评估人体免疫系统年龄的检测项组合及检测方法

技术领域

本发明属于生物医学检测领域，涉及一种评估人体免疫系统年龄的检测项组合，基于上述检测项组合的评估方法，可以精确反应免疫系统的真实年龄。

背景技术

免疫系统会随着年龄的增长而改变。过了40岁后，体内的免疫细胞就开始大幅度老化，使得对抗病毒、细菌的能力下降，感染疾病、慢性疾病与癌症的风险增高。免疫顶级科学家Guido Kroemer首次将免疫系统衰老进行定义，并明确给出免疫系统衰老的8大特征：包括胸腺退化、线粒体功能障碍、遗传改变、T细胞稳态失衡这四个主要标志；以及TCR库的减少、幼稚细胞记忆失衡、T细胞耗竭、T细胞可塑性降低这四个次要标志。但是，在现阶段市场中还没有比较精确的免疫系统年龄测评方法。

发明内容

本发明的目的在于提供一种评估人体免疫系统年龄的检测项组合，可以精确反应免疫系统的真实年龄。

具体技术方案如下：

一种评估人体免疫系统年龄的检测项组合，所述检测项包括：

1）免疫细胞线粒体功能；

2）免疫细胞活性氧（ROS）含量；

3）T细胞表面标志物PD-1、LAG3、KLRG-1、CD57占比；

4）T细胞亚型。

在一些具体的实施方案中，所述线粒体功能为线粒体膜电位；和/或所述T细胞表面标志物PD-1、LAG3、KLRG-1、CD57占比为同时结合CD3抗体与对应标志物抗体的T细胞数量与结合CD3抗体的T细胞数量的比值；和/或所述T细胞亚型为初始T细胞（Tn）与中央记忆型T细胞（Tcm）的比值。

本发明同时提供上述检测项组合和/或其检测试剂在评估人体免疫系统年龄中的用途。

本发明同时提供上述检测项组合和/或其检测试剂在制备评估人体免疫系统年龄的试剂盒中的用途。

本发明提供的评估人体免疫系统年龄的试剂盒，包括：

1）用于检测样品中免疫细胞线粒体功能的检测试剂；

2）用于检测样品中免疫细胞活性氧（ROS）含量的检测试剂；

3）用于检测样品中T细胞表面标志物PD-1、LAG3、KLRG-1、CD57占比的检测试剂；

4）用于检测样品中T细胞亚型的检测试剂；和

5）任选的使用说明书。

其中，所述线粒体功能为线粒体膜电位；和/或所述T细胞表面标志物PD-1、LAG3、KLRG-1、CD57占比为同时结合CD3抗体与对应标志物抗体的T细胞数量与结合CD3抗体的T细胞数量的比值；和/或所述T细胞亚型为初始T细胞（Tn）与中央记忆型T细胞（Tcm）的比值。

本发明同时提供一种用于非诊断治疗目的的人体免疫系统年龄的评估方法，所述评估方法使用上述检测项组合和/或上述试剂盒。

在一些实施方案中，使用线性回归、最近邻、支持向量机、岭回归、Lasso、多层感知机、决策树、随机森林中任一方法对检测项数据建立评估模型。

在一些具体的实施方案中，使用线性回归对检测项数据建立评估模型。

在一些更具体的实施方案中，基于线性回归的评估模型公式如下：

，

其中，y为免疫系统年龄，x

在一些具体的实施方案中，所述检测数据经归一化处理，归一化公式为：

上述评估人体免疫系统年龄的检测项组合，评估人体免疫系统年龄的试剂盒，人体免疫系统年龄的评估方法均可用于筛选抗衰产品。

发明同时提供一种人体免疫系统年龄的评估系统，其包括以下模块：

1）输入模块，用于输入检测样本数据，所述检测样本数据选自如上所述的检测项组合；

2）分析模块，所述分析模块通过检测样本数据得到分析结果。

在一些实施方案中，所述评估系统具有以下特征的一种或多种：

1）所述检测样本源自血源样本；

2）所述检测样本数据为归一化处理后的数据；

3）所述分析模块采用线性回归方法构建模型，分析后得到结果。

在一些具体的实施方案中，基于线性回归方法构建的模型采用以下公式：

，

其中，y为免疫系统年龄，x

在一些更具体的实施方案中，所述检测数据经归一化处理，归一化公式为：

发明同时提供一种可读介质，所述可读介质存储了程序，所述程序被处理器执行时可实现如前所述的人体免疫系统年龄评估系统的功能。

发明还提供一种人体免疫系统年龄评估装置，包括：

1）如上所述的可读介质；

2）处理器，用于执行程序以实现所述人体免疫系统年龄评估系统的功能；

3）输出装置，用于输出评估结果。

本发明的有益效果在于：

1）筛选了一组评估人体免疫系统年龄的检测项组合，涵盖了反应免疫系统年龄的主要评估指标，样本获取简便，检测准确度高；

2）通过验证不同算法模型，建立了一套拟合度高，可以精确反应免疫系统的真实年龄的算法模型。

附图说明

图1是针对免疫细胞耗竭指标 （PD-1、LAG3占比）的流式检测细胞分群结果；

图2是针对免疫细胞功能衰退指标（KLGR-1、CD57占比）的流式检测细胞分群结果；

图3是对免疫系统可塑性指标，Tn、Tcm、Tem、Teff流式检测细胞分群结果；

图4是志愿者连续服用抗衰制剂 7天后，志愿者各检测项的数据变化；

图5是线粒体膜电位流式检测结果；

图6是志愿者连续服用抗衰制剂7天后，线粒体膜电位数据变化；

图7是ROS阳性群与阴性群分群结果；

图8是志愿者连续服用抗衰制剂7天后，ROS数据变化；

图9是生理年龄与支持向量机评估的免疫年龄；

图10是生理年龄与最近邻算法评估的免疫年龄；

图11是生理年龄和服用抗衰制剂前的基线免疫系统年龄：

图12是基线免疫系统年龄和服用抗衰制剂7天后的免疫系统年龄：

图13是基线免疫系统年龄，服用抗衰制剂7天后、30天后的免疫系统年龄。

具体实施方式

本发明从免疫系统衰老的多个维度出发，设置多个免疫细胞检测项，通过检测结果对比对免疫系统进行不同维度的打分，并通过发明人自研的算法，建立评估模型，可以精确反应免疫系统的真实年龄。

本申请提供一种评估人体免疫系统年龄的检测项组合，其包括：

1）免疫细胞线粒体功能；

2）免疫细胞活性氧（ROS）含量；

3）T细胞表面标志物PD-1、LAG3、KLRG-1、CD57占比；

4）T细胞亚型。

可检测来自人体的任何含有免疫细胞的样品中的上述检测项来评估免疫系统年龄，优选的样品是源自外周血的样品。在一些实施方式中，样品是PBMC。

所述免疫细胞包括淋巴细胞、树突状细胞、单核/巨噬细胞、粒细胞、肥大细胞等，优选为淋巴细胞。

线粒体功能例如可选自线粒体DNA含量、线粒体膜电位、线粒体呼吸链酶活性、线粒体ATP合成速率等。在一些实施方式中，线粒体功能为线粒体膜电位。线粒体膜电位可通过本领域已知的方法检测，例如荧光探针法、膜电位敏感电极法和蛋白质荧光共振能量转移法等。荧光探针可选自JC-1、TMRE、Rhodamine 123、TMRM Perchlorate、MitoTracker RedCMXRos等。

活性氧（ROS）含量可通过本领域已知的方法检测，例如荧光染色法、电子顺磁共振技术(EPR)、化学发光法、色谱法、分光光度法、电化学生物传感器和基于荧光蛋白等，优选采用DCFH-DA荧光探针法。

T细胞表面标志物PD-1、LAG3、KLRG-1、CD57占比可利用结合上述蛋白的结合分子来进行检测。一些实施方式中，所述占比为同时结合CD3抗体与对应标志物抗体的T细胞数量与结合CD3抗体的T细胞数量的比值，例如所述T细胞表面标志物PD-1占比为可同时结合CD3抗体与PD1抗体的T细胞数量，与可结合CD3抗体的T细胞数量的比值；T细胞表面标志物LAG3占比为可同时结合CD3抗体与LAG3抗体的T细胞数量，与可结合CD3抗体的T细胞数量的比值；T细胞表面标志物KLRG-1占比为可同时结合CD3抗体与KLRG-1抗体的T细胞数量，与可结合CD3抗体的T细胞数量的比值；T细胞表面标志物CD57占比为可同时结合CD3抗体与CD57抗体的T细胞数量，与可结合CD3抗体的T细胞数量的比值。常用的结合分子是与相应物质产生抗原抗体反应的结合分子，例如抗体或含抗体的偶联物。本文所述抗体包括但不限于：常规的具有两个重链和两个轻链的全抗体、单链抗体、单域抗体、或它们的抗原结合片段，例如Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv、VHH、微型抗体。抗体可以是单克隆抗体（包括全抗体，其具有免疫球蛋白Fc 区），具有多表位特异性的抗体组合物，多特异性抗体（例如，双特异性抗体），双抗体或单链分子。本领域技术人员可以理解，结合分子并不局限于抗体，任何可与相应蛋白结合并被仪器检测到的分子均可用于本发明，例如亲和体、抗体偶联物、受体的靶结合区、细胞粘附分子、配体、酶、细胞因子、和趋化因子。

T细胞亚型可以是Tn（初始T细胞）、Tscm（记忆干T细胞）、Tcm（中央记忆型T细胞）、Tem（效应记忆型T细胞）、Teff（效应T细胞）等的含量、或者是它们含量的比值。这些T细胞亚型可通过本领域公知的表面标志物来检测，例如CD45RA、CD197等。如上所述，这些表面标志物可利用结合这些蛋白的结合分子来进行检测。

获得了上述各检测项的检测数据后，可以对检测数据建立评估模型来评估免疫系统年龄。评估模型可采用本领域公知的机器学习算法，例如测试线性回归、最近邻、支持向量机、岭回归、Lasso、多层感知机、决策树、随机森林等，优选采用线性回归模型用于免疫年龄预测。在一些实施方式中，基于线性回归的评估模型公式如下：

，

其中，y为免疫系统年龄，x

各检测数据可以是多个平行样本的检测数据经归一化处理所得的数据。一些实施方式中，归一化公式为：

用于检测上述各检测项的检测试剂可制成用于评估免疫系统年龄的试剂盒，即该试剂盒包括：用于检测上述各检测项的检测试剂，和任选的使用说明书。使用说明书中可记载各检测项的检测方法以及免疫系统年龄计算方法，例如上述基于线性回归的评估模型公式。另外，所述试剂盒还可包含所用检测方法中所需的试剂，这些试剂本领域周知。

本申请还提供一种人体免疫系统年龄的评估系统，其包括以下模块：1）输入模块，用于输入上述各检测项的检测数据；2）分析模块，所述分析模块基于检测数据通过分析方法得到分析结果。分析方法可为通过上述评估模型来评估免疫系统年龄。

本申请还提供用于确定对象免疫系统年龄的介质，其可以是印刷品，如卡片、使用说明书，其上记载有本文任一实施方案所述的所述的免疫系统年龄评估方法。所述介质还可以包括存储器、处理器以及存储在存储器上并可在处理器上运行的计算机程序的装置，所述处理器执行所述程序时实现本文任一实施方案所述的免疫系统年龄评估方法。

本发明可用于筛选抗衰物质或评估抗衰物质的抗衰效果。具体地，可以评估施用抗衰物质前后的免疫系统年龄，并进行对比，根据免疫系统年龄变化来筛选抗衰物质或评估抗衰物质的抗衰效果。

下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。

除非另有定义，在本文中使用的所有技术和科学术语具有与本公开所属领域的普通技术人员通常理解相同的含义。

一、检测样本

11例志愿者，分别口服抗衰制剂Vital NAD（购自乘黄科技，有效成分为NMN，β-烟酰胺单核苷酸），服用剂量600 mg/日，连续30天。分别在服用前、服用第7天和服用第30天，采集志愿者的全血样本。

实施例1 免疫系统耗竭指标、功能衰退指标和可塑性指标的检测

1.1 实验方法：向实验流式管中各加入100μL的全血。随后加入CD3、PD-1、LAG3、KLGR-1、CD57抗体分别为2ul、2ul、2ul、2ul、和2.5ul，CD3、CD45、CD45RA、CD197抗体各5μL、2.5μL、10μL、5μL混匀，室温，避光孵育30分钟。加入500μL 光学裂解液（Beckman Coulter），混匀，室温，避光孵育10分钟，直至完全溶血至清晰透明。溶血完成后，放入离心机，300g，5分钟，离心结束后弃掉上清。加入1ml PBS，混匀，放入离心机，300g，5分钟，离心结束后弃掉上清。加入300μL PBS，混匀，重悬，CytoFLEX S流式仪（Beckman）检测上机。

1.2 检测指标：免疫系统耗竭指标-PD-1、LAG3占比；免疫系统功能衰退指标-KLRG-1、CD57占比；免疫系统可塑性指标-T细胞亚型（Tn/Tcm）。

1.3 实验结果：如图1-4所示，其中，图1是针对免疫细胞耗竭指标（PD-1、LAG3占比）的流式检测细胞分群结果；图2是针对免疫细胞功能衰退指标（KLGR-1、CD57）的流式检测细胞分群结果；图3是对免疫系统可塑性指标，Tn（初始T细胞）、Tcm（中央记忆型T细胞）、Tem（效应记忆型T细胞）、Teff（效应T细胞）的流式检测细胞分群结果。

连续服用抗衰制剂 7天后，免疫系统耗竭指标Lag-3占比升高，但PD-1占比大部分都出现降低（图4-A和图4-B）；免疫系统衰老指标KLRG-1占比和CD57占比也表现出降低的趋势（图4-C和图4-D）；免疫系统可塑性指标，即Tn/Tcm，在大多数志愿者中表现出比值上升趋势（图4-E）。

实施例2 线粒体功能检测

2.1 实验方法：①准备细胞：根据分离全血样本得到的PBMC细胞量，使用适量RPMI1640基础培养基（无血清）重悬细胞，进行计数，使最终细胞浓度为1E6个/ml；②制备探针工作液浓度：线粒体膜电位探针MitoTracker Red CMXRos (100nM)（Invitrogen） ；③探针染色：取1ml步骤①制得的细胞悬液置于管中，加入1ul步骤②制得的探针工作液，置于37℃培养箱中孵育30min；④孵育完毕后400g离心5min弃上清，用预热的DPBS再次重悬离心进行清洗；⑤离心完成后弃上清，加入200ul DPBS混匀，CytoFLEX S流式仪（Beckman）上机检测。

2.2 检测指标：免疫细胞线粒体功能-线粒体膜电位。

2.3 实验结果：线粒体膜电位流式检测结果阴阳群划分明显（图5）；11例志愿者经过连续7天服用抗衰制剂后，线粒体膜电位数据基本呈现上升现象（图6）。

实施例3 ROS（活性氧）检测

3.1 实验方法：①细胞计数：RPMI 1640无血清培养基重悬分离全血样本得到的PBMC细胞，AOPI或台盼蓝计数，分装至1.5ml离心管中，每管1E6个细胞，体积为1ml；②在管中加入1ul探针DCFH-DA（2,7-二氯荧光素二乙酸酯）（终浓度为10μmol/L），混匀，37℃培养箱孵育20min，每隔3-5min颠倒混匀一次，使探针充分与细胞接触；③用DPBS 500g, 5min，洗涤2次，以充分去除未进入细胞内的DCFH-DA，200ul DPBS重悬；④使用FITC通道检测细胞的荧光强度。

3.2 检测指标：ROS（活性氧）

3.3 实验结果：ROS阳性群与阴性群分群明显（图7），在连续7天服用抗衰制剂天后，志愿者体内细胞中ROS降低（图8）。

实施例4 免疫系统年龄评估模型的建立

基于评估人体免疫系统年龄的检测项组合：1）免疫细胞线粒体功能；2）免疫细胞活性氧（ROS）含量；3）T细胞表面标志物PD-1、LAG3、KLRG-1、CD57占比；4）T细胞亚型的数据，构建免疫系统年龄计算模型。

其中所述线粒体功能为线粒体膜电位；所述T细胞表面标志物PD-1、LAG3、KLRG-1、CD57占比为同时结合CD3抗体与对应标志物抗体的T细胞数量与结合CD3抗体的T细胞数量的比值；所述T细胞亚型为初始T细胞（Tn）与中央记忆型T细胞（Tcm）的比值。

4.1 模型选择

分别测试线性回归、最近邻、支持向量机、岭回归、Lasso、多层感知机、决策树、随机森林等14种机器学习算法在基线样本上的拟合效果，并将模型用于服用抗衰制剂前后的志愿者免疫系统年龄评估。

线性回归模型公式如下：

，

其中，y为免疫系统年龄，x

所述检测数据经归一化处理，归一化公式为：

4.2 模型验证

支持向量机的评估结果如图9所示，相关性为0.75，虽然数值较高，但只能证明预测值与生理年龄有相同变化趋势，所有样本预测值基本相同，与生理年龄存在较大偏差。

最近邻算法的评估结果如图10所示，相关性为0.44，拟合度较差。

线性回归模型的评估结果如图11-13所示。图11显示了生理年龄VS 服用抗衰制剂前的基线免疫系统年龄，免疫系统年龄在生理年龄的上下波动（其中6例高于生理年龄，4例低于生理年龄，1例持平），相关性为0.72，表明模型拟合效果较好。图12显示了基线免疫系统年龄VS 连续7天服用抗衰制剂后的免疫系统年龄，服用后所有样本免疫系统年龄有不同程度的降低。图13显示了基线数据VS 连续服用抗衰制剂 7天和30天后的免疫系统年龄，服用30天后仅少量样本（2例）免疫系统年龄进一步下降，但90%的样本的免疫系统年龄仍低于基线免疫年龄。

因此，综合考虑拟合效果及服用抗衰制剂前后的免疫系统年龄变化，最终选用线性回归模型用于免疫系统年龄的评估。