一种肿瘤高亲和力新抗原的筛选方法及其在指示肝癌患者PD-1治疗预后疗效中的应用

技术领域

本发明涉及生物医学技术领域，具体涉及一种肿瘤高亲和力新抗原的筛选方法及其在指示肝癌患者PD-1治疗预后疗效中的应用。

背景技术

肿瘤新生抗原(neoantigen)是由肿瘤细胞发生体细胞突变(somatic mutation)或者框架移位突变(frameshift mutation)形成，这类新抗原只特异存在于肿瘤细胞中，能被抗原递呈细胞捕获进而被效应T细胞识别，激发机体的抗肿瘤免疫效应。然而实际上，在肿瘤产生的上千种新抗原中，真正能激活抗肿瘤免疫效应的新抗原的概率不到百分之二十，因此，需要对肿瘤新抗原进行更深入分类分析，在此基础上寻找新抗原与HCC患者预后之间的关系。

现有的指导临床上PD-1用药的依据主要根据肿瘤组织中PD-L1的表达水平来评估PD-1治疗的效果，PD-L1表达水平高的患者更受益于PD-1治疗。但近年来，研究者们发现对高肿瘤突变负荷（TMB）10 Mut/mB且PD-L1表达水平低（小于1％）的患者进行PD-1治疗，依然能引起强烈的抗肿瘤免疫反应，因此，TMB的检测也是指导PD-1用药的重要依据。但在目前在HCC的研究中，TMB并不是理想的预后指标。因为HCC患者的TMB值普遍偏高，无法准确提示患者肿瘤中免疫状态，并且临床研究发现TMB值与患者预后无显著相关性。而肿瘤新抗原能够被肿瘤反应性T细胞识别从而激活抗肿瘤免疫应答，因此针对其数值的预测更能反应肿瘤微环境中的免疫状态，成为评估免疫治疗效果的重要指标。

发明内容

本发明提供一种肿瘤高亲和力新抗原的筛选方法及其在指示肝癌患者PD-1治疗预后疗效中的应用，本发明通过全外显子测序的结果，并采用pVAC工具和MHC-I算法计算出MHC-I高亲和力新抗原的数量，并用中位数值(16)将其分成HAN-high组和HAN-low组，其中HAN-high组病比low组病人的无进展生存期更长，更受益于PD-1的治疗，高亲和力新抗原的数量可作为预测HCC患者生存和指导PD-1用药的新指标。

本发明解决其技术问题采用以下技术方案：

一种肿瘤高亲和力新抗原的筛选方法，包含以下步骤：

（1）取肿瘤患者的肿瘤组织，进行肿瘤组织WES和RNA-seq测序；

（2）使用多种软件检测综合检测肿瘤患者的体细胞突变，保留等位基因突变频率≥5%的reads，得到VCF文件；

（3）将VCF文件用pVACseq软件进行MHC-I分子类型鉴定，肿瘤患者分型为：HLA-A等位基因、HLA-B等位基因、HLA-C等位基因；

（4）基于HLA等位基因，使用pVACtools软件，通过多种预测算法预测与等位基因结合的多肽，将不同算法得到的结果中值作为MHC-I结合亲和力水平，将MHC-I结合亲和力水平计为IC50，将预测的亲和力水平IC50小于50nM的作为高亲和力新抗原。

作为一种优选方案，所述步骤（2）采用Mutect、Varscan、CNVnator软件检测综合检测肿瘤患者的体细胞突变。

作为一种优选方案，所述Mutect软件用于检测体细胞单核苷酸变异，所述Varscan软件用于检测Indel变异，所述CNVnator软件用于检测拷贝数变异。

作为一种优选方案，所述基于HLA等位基因，使用的为pVACtools软件的pVACseq模块。

作为一种优选方案，所述预测算法分别为NetMHCpan、NetMHC、NetMHCcons、PickPocket、SMM、SMMPMBEC、MHCflurry和MHCnuggets。

作为一种优选方案，所述肿瘤组织WES和RNA-seq测序通过illumina高通量测序平台完成。

作为一种优选方案，所述高亲和力新抗原数量与HCC患者五年生存期呈正相关。

本发明还提供了一种所述的肿瘤高亲和力新抗原的筛选方法在指示肝癌患者PD-1治疗预后疗效中的应用。

作为一种优选方案，总结肿瘤患者的高亲和力新抗原的数量，以16为临界值，将肿瘤患者分为HAN-high组、HAN-low组，所述HAN-high组高亲和力新抗原数量大于等于16，所述HAN-low组高亲和力新抗原数量小于16。

作为一种优选方案，所述HAN-high组更受益于PD-1的治疗，所述高亲和力新抗原数量可作为预测HCC患者生存和指导PD-1用药的新指标。

本发明的有益效果：（1）本发明通过全外显子测序的结果，并采用pVAC工具和MHC-I算法计算出MHC-I高亲和力新抗原的数量，并用中位数值(16)将其分成HAN-high组和HAN-low组，其中HAN-high组病比low组病人的无进展生存期更长，更受益于PD-1的治疗，高亲和力新抗原的数量可作为预测HCC患者生存和指导PD-1用药的新指标；（2）本发明证实了高亲和力新抗原数量与HCC患者5年生存期（OS）呈正相关关系，而TMB和neoantigen的数值与OS不相关，高亲和力新抗原数量更能反应肿瘤微环境中的免疫状态。

附图说明

图1为TMB与HCC患者5年生存期（OS）关系图；

图2为新抗原与HCC患者5年生存期（OS）关系图；

图3为高亲和力新抗原与HCC患者5年生存期（OS）关系图；

图4为抗pd -1治疗后疗效评价图；

图5为HAN-high组与HAN-low组无进展生存期关系图；

图6为经过PD-1治疗后，HAN-high组肿瘤体积变化图；

图7为经过PD-1治疗后，HAN-low组肿瘤体积变化图。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1

一种肿瘤高亲和力新抗原的筛选方法，包含以下步骤：

（1）取肿瘤患者的肿瘤组织，通过illumina高通量测序平台进行肿瘤组织WES和RNA-seq测序；

（2）使用多种软件检测综合检测肿瘤患者的体细胞突变，保留等位基因突变频率≥5%的reads，得到VCF文件；

（3）将VCF文件用pVACseq软件进行MHC-I分子类型鉴定，肿瘤患者分型为：HLA-A等位基因、HLA-B等位基因、HLA-C等位基因；

（4）基于HLA等位基因，使用pVACtools软件，通过多种预测算法预测与等位基因结合的多肽，将不同算法得到的结果中值作为MHC-I结合亲和力水平，将MHC-I结合亲和力水平计为IC50，将预测的亲和力水平IC50小于50nM的作为高亲和力新抗原。

在本实施例中，所述步骤（2）采用Mutect、Varscan、CNVnator软件检测综合检测肿瘤患者的体细胞突变。

在本实施例中，所述Mutect软件用于检测体细胞单核苷酸变异，所述Varscan软件用于检测Indel变异，所述CNVnator软件用于检测拷贝数变异。

在本实施例中，所述基于HLA等位基因，使用的为pVACtools软件的pVACseq模块。

在本实施例中，所述预测算法分别为NetMHCpan、NetMHC、NetMHCcons、PickPocket、SMM、SMMPMBEC、MHCflurry和MHCnuggets。

在本实施例中，所述肿瘤组织WES和RNA-seq测序通过illumina高通量测序平台完成。

在本实施例中，所述高亲和力新抗原数量与HCC患者五年生存期呈正相关。

实施例2

所述的肿瘤高亲和力新抗原的筛选方法在指示肝癌患者PD-1治疗预后疗效中的应用。

总结肿瘤患者的高亲和力新抗原的数量，以16为临界值，将肿瘤患者分为HAN-high组、HAN-low组，所述HAN-high组高亲和力新抗原数量大于等于16，所述HAN-low组高亲和力新抗原数量小于16。

所述HAN-high组更受益于PD-1的治疗，所述高亲和力新抗原数量可作为预测HCC患者生存和指导PD-1用药的新指标。

实施例3

选取56名HCC患者，分别测试其TMB、新抗原、高亲和力新抗原，其中高亲和力新抗原方案为实施例1所述的方案，新抗原为采取实施例1所述的方案测试得到的，但是新抗原将预测的亲和力水平IC50小于500nM；其中TMB大于等于164为TMB-high，小于164为TMB-low，新抗原大于等于64为neoantigen-high，新抗原小于64为neoantigen-low，统计TMB/新抗原/高亲和力新抗原与总生存率的相关性，测试结果见图1、图2、图3，生存曲线采用log-rank检验(P<0.05被认为是显著的)，虚线表示95%置信区间。从图中可看出，高亲和力新抗原的数量与HCC患者5年生存期（OS）呈正相关。

实施例4

HAN-high组、HAN-low组分别选取8人，经过抗pd -1治疗后，其疗效评价见图4，克雷格：完整的响应；公关：局部反应；SD：稳定的疾病；PD：疾病进展；ORR：客观有效率；DCR：疾病控制率。可见，经过抗pd -1治疗后，HAN-high组的疗效比HAN-low组更好。

HAN-high组与HAN-low组无进展生存期见图5，PFS曲线采用对数秩检验(P=0.048)进行分析。虚线表示95%置信区间，可见HAN-high组无进展生存期更长。

其中经过抗pd -1治疗，基线肿瘤大小测试见图6、图7，进一步验证，HAN-high组更受益于pd -1治疗。

可见，本发明根据高亲和力新抗原数量将患者划分为HAN-high组与HAN-low组，其中HAN-high组更受益于PD-1的治疗，治疗效果好，且高亲和力新抗原的数量与HCC患者5年生存期（OS）呈正相关，同时高亲和力新抗原的数量也能反应肿瘤微环境中的免疫状态。

为了进一步证明本发明的效果，提供了以下测试方法：

以上述依据本发明的理想实施例为启示，通过上述的说明内容，相关工作人员完全可以在不偏离本发明技术思想的范围内，进行多样的变更以及修改。本发明的技术性范围并不局限于说明书上的内容，必须要根据权利要求范围来确定其技术性范围。