉴定为

5、本发明将从白茅中分离得到的种子内生真菌

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

本发明提供的种子内生真菌

附图说明

图1为白茅种子内生真菌DF101在PDA培养基上的菌落形态（图A：正面，B：背面）；

图2为磷标准溶液的标准工作曲线；

图3为IAA标准溶液的标准工作曲线；

图4为

图5为对不同浓度镉胁迫下，

具体实施方式

下面结合具体实施例和附图对本发明的技术方案做进一步详细说明，但本发明并不局限于以下技术方案。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。本领域的普通技术人员可以参照本发明申请日之前的各种常用工具书、科技文献或相关的说明书、手册等加以实施；

下述实施例中铬天青S（CAS）检测液的配制为：

溶液A：称取60.5mg铬天青溶解于50mL去离子水中，加入10mL Fe

溶液B：将72.9mg十六烷基三甲基溴化胺溶于40mL去离子水；

将溶液A缓慢倒入溶液B中搅拌均匀，即得CAS蓝色检测液。

实施例1：种子内生真菌

（1）采集云南省建水市普雄乡的白茅样品，将植物样品置于阳光下晾晒风干至种子可以自然脱落，然后将种子样品置于4℃冰箱中保存备用；

（2）内生菌的分离：从种子样品中随机挑选出种子600粒，用体积浓度75%的乙醇表面消毒2次，每次时间为1min，然后用无菌水冲洗5次，置于无菌滤纸上吸干水分。之后将表面消毒后的种子贴到PDA平板上（90mm），每皿6粒，25℃培养60d，隔天观察，培养期间见组织块周围有真菌长出，则挑取、纯化；同时，通过漂洗液检验法检验种子表面消毒是否彻底；

（3）镉抗性菌株的筛选：配制含Cd

（4）菌株DF101的鉴定

①DF101形态学特征：培养初期菌落边缘整齐呈白色，长有茂密的灰色菌丝，呈棉絮状，近圆形，不透明，6d后菌落开始变成黄褐色（图1 A：正面、B：背面）；

②分子鉴定：采用MoBio PowerSoil® DNA试剂盒提取该菌株总DNA，经检测后送测序公司进行序列测定，测序结果如SEQ ID NO:1所示，将测序结果与NCBI上序列进行比对；结合形态学特征和分子鉴定结果，其与

实施例 2：种子内生真菌

将分离得到的内生菌株接种到PDA平板上，配制含Cd

生长抑制率=（对照菌丝干质量-处理菌丝干质量）/对照菌丝干质量×100 %

结果见表1，菌株

表1 菌株DF101重金属耐受能力

注：上表中“+”具良好抗性；“+-”有抗性，但生长状况不佳；“-”无抗性。

实施例 3：种子内生真菌

溶磷能力：将

①取发酵液10000rpm离心15min，取上清液1mL置于50mL容量瓶中，加入2，6-二硝基苯酚指示剂2滴，用10%氢氧化钠或者5%稀硫酸调节pH至溶液刚呈微黄色，加入钼锑抗显色剂5mL后加入去离子水定容至50mL；

②静置30min后在分光光度计700nm下比色，同时测定空白对照组；

③实验同时绘制磷标准曲线，分别吸取5mg/L磷标准溶液0、2、4、6、8、10mL于50mL容量瓶中，加入2，6-二硝基苯酚指示剂2滴，用10%氢氧化钠或者5%稀硫酸调节pH至溶液刚呈微黄色，加入钼锑抗显色剂5mL后加入去离子水定容至50mL，获得0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mg/L磷标准系列溶液，静置30min后在分光光度计700nm下比色，绘制标准工作曲线（图2），然后将步骤②测得的吸光度值代入标准工作曲线，获得

实施例4：种子内生真菌

实施例5：种子内生真菌

将

计算结果为菌株DF101的螯合铁载体能力为74.52%，铁载体是一类由低铁环境中细菌和真菌合成并分泌的具有很强特异性螯合Fe

实施例6：重金属胁迫下种子内生真菌

本实施例旨在证明

A、

B、选择大小均匀且饱满的土荆芥种子进行表面消毒: 体积分数75%的乙醇漂洗2次，每次时间为2min30s，无菌水冲洗5次。将表面消毒后的种子浸泡在DF101菌丝悬浮液中为（E+），浸泡2h定殖，种子浸泡在等体积的无菌水中为对照组（CK）将浸泡后的种子置于浸润在含有不同浓度的Cd

结果如图5所示，结果显示

上述实施例的结果说明本发明中分离得到的种子内生真菌