一种青春双歧杆菌的培养基

技术领域

本发明涉及培养基，属于一种青春双歧杆菌的培养基。

背景技术

益生菌一类对宿主有益的活性微生物，它们可以调节肠道内菌群平衡，促进营养吸收，保持肠道健康，从而有利于人体健康。双歧杆菌(Bifidobacteriumspp.)是一类常见的益生菌。双歧杆菌在19世纪末被研究者从婴儿的粪便中发现并提出，经过时间的验证，双歧杆菌被确定为是一种对人和动物有益的，重要的肠道益菌。直到2021年1月已有65个种的双歧杆菌，其中与人类密切相关的就有12种，青春双岐杆菌(B.adolescentis)就是其中之一。青春双岐杆菌属于放射菌门，放射菌纲，放线菌目，放线菌科，双歧杆菌属。青春双歧杆菌是革兰氏阳性菌，菌体多形态，常见形态为短的，弯曲的，偶尔分叉的杆状。它的最适的生长温度在35-37℃，适宜pH值为6.7-7.0，发酵葡萄糖产乳酸。青春双歧杆菌主要存在人和动物的肠道中，人体青春的时期是青春双岐杆菌的存在期。青春双歧杆菌可以有效控制人体肠道内的菌群平衡，它能产生乙酸和乳酸，抑制致病菌的有害发酵，促进肠胃蠕动，使人体正常排便；能够对外来致病菌产生拮抗作用，使外来致病菌无法定植在肠道内，治疗腹泻；能够保护人体细胞免受致癌物质的损害，具有提高人体免疫力的作用

但是现有技术中青春双歧杆菌在冻干后往往存活率较低，无法生产高产量及高冻干存活率的青春双歧杆菌。

发明内容

本发明的目的在于提供一种青春双歧杆菌的培养基，以解决背景技术中的问题。

为达到上述目的，本发明提供如下技术方案：

一种青春双歧杆菌的培养基，包括：10.0g/L的蛋白胨、10.0g/L的酵母膏、20.0g/L的乳糖、10.0g/L的牛肉粉、5.0g/L的乙酸钠、2.0g/L的磷酸氢二钾、2.0g/L的柠檬酸氢二铵、1.0g/L的L-半胱氨酸盐酸盐、0.58g/L的硫酸镁、0.25g/L的硫酸锰、1.0g/L的吐温80以及0.5-4g/L的小肠类器官培养物活性粉末。

进一步地，所述小肠类器官培养物活性粉末的制备方法为：提取猪原代小肠隐窝上皮细胞，以基质胶包埋后用小肠类器官基础培养基培养24小时后，收集所述小肠类器官基础培养基的上清液，经过冻干处理后，制成小肠类器官培养物活性粉末。

进一步地，所述小肠类器官基础培养基的制备方法为：按终浓度计算，将为1％的青链霉素、1％的L-谷氨酰胺、10％的FBS和1％的HEPES加入至DMEM/F-12培养基，再加入50-200ng/mL的细胞生长因子EGF、100-400ng/mL的R-spondin1、0.5-2mM的N-acetylcysteine和50-200ng/mL的Noggin。

本发明的有益效果在于：本发明的培养基引进了小肠类器官培养物活性粉末，相对于普通青春双歧杆菌培养基，提高了青春双歧杆菌的产量及冻干后存活率。

上述说明仅是本发明技术方案的概述，为了能够更清楚了解本发明的技术手段，并可依照说明书的内容予以实施，以下以本发明的较佳实施例详细说明如后。

附图说明

图1为实施例1-4及对比例1培养结果。

图2为实施例2及对比例1培养的青春双歧杆菌冻干存活率。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明的技术方案作进一步的描述，但本发明不应限于这些实施例，除非特别叙述，均可被其他等效或具有类似目的的替代特征加以替换。除非特别叙述，每个特征只是一系列等效或类似特征中一个例子而已。在本发明中所使用的术语，除非另有说明，一般具有本领域普通技术人员通常理解的含义。以下实施例中，除另有说明的，浓度％是指质量百分数；使用的物质均可通过市售获得。下面结合具体实施例对本发明的技术方案作进一步的描述，但本发明不应限于这些实施例，除非特别叙述，均可被其他等效或具有类似目的的替代特征加以替换。除非特别叙述，每个特征只是一系列等效或类似特征中一个例子而已。在本发明中所使用的术语，除非另有说明，一般具有本领域普通技术人员通常理解的含义。

实施例1

制备小肠类器官基础培养基：按终浓度计算，将为1％的青链霉素、1％的L-谷氨酰胺、10％的FBS和1％的HEPES加入至DMEM/F-12培养基，再加入100ng/mL的细胞生长因子EGF、200ng/mL的R-spondin1、1mM的N-acetylcysteine和100ng/mL的Noggin。

提取猪原代小肠隐窝上皮细胞，以基质胶包埋后用上述小肠类器官基础培养基培养24小时后，收集所述小肠类器官基础培养基的上清液，经过冻干处理后，制成小肠类器官培养物活性粉末。

青春双歧杆菌的培养基，包括：10.0g/L的蛋白胨、10.0g/L的酵母膏、20.0g/L的乳糖、10.0g/L的牛肉粉、5.0g/L的乙酸钠、2.0g/L的磷酸氢二钾、2.0g/L的柠檬酸氢二铵、1.0g/L的L-半胱氨酸盐酸盐、0.58g/L的硫酸镁、0.25g/L的硫酸锰、1.0g/L的吐温80以及0.5g/L的小肠类器官培养物活性粉末。将青春双歧杆菌在37度条件下厌氧培养9小时。

实施例2

制备小肠类器官基础培养基：按终浓度计算，将为1％的青链霉素、1％的L-谷氨酰胺、10％的FBS和1％的HEPES加入至DMEM/F-12培养基，再加入100ng/mL的细胞生长因子EGF、200ng/mL的R-spondin1、1mM的N-acetylcysteine和100ng/mL的Noggin。

提取猪原代小肠隐窝上皮细胞，以基质胶包埋后用上述小肠类器官基础培养基培养24小时后，收集所述小肠类器官基础培养基的上清液，经过冻干处理后，制成小肠类器官培养物活性粉末。

青春双歧杆菌的培养基，包括：10.0g/L的蛋白胨、10.0g/L的酵母膏、20.0g/L的乳糖、10.0g/L的牛肉粉、5.0g/L的乙酸钠、2.0g/L的磷酸氢二钾、2.0g/L的柠檬酸氢二铵、1.0g/L的L-半胱氨酸盐酸盐、0.58g/L的硫酸镁、0.25g/L的硫酸锰、1.0g/L的吐温80以及1g/L的小肠类器官培养物活性粉末。将青春双歧杆菌在37度条件下厌氧培养9小时。

实施例3

制备小肠类器官基础培养基：按终浓度计算，将为1％的青链霉素、1％的L-谷氨酰胺、10％的FBS和1％的HEPES加入至DMEM/F-12培养基，再加入100ng/mL的细胞生长因子EGF、200ng/mL的R-spondin1、1mM的N-acetylcysteine和100ng/mL的Noggin。

提取猪原代小肠隐窝上皮细胞，以基质胶包埋后用上述小肠类器官基础培养基培养24小时后，收集所述小肠类器官基础培养基的上清液，经过冻干处理后，制成小肠类器官培养物活性粉末。

青春双歧杆菌的培养基，包括：10.0g/L的蛋白胨、10.0g/L的酵母膏、20.0g/L的乳糖、10.0g/L的牛肉粉、5.0g/L的乙酸钠、2.0g/L的磷酸氢二钾、2.0g/L的柠檬酸氢二铵、1.0g/L的L-半胱氨酸盐酸盐、0.58g/L的硫酸镁、0.25g/L的硫酸锰、1.0g/L的吐温80以及2g/L的小肠类器官培养物活性粉末。将青春双歧杆菌在37度条件下厌氧培养9小时。

实施例4

制备小肠类器官基础培养基：按终浓度计算，将为1％的青链霉素、1％的L-谷氨酰胺、10％的FBS和1％的HEPES加入至DMEM/F-12培养基，再加入100ng/mL的细胞生长因子EGF、200ng/mL的R-spondin1、1mM的N-acetylcysteine和100ng/mL的Noggin。

提取猪原代小肠隐窝上皮细胞，以基质胶包埋后用上述小肠类器官基础培养基培养24小时后，收集所述小肠类器官基础培养基的上清液，经过冻干处理后，制成小肠类器官培养物活性粉末。

青春双歧杆菌的培养基，包括：10.0g/L的蛋白胨、10.0g/L的酵母膏、20.0g/L的乳糖、10.0g/L的牛肉粉、5.0g/L的乙酸钠、2.0g/L的磷酸氢二钾、2.0g/L的柠檬酸氢二铵、1.0g/L的L-半胱氨酸盐酸盐、0.58g/L的硫酸镁、0.25g/L的硫酸锰、1.0g/L的吐温80以及4g/L的小肠类器官培养物活性粉末。将青春双歧杆菌在37度条件下厌氧培养9小时。

对比例1原培养系统

青春双歧杆菌的培养基，包括：10.0g/L的蛋白胨、10.0g/L的酵母膏、20.0g/L的乳糖、10.0g/L的牛肉粉、5.0g/L的乙酸钠、2.0g/L的磷酸氢二钾、2.0g/L的柠檬酸氢二铵、1.0g/L的L-半胱氨酸盐酸盐、0.58g/L的硫酸镁、0.25g/L的硫酸锰、1.0g/L的吐温80以及4g/L的小肠类器官培养物活性粉末。将青春双歧杆菌在37度条件下厌氧培养9小时。

实施例1-4及对比例1青春双歧杆菌培养结果如图1所示，可以看出在添加小肠类器官培养物活性粉末大于等于1.0g/L的浓度下，对青春双歧杆菌的产量是有显著提高的；添加浓度大于1.0g/L时，提高的产量差别不明显；在4.0g/L的时候产量略有下降。对比例1原培养方法青春双歧杆菌培养基培养的活菌数1.17×10

将实施例2和对比例1培养得到的青春双歧杆菌采取相同工艺进行冻干处理，包括菌体收集、菌体重悬、吸去水分及冷冻干燥。然后在常温和冷藏(4℃)的条件下保存0天、7天、14天、30天、90天和180天，分别复苏并测定菌种的冻干存活率。结果显示：第14天：冷藏条件下，实施例2的菌种冻干存活率为88.02％，比对比例1的菌种冻干存活率为72.11％有显著的提高；常温条件下，实施例2的菌种冻干存活率为68.68％也比对比例1的60.45％要高。180天后，冷藏储存的菌种的存活率要显著高于常温储存，常温储存条件下，对比例1原培养系统和实施例2对菌种冻干存活率的影响无显著差异。在冷藏条件下，实施例2的新系统菌种冻干存活率为73.49％，也显著高于原培养系统的菌种冻干存活率52.35％。

菌种存活率计算方法如下：

冻干(储存)后的活菌数

菌种存活率(％)＝———————————————×100％。

冻干(储存)前的活菌数

以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。