一种美法仑杂质D的纯化方法

技术领域

本发明涉及药物纯化技术领域，特别涉及一种美法仑杂质D的纯化方法。

背景技术

美法仑(Melphalan)是氮芥类化疗药物，别名:米尔法兰、L-溶肉瘤素。是苯丙氨酸氮芥的左旋体，是一种烷化剂，由于其结构的物异性，使其可进入肿瘤细胞内而发生作用，导致细胞死亡，从而起到抗肿瘤作用。与其他烷化剂相同，与DNA及RNA发生交叉联结，导致肿瘤细胞死亡，为细胞周期非特异性药物。谷胱甘肽水平提高，药物运转减慢，DNA修复增强，可导致耐药性增加。可用与治疗多种肿瘤疾病，包括多发性骨髓瘤、恶性淋巴瘤、乳腺癌、卵巢癌、慢性白血病以及甲状腺癌等。还可动脉灌注用于治疗恶性黑色素瘤、骨肉瘤及软组织肉瘤等肢体恶性肿瘤。

而药物中含有的杂质是影响药物纯度的主要因素，如药物中含有超过限量的杂质，就有可能使理化常数变动，外观性状产生变异，并影响药物的稳定性；杂质增多也必然使药物的含量偏低或活性降低，毒副作用显著增加。因此，杂质对照品的纯度对药物的质量控制起到关键性的作用。所以对于美法仑的原料和制剂的质量控制，必须有质量合格的杂质对照品。

目前，国内外研究多集中在临床应用和衍生物的合成上，对美法仑的杂质研究较少。本发明涉及的(S)-2-氨基-3-(4-((2-氯乙基)(2-羟乙基)氨基)苯基)丙酸即美法仑杂质D作为美法仑的一个重要杂质对照品之一，目前无法检索到美法仑杂质D的相关纯化方法。而常规有机合成制得的美法仑杂质D粗品可能会有较高的初始纯度，但是该粗品含有大量的无机盐混杂，该样品由于含量虚高会产生较大的校正因子偏差，同时受到盐潮解吸收水汽的影响，该样品极易降解(式1)。

如现合成的样品现制现测时检测纯度为97.8％。放置约15min后纯度下降至97.1％并观察到保留时间为4.2min的杂质峰面积增加约1％。而进一步放置3h后纯度明显下降，检测纯度值为91％，6h后纯度下降至88％，4.2min的降解产物则对应增加(如附图2)。甚至进一步延长实验时间至72小时后，溶液中的美法仑EP杂质D几乎完全分解，4.2min左右的降解杂质成为主产物。

随着美法仑杂质D放置时间的延长，主峰纯度持续降低，这极大限制了该样品的纯化和使用，同时对产品的纯化提出了较高的要求。本发明提供了一种针对美法仑杂质D的纯化的简单易行的方法。

发明内容

针对现有技术存在的问题，本发明提供一种美法仑杂质D的纯化方法。本发明提供一种美法仑杂质D的制备纯化路线，为美法仑原料药及其制剂的杂质分析及研究提供了便利，为美法仑的生产和用药安全提供检测方法及判定依据

为了实现上述目的，本发明提供一种美法仑杂质D的纯化方法，包括如下步骤：

步骤S1：配制流动相A、流动相B、稀释剂、样品液；

步骤S2：运用制备型高效液相色谱对样品液进行纯化，

条件如下：流速：10mL/min～40mL/min；柱温：10C～30℃；进样量:1～5ml；检测波长：200nm～220nm；色谱柱：十八烷基硅烷键合硅胶；

步骤S3：通过调节梯度洗脱中有机相的比例，进行梯度洗脱：

步骤S4：取样品溶液，注入制备高效液相色谱仪中，然后按照面积归一法，以样品色谱图中各色谱峰峰面积百分比进行计算。

优选的，所述步骤S3中洗脱梯度为：

在0到6min阶段，流动相A:流动相B为95:5～80:20；

在6到12min阶段，流动相A:流动相B为80:20～70:30；

在12min到18min阶段，流动相A:流动相B为70:30～60:40；

在18min到24min阶段，流动相A:流动相B为60:40～60:40；

在24min到26min阶段，流动相A:流动相B为60:40～5:95；

在26min到30min阶段，流动相A:流动相B为5:95～5:95。优选的，所述步骤S1中的流动相A选自经0.22um微孔过滤膜过滤的超纯水。

优选的，所述步骤S1中的流动相B选自色谱级乙睛。

优选的，所述步骤S1中的样品液的配制：称取美法仑杂质D，加稀释剂超声溶解至澄清溶液。

优选的，所述步骤S1中的稀释剂选自超纯水。

优选的，所述步骤S2中的流速：25ml/min；柱温：25℃；检测波长：210nm。

采用本发明的技术方案，具有以下有益效果：

在本技术发明中，梯度洗脱中有机相含量对美法仑杂质D的纯化有很大的影响。通过不同的比例组成进行梯度洗脱，可以达到美法仑杂质D与其他杂质的有效分离。最后确认梯度洗脱为在0到6min，流动相A:B为95:5～80:20；在6到12min，流动相A:B为80:20～70:30；在12min到18min，流动相A:B为70:30～60:40；在18min到24min，流动相A:B为60:40～60:40；在24min到26min，流动相A:B为60:40～5:95；在26min到30min，流动相A:B为5:95～5:95此梯度条件下进行洗脱，美法仑杂质D能分离出更多的杂质，仍能保持较好的分离度，分离度均大于1.5，符合要求。并且该梯度条件下，将单次纯化量由10mg/ml增加至100mg/ml，同样能得纯度≥95％的美法仑杂质D产品，样品峰与其他杂质分离度为1.61，符合要求，该方法操作简单，成本低。相较于目前国内外对美法仑杂质D纯化研究的空缺，本发明能为美法仑杂质D对照品的产品质量提供良好的方法。进而有效控制美法仑产品质量，为美法仑原料药及其制剂的杂质分析及研究提供便利，为美法仑的生产和要用安全提供检测方法和判断依据。

附图说明

图1为本发明单次进样100mg/ml的制备纯化液相图。

图2为现制样品初始检测与放置0min、15min、3h、6h后的色谱纯度图。

具体实施方式

以下结合附图和具体实施例，对本发明进一步说明。

实施例1：

美法仑杂质D的纯化方法：

1)色谱条件：

仪器：制备高效液相色谱仪；

色谱柱：MorphlingTMAQ-C18，250*30mm，5um；

柱温：25℃；

流速：25ml/min；

检测波长：210nm；

流动相A：经0.22um微孔过滤膜过滤的超纯水；

流动相B：色谱级乙腈；

稀释剂：超纯水；

按照下表1进行梯度洗脱：

表1：梯度洗脱程序

2)样品配制：

样品溶液的配制：称取美法仑杂质D，加稀释剂超声溶解至澄清溶液，即得，美法仑杂质D待测溶液浓度为10mg/ml。

3)检测：

取待测溶液1ml，注入制备高效液相色谱仪中，色谱图如图1所示。

4)计算：

按照面积归一法，以样品色谱图中各色谱峰峰面积百分比计。

5)实验结果：

对实施例1中的主峰前后的杂峰进行分析，结果见表2。

表2：实施例1中纯化HPLC图分析结果

结论：从表2可以看出，在该色谱条件中美法仑杂质D与其他杂质的保留时间相差不大，分离度小于1.5，在上表1梯度洗脱下纯化时，该方法对美法仑杂质D不能较好的分离。

实施例2：

美法仑杂质D的纯化方法：

具体实施参照实施例1，与实施例1不同的是，梯度含有机相比例不同：参照下表3。

表3：实施例2梯度洗脱程序

实验结果：

对实施例2色谱图中的主峰前后的杂峰进行分析，结果见表4。

表4：实施例2中纯化HPLC图分析结果

结论：从表4可以看出，在该色谱条件中美法仑杂质D与其他杂质的保留时间相差不大，但主峰分离度大于1.5，在上表3梯度洗脱下纯化时，该方法对美法仑杂质D能有效的分离。

实施例3：

美法仑杂质D的纯化方法：

具体实施参照实施例1，与实施例1不同的是，梯度含有机相比例不同：参照下表5。

表5：实施例3梯度洗脱程序

实验结果：

对实施例3色谱图中的主峰前后的杂峰进行分析，结果见表6。

表6：实施例3中纯化HPLC图分析结果

结论：从表6可以看出，在该色谱条件中美法仑杂质D与其他杂质的保留时间相差明显，相比于实施例2，主峰后的杂峰保留时间由8.35后移至9.50，主峰分离度由2.18增加至3.15，在上表5梯度洗脱下纯化时，该方法对美法仑杂质D有较好的分离。

实施例4：

美法仑杂质D的纯化方法：

具体实施参照实施例1，与实施例1不同的是，梯度含有机相比例不同：

表7：实施例4梯度洗脱程序

实验结果：

对实施例4色谱图中的主峰前后的杂峰进行分析，结果见表8。

表8：实施例3中纯化HPLC图分析结果

结论：从表8可以看出，在该色谱条件中美法仑杂质D与其他杂质的保留时间相差明显，相比于实施例3，主峰后的杂峰保留时间由9.50后移至13.55，增加10.56和12.77两个新的杂质峰，主峰分离度由3.15增加至3.44，在上表7梯度洗脱下纯化时，该方法对美法仑杂质D有较好的分离。

实施例5：

美法仑杂质D的纯化方法：

具体实施参照实施例1，与实施例1不同的是，梯度含有机相比例不同：

表9：实施例4梯度洗脱程序

实验结果：

对实施例5色谱图中的主峰前后的杂峰进行分析，结果见表10。

表10：实施例3中纯化HPLC图分析结果

结论：从表10可以看出，在该色谱条件中美法仑杂质D与其他杂质的保留时间相差明显，相比于实施例4，主峰保留时间由7.48后移至12.82，主峰前面杂质峰增加，主峰后的杂峰保留时间移至14.39，主峰分离度降低至3.09，但分离度还是大于1.5，在上表9梯度洗脱下纯化时，该方法对美法仑杂质D有较好的分离。

实施例6：

美法仑杂质D的纯化方法：

具体实施参照实施例1，与实施例1不同的是，梯度含有机相比例不同：参照下表11。

表11：实施例4梯度洗脱程序

实验结果：

对实施例6色谱图中的主峰前后的杂峰进行分析，结果见表12。

表12：实施例6中纯化HPLC图分析结果

从表12可以看出，在该色谱条件中美法仑杂质D与其他杂质的保留时间相差明显，相比于实施例5，主峰保留时间有移至13.54，主峰前后的杂质峰均增加，新增杂质峰只占比1％。但是主要的杂峰保留时间移至20.55，主峰分离度降低至2.90，但分离度还是大于1.5，在上表11梯度洗脱下纯化时，该方法对美法仑杂质D有较好的分离，符合美法仑杂质D的纯化要求。

通过实施例1～6的检测发现，梯度洗脱中有机相含量对美法仑杂质D的纯化有很大的影响。通过不同的比例组成进行梯度洗脱，可以达到美法仑杂质D与其他杂质的有效分离。最后确认梯度洗脱为在0到6min，流动相A:B为95:5～80:20；在6到12min，流动相A:B为80:20～70:30；在12min到18min，流动相A:B为70:30～60:40；在18min到24min，流动相A:B为60:40～60:40；在24min到26min，流动相A:B为60:40～5:95；在26min到30min，流动相A:B为5:95～5:95。此梯度条件下进行洗脱，美法仑杂质D能分离出更多的杂质，仍能保持较好的分离度，分离度均大于1.5，符合要求。并且该梯度条件下，将单次纯化量由10mg/ml增加至100mg/ml，同样能得纯度≥95％的美法仑杂质D产品，样品峰与其他杂质分离度为1.61，符合要求，而且纯化后得到的白色粉末状的美法仑杂质D。该粉末状固体在常温环境(湿度<50％)环境中可以稳定称量而未见明显潮解，同时该粉末样品在密封、避光、-20℃冷冻保存条件下5天后检测未见明显分解。该方法操作简单，成本低。为美法仑、盐酸美法仑原料和制剂的质量控制，提供了很大的便利。

以上所述仅为本发明的优选实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是在本发明的发明构思下，利用本发明说明书及附图内容所作的等效结构变换，或直接/间接运用在其他相关的技术领域均包括在本发明的专利保护范围内。