D-阿洛酮糖的制备方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种异构酶在制备D-阿洛酮糖中的应用以及D-阿洛酮糖的制备方法。

背景技术

D-阿洛酮糖(D-psicose)也称为阿卢糖，是D-果糖(D-fructose)的C-3差向异构体，但由于其在人体内几乎是不可代谢的，因此其热量极低，仅相当于蔗糖的0.3％，而其甜度却相当于蔗糖的70％，同时D-阿洛酮糖具有与蔗糖相近的口感及容积特性，并与蔗糖一样可与食物中的氨基酸或蛋白质发生美拉德反应，可作为食品中蔗糖的理想替代品。据科学研究证实，D-阿洛酮糖在预防肥胖、调节血糖、降血脂以及抗氧化等方面更具有独特的生理学功能，在食品、饮料、保健、医药等领域拥有巨大的市场前景。然而天然存在的D-阿洛酮糖很少，且化学合成法存在经济性差、环境污染严重等缺点，因此，目前D-阿洛酮糖的制备多以生物转化法为主，此方法的优势在于反应条件温和、无需有毒试剂、环境相容性好等方面。

D-阿洛酮糖的生物转化最早由日本香川大学Ken Izumori教授提出，利用己糖醇作为中间体，完成稀少己酮糖之间的生物转化，即Izumoring生物转化法。1993年，Izumoring等从菊苣假单胞菌(Pseudomonas sp.ST-24)中首次发现D-酮糖3-差向异构酶，其最适底物为D-塔格糖，故命名为D-塔格糖-3-差向异构酶(D-tagatose 3-epimerase,DTE)(Izumori K,et al.,A New Enzyme,D-Ketohexose 3-Epimerase,from Pseudomonassp.ST-24[J].Bioscience Biotechnology and Biochemistry,2008,57(6):1037-1039)。2005年，KIM等从Agrobacterium tumefaciens中分离得到D-阿洛酮糖-3-差向异构酶(D-psicose-3-epimerase，DPE)，该酶是一种典型的己酮糖-3-差向异构酶，可以催化D-果糖的C-3位置的差向异构化制备D-阿洛酮糖(Kim H J,et al.,Characterization of anAgrobacterium tumefaciens D-Psicose 3-Epimerase That Converts D-Fructose toD-Psicose[J].Applied and Environmental Microbiology,2006)。

D-阿洛酮糖-3-差向异构酶催化D-果糖转化成D-阿洛酮糖的过程是一个热力学平衡反应，随着异构化温度的升高，会促进异构化反应向D-阿洛酮糖方向进行。有报道指出，大多数DPE催化D-阿洛酮糖产D-果糖的效率是催化D-果糖产D-阿洛酮糖效率的2～3倍，从而导致D-阿洛酮糖的产率较低。如果能在高温如70℃或更高的异构化温度下催化，会促使平衡正向进行，提高D-阿洛酮糖的产率。然而，天然的D-阿洛酮糖-3-差向异构酶存在热稳定性差、催化效率低且半衰期短的缺点，因此筛选出能够适用于工业化生产的高效D-阿洛酮糖-3-差向异构酶已成为生物催化法制备D-阿洛酮糖亟待解决的问题。

专利CN104903457A从4种不同来源的具有酮糖-3-差向异构酶活性的多肽蛋白中筛选出对阿洛酮糖转化率最高的酮糖-3-差向异构酶(seq 6)，该基因来源于Desmosporasp.8437，并对生产阿洛酮糖的规模进行放大处理以及酶的固定化制备。

专利CN101189332B公开了一种利用源自根瘤土壤杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)的D-阿洛酮糖-3-差向异构酶(seq.1)生产D-阿洛酮糖的方法，优化了金属离子、反应时间及底物特异性条件，同时通过固定化酶的形式提高酶的稳定性。

专利CN111836889A公开了热稳定性提高的源自球形节杆菌(Arthrobacterglobiformis)酮糖-3-差向异构酶突变体。该突变体具有良好的热稳定性，但该专利中并未提及具体酶活及阿洛酮糖的转化率。

专利CN108473991A公开了一种由果糖生产阿洛糖混合物(含果糖、阿洛糖和阿洛酮糖)重组菌株，该菌株的重组载体中含有阿洛酮糖差向异构酶和阿洛糖差向异构酶融合蛋白的核酸序列。当重组菌种中的阿洛酮糖差向异构酶和阿洛糖差向异构酶基因分别来源于闪烁梭菌(Clostridiun scidens)和海皮尔氏菌(Persephonella marina)EX-H1时，糖混合物中，阿洛酮糖的含量为24％～26％。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是为了克服现有技术中缺少高效且具有良好温度稳定性的异构酶用于制备D-阿洛酮糖的缺陷，提供了一种D-阿洛酮糖的制备方法。本发明使用的异构酶或酶组合在制备D-阿洛酮糖时具有良好的产率，同时具有良好的可溶稳定性和温度稳定性。

本发明通过以下技术方案解决上述技术问题。

本发明的第一方面提供一种异构酶或酶组合在制备D-阿洛酮糖中的应用，所述异构酶为来源于梭状芽孢杆菌(Clostridiales bacterium)、嗜热新芽孢杆菌(Novibacillusthermophilus)、丙酸弧菌(Propionivibrio sp)或细菌1XD42-54的异构酶；

所述酶组合包括所述异构酶的两种或两种以上。

本发明一些实施方案中，所述异构酶为NCBI登录号OKZ99022.1、WP_077721022.1、MBP7203468.1或RKJ49387.1对应的酶。

本发明中，当所述异构酶为NCBI登录号OKZ99022.1对应的酶时，编码所述异构酶的序列具有如SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列。

本发明中，当所述异构酶为NCBI登录号WP_077721022.1对应的酶时，编码所述异构酶的序列具有如SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列。

本发明中，当所述异构酶为NCBI登录号MBP7203468.1对应的酶时，编码所述异构酶的序列具有如SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列。

本发明中，当所述异构酶为NCBI登录号RKJ49387.1对应的酶时，编码所述异构酶的序列具有如SEQ ID NO:4所示的核苷酸序列。

本发明的第二方面提供一种酶组合，所述酶组合包括两种或两种以上如第一方面所述的异构酶。

本领域技术人员知晓，当一种或几种具有相同或相似的酶同时存在时，其对所参与的同一反应的效果可以预期。

本发明的第三方面提供一种制备D-阿洛酮糖的方法，所述方法包括：

以D-果糖为底物，通过异构酶或酶组合进行催化反应即得；

其中，所述异构酶如第一方面所述；所述酶组合如第二方面所述。

本发明中，所述异构酶或酶组合的使用形式为液态酶、固态酶、固定化酶或表达了所述异构酶的细胞。

本发明中，所述异构酶或酶组合的使用形式为粗酶和/或纯化酶。

本发明一些实施方案中，所述催化反应通过包含所述异构酶或酶组合的粗酶液进行。

本发明中，所述粗酶液通过以下步骤制备：

将表达所述异构酶的湿菌体破碎后在10000-15000rpm下离心3-10min，收集上清液即得。

所述破碎是指：将湿菌体以1:(5～10)的质量体积比加入缓冲液(pH7.0)，悬浮菌体，对所得悬浮菌体在4℃，600bar进行均质破碎。

本发明一些实施方案中，所述湿菌体与所述缓冲液的质量体积比1:10。

所述缓冲液可为本领域常规，例如50mM pH 7.0PBS缓冲液。

例如，将湿菌体以1:10(g:mL)的比例加入50mM pH 7.0PBS缓冲液，悬浮菌体，在4℃，600bar对所得悬浮菌体进行均质破碎。

本发明一些具体实施方案中，所述粗酶液通过以下步骤制备：

将表达所述异构酶或酶组合的湿菌体破碎后在12000rpm下离心5min，收集上清液即得。

本发明一些实施方案中，每1mL所述催化反应的反应体系中包含：500～800mg果糖、60～90μL包含所述异构酶或酶组合的粗酶液；

所述催化反应的反应条件为：pH 5.5～6.0，50～55℃。

本发明一些具体实施方案中，每1mL所述催化反应的反应体系中包含：750mg果糖、80μL包含所述异构酶或酶组合的粗酶液；

所述催化反应的反应条件为：pH 6.0，50℃。

本发明一些实施方案中，所述反应体系中还包含pH调节剂和/或金属离子辅因子；例如，所述反应体系中还包含pH调节剂或金属离子辅因子；或者，所述反应体系中还包含pH调节剂和金属离子辅因子。

本发明中，所述pH调节剂为PBS缓冲溶液，例如为200mM的PBS缓冲溶液(pH 6.0)。

本发明中，所述金属离子辅因子选自200mM的CoCl

本发明一些实施方案中，所述金属离子辅因子为CoCl

本发明的第四方面提供一种基因工程菌，所述基因工程菌表达如第一方面所述的异构酶或者如第二方面所述的酶组合。

本发明的第五方面提供一种包含D-阿洛酮糖的组合物，所述组合物由如第二方面所述的方法制备得到。

在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。

本发明所用试剂和原料均市售可得。

本发明的积极进步效果在于：

本发明的异构酶在制备D-阿洛酮糖时具有良好的产率，同时具有良好的可溶稳定性和温度稳定性，为从果糖制备D-阿洛酮糖提供了更为高效、稳定的方法，具有工业化应用前景。

附图说明

图1为D-果糖对照品HPLC图谱截图，D-果糖保留时间为10.425min。

图2为D-阿洛酮糖对照品HPLC图谱截图，D-阿洛酮糖保留时间为8.311min。

具体实施方式

下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。

HPLC检测方法：

色谱柱：Agilent ZORBAX NH2(250×4.6mm，5μm)。流动相：乙腈:水＝80:20，流速：1.0mL/min，浓度：1mg/mL，进样量：10μL，柱温：35℃，采用示差检测器检测。如图1所示，D-果糖对照品的保留时间为10.425min，如图2所示，D-阿洛酮糖对照品的保留时间为8.311min。

实施例1异构酶基因的获取

从NCBI检索来源于不同物种的异构酶，基因来源与GeneBank登录号如表1所示，以上所有基因均由生工生物工程(上海)股份有限公司(上海市松江区香闵路698号)合成，所用酶切位点为Nde I、Hind III，克隆至pET28a载体使得N端6His标签可以表达，得到含异构酶基因的质粒。

表1异构酶基因来源列表

实施例2异构酶粗酶液的制备

将实施例1中构建好的含异构酶基因的质粒转入Ecoli BL21(DE3)宿主细胞，涂布于含50μg/mL卡那霉素的抗性LB平板，37℃倒置培养16h，挑取单菌落接种于含50μg/mL卡那霉素的抗性LB培养基中，37℃培养5h，按照1％(v/v)的接种量转接至含50μg/mL卡那霉素的TB培养基，37℃、220rpm培养至OD

将上述菌体以1:10(g:mL)的比例加入50mM pH 7.0PBS缓冲液，悬浮菌体，利用均质机对所得悬浮菌体进行破碎(4℃，600bar)，12000rpm离心5min，取上清液，即可得到含有异构酶的粗酶液，-20℃冷藏保存，备用。

实施例3D-阿洛酮糖产率的测定

在1mL反应体系中加入250μL 200mM PBS缓冲液(pH 6.0)，10μL 100mM CoCl

将上述反应液于12000rpm下离心5min，取上清液，用0.22μm水膜过滤，通过装备示差检测器的高效液相色谱仪进行检测，检测结果如表2所示。

表2 D-阿洛酮糖产率

实施例4D-阿洛酮糖-3-差向异构酶可溶稳定性和温度稳定性测定

将实施例3中筛选出转化率高的酶Enz.1、Enz.2、Enz.3、Enz.4以及对照组的粗酶液分别放置于50℃水浴锅，保温2h、4h、6h、22h。

可溶稳定性测定：将上述热处理后的酶通过SDS-PAGE测定可溶性目的蛋白残余量，测定结果见表3。

温度稳定性测定：将上述热处理后的酶参照实施例3方法测定D-阿洛酮糖产率，测定结果见表4。

表3可溶性残余蛋白含量测定结果

注：*****表示残余可溶性蛋白＞90％，****表示70％＜残余可溶性蛋白≤90％，***表示50％＜残余可溶性蛋白≤70％，**表示30％＜残余可溶性蛋白≤50％，*表示表示0＜残余可溶性蛋白≤30％。

从测定结果可知，对比酶1在50℃处理6h蛋白出现沉降，到22h蛋白全部沉降；而酶Enz.1、Enz.2、Enz.3表现出较好的可溶性。

表4温度稳定性测定结果

从测定结果可知，热处理2h后的对比酶1，其催化生成D-阿洛酮糖的转化率降为0，而酶Enz.1、Enz.2、Enz.3依然能保持相对较高的D-阿洛酮糖产率。

SEQUENCE LISTING

<110> 弈柯莱生物科技（上海）股份有限公司

<120> D-阿洛酮糖的制备方法

<130> P22010971C

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<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

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<212> DNA

<213> Artificial Sequence

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<223> 酶Enz.1

<400> 1

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