水稻越冬再生主效QTL-qOW6的分子标记方法与应用

文献发布时间：2023-06-19 10:54:12

技术领域

本发明涉及一种控制越冬再生QTL-qOW6的分子标记方法，属于水稻有益抗逆优异基因资源挖掘和分子遗传育种学领域。

背景技术

水稻是世界上最重要的第一大粮食作物，不仅是全球约半数人口的主食，也是单子叶植物基因组学研究的模式生物。特别在保障我国可持续的粮食供给中发挥着重要作用。众所周知，不断挖掘与创新利用优异水稻资源是超高产水稻新品种培育的重要环节,更是丰富和创新水稻遗传基础理论研究的源动力。每个优质高产新品种的成功培育和每篇世界顶级杂志刊发与水稻相关论文都离不开水稻优异种质资源的创新利用。低温冷害是制约水稻生长、发育和分布的重要非生物胁迫因子之一，在我国常年低温冷害导致粮食减产3～5亿吨。越冬再生稻是指在正季收获稻谷续留稻桩，稻桩在田间自然环境下度过寒冷冬季并在第2年春季能萌芽、正常开花、受精、结实及连续多年收获稻谷的一类特殊抗寒耐冷的水稻种质资源，该种质资源极有可能携带越冬再生基因。在水稻生产上，水稻的越冬再生现象是水稻全生育期抗寒耐低温的极端例子，鉴定影响水稻越冬再生(多年生)性状的相关基因，为进一步揭示水稻抗寒耐低温特别是水稻越冬再生(多年生)的分子机制奠定理论基础，也是揭示多年生(越冬再生)水稻与一年生水稻遗传差异研究的模式材料，最终为水稻抗寒性乃至越冬再生(多年生)稻新品种遗传改良提供抗寒耐低温基因资源奠定基础。在农业生产上实现1年栽种1次水稻从而连续多年收获稻谷的构想具有重要理论与实践意义，必将助力国家水稻产业发展、助农降本增收。

分子遗传学研究表明，水稻越冬再生(多年生)属于多基因控制的数量遗传性状。随着基因定位克隆技术的广泛应用，从抗寒水稻种质资源中定位克隆控制抗寒耐低温性状相关基因成为逆境生物学研究的新时尚，水稻越冬再生QTL分子标记就这样被提出。利用SSR，InDel，Caps，基因测序等标记技术及不同变异来源的水稻抗寒种质资源，综合运用经典遗传学、分子生物学、基因工程学及育种学等多学科交叉的基础理论技术体系鉴定出了大量水稻抗寒突变基因。目前，控制水稻抗寒耐低温相关基因的研究报道大多选用水稻某个特定时期(苗期、孕穗期)耐低温表型来筛选鉴定目标基因，但运用水稻某个特定时期耐寒表型筛选鉴定抗寒基因能否解释水稻全生育期耐寒性，特别是解释水稻越冬再生(多年生)的分子机理仍有待商榷。迄今为止，有关水稻越冬再生(多年生)相关控制基因挖掘的研究报道较少。

发明内容

本发明所要解决的技术问题为：如何提供一个全新的影响水稻越冬再生(多年生)主效QTL-qOW6的新基因座，由此提供水稻越冬再生主效QTL的分子标记方法与应用。

为解决上述问题，本发明提供水稻越冬再生主效QTL-qOW6的分子标记方法，其特殊之处是培育具有越冬再生特性的水稻，对该水稻主效QTL-qOW6初步定位，在此基础上扩大定位群体，设计在所述初步定位区间内若干个SSR和InDel分子标记，通过构建所述群体的连锁图，确定所述主效QTL-qOW6的连锁分子标记，其位于水稻第6染色体长臂的YS5和D203，二者间物理距离为42.075kb。

进一步，所述初步定位相应标记为RM20069和RM3489，其物理位置分别为16542271bp和20982059bp。

进一步，所述培育具有越冬再生特性的水稻，以东乡野生稻(DXWR)为基因供体。

再进一步，所述扩大定位群体是采用对F

本发明也提供PCR引物用于获得所述主效QTL-qOW6的连锁分子标记YS5和D203，其特殊之处是所述引物:

YS5的为SEQ ID NO：1、2，

D203的为SEQ ID NO：3、4。

本发明还提供水稻越冬再生主效QTL-qOW6的分子标记的应用，其特珠之处是用所述分子标记鉴定水稻越冬再生特性，所述分子标记为YS5和D203，提取水稻DNA，PCR扩增；

若标记YS5扩增出196bp片段，认定该水稻基因型为qOW6，其表型是越冬再生的；若扩增出213bp片段，认定该水稻基因型为qow6，其表型是枯萎死亡；若扩增出杂合带型，认定该水稻基因型为qOW6qow6，其表型是枯萎死亡；

若标记D203扩增出236bp片段，认定该水稻基因型为qOW6，其表型是越冬再生的；若扩增出215bp片段，认定该水稻基因型为qow6，其表型是枯萎死亡；若扩增出杂合带型，认定该水稻基因型为qOW6qow6，其表型是枯萎死亡。

进一步，所述的应用在于用于分子标记辅助选择育种。

本发明水稻越冬再生主效QTL-qOW6的分子标记方法是从“DXWR/93-11”F2群体中筛选得到2个连锁交换单株(F

本发明的水稻越冬再生主效QTL-qOW6位于水稻第6染色体长臂上的一个与水稻越冬再生表型相关基因位点，该基因位点能控制水稻越冬再生性状表型。

本发明以具有越冬再生特性东乡野生稻材料为基因供体，该水稻材料能度过零下8.0℃的寒冬季节并能在来年春季萌芽再生，正常开花、结实，继续收获稻谷，在自然冷冬田间环境下表现出强劲的越冬再生特性。

本申请以多年生东乡野生稻(简称DXWR，东乡野生稻种子由江西农业科学院水稻研究所邹国兴研究员、陈明亮副研究员、王会民博士共同提供，部分东乡野生稻叶片由中科院亚热带农业生态所陈彩艳研究员和国家种质广州野生稻圃共同提供)为基因供体，构建“DXWR/93-11”杂交组合获得F

与现有水稻抗寒耐低温性状的突变基因相比，本发明具有以下特点：

1、QTL-qOW6是基于东乡野生稻越冬再生性状在自然冷冬田间环境下可遗传分离特性为研究前提，该性状具有可“复制、粘贴”的特性。在水稻育种生产上，选用东乡野生稻资源作为基因供体，与普通栽培稻资源杂交，可将东乡野生稻携带的越冬再生基因导入现有栽培稻骨干亲本中改良其抗寒(耐低温)特性，特别是越冬再生特性。本发明运用基因图位克隆的技术体系，检测到一个全新的QTL。该QTL与水稻越冬再生田间表型密切相关。

2、QTL-qOW6定位在第6染色体长臂上，与现已报道水稻抗寒耐低温突变基因不存在染色体共线性重叠，为一个全新的QTL，且现有水稻抗寒耐低温突变基因主要选用水稻某个特定时期(苗期、孕穗期)耐低温表型来筛选鉴定目标基因，但运用水稻某个特定时期耐寒表型数据筛选鉴定的抗寒基因能否解释水稻全生育期耐寒性有待商榷。目前，对水稻全生育期抗寒耐低温特性特别越冬再生(多年生)特性缺乏广泛认识。本发明的全新QTL-qOW6可为水稻越冬再生的遗传机理解析奠定理论基础，同时为越冬再生(多年生)水稻新品培育提供基因资源。

附图说明

图1、为“DXWR/93-11”F

图2、为2套F

图3、为2套F

图4、为qOW6紧密连锁标记YS5引物扩增产物电泳图谱，从左向右依次为Marker、母本DXWR、父本93-11带型，第1、2、3…………20、21、22泳道为部分F

图5、为qOW6紧密连锁标记D203引物扩增产物电泳图谱，从左向右依次为母本DXWR、Marker、父本93-11带型，第1、2、3………20、21、22泳道为部分F

图6、为qOW6精细定位图谱，a.F

具体实施方式

下面结合具体实施实例，进一步阐述本发明。其中所用方法如无特别说明均为常规方法。

实施例1与水稻越冬再生主效QTL-qOW6紧密连锁的分子标记的获得

(一)定位群体与实验方法

1、定位群体

梁永书等将东乡野生稻越冬再生主效QTL-qOW6初步定位在分子标记RM20069和RM3498之间。在此基础上，进一步扩大定位群体，采用对2个F

本发明利用2套F

本发明利用所述2套F

2、分子标记开发(在初步定位的目标区间设计新的SSR和InDel标记)

根据Gramene(www.gramene.org)中公布的国际水稻基因测序粳稻日本晴全基因组序列和东乡野生稻第6染色体全基因序列(江西师范大学张帆涛教授馈赠)，分别用SSRHunter3.0软件搜寻日本晴和东乡野生稻第6号染色体目标区间SSR位点，使用BLAST(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov)分别搜寻“日本晴和93-11”和“东乡野生稻和93-11”目标基因区间基因组同源序列，用Lasergene7.0版本MegAlign功能筛选预设InDel#标记的Gap序列。利用Primer-BLAST(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast)设计SSR和InDel分子标记(引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成)，并进行多态性筛选，PCR反应体系和反应程序同上述的PCR扩增体系，在RM20069和RM3498目标区间获得15对多态性标记(表1-1、表1-2)，用于越冬再生QTL-qOW6基因的精细定位。

表1-1水稻越冬再生QTL-qOW6紧密连锁分析标记信息-1

表1-2水稻越冬再生QTL-qOW6紧密连锁分析标记信息-2

物理位置：参考日本晴基因组序列

3、实验方法

3.1 DNA的SDS提取

DNA提取采用SDS法(微量提取法)，对分别对2套F

1)取3g左右叶片加入研钵，在液氮中磨成粉末状转移至2mL平底离心管中1/4。

2)加入65℃预热的SDS提取液800μl，混匀后于65℃水浴锅中保温25分钟，期间上下颠倒3次。

3)从水浴中取出离心管，加入200μl 5mMKAC溶液混匀，冰浴20分钟。

4)每管加入24:1的氯仿/异戊醇500μl，上下颠倒数次至下层液相呈深绿色12000rpm离心10分钟。

5)取上清液置另1个2mL平底离心管中，加入1.5倍上清液体积的冰冻乙醇缓慢混匀，室温静置15分钟，12000rpm离心5分钟。

6)吸取上清液，用70％乙醇洗涤2次，随后用无水酒精干燥，放通风橱自然风干。

7)加入500μl ddH

3.2 PCR扩增

选取目标区间RM20069(16542271bp)和RM3498(20982059bp)开发的SSR和InDel引物分别对2套F

PCR反应体系总体积20μl，各成分如表2所示

表2 20μl PCR反应体系各成分

3.3 PCR反应程序如下：

1)94℃预变性4min

2)94℃变性30s

3)56℃退火30s

4)72℃延伸1min

步骤2-4共35个循环，最后72℃延伸8min。

3.4 PCR产物PAGE凝胶电泳

PCR扩增产物用8％聚丙烯酰胺凝胶(PAGE)进行电泳分离(表3)，电泳仪和电泳槽选用北京六一生物科技DYY-7C型转印电泳仪和北京六一DYCZ-30C双板夹芯式垂直电泳槽，电泳时间根据PCR产物片段大小确定时间长短，电泳完成后银染、显色、拍照并进行数据记载，如图4和图5为标记YS5和D203引物对F

表3 100mL 8％聚丙烯酰胺凝胶(PAGE)工作液各成分

(二)水稻越冬再生主效QTL-qOW6紧密连锁标记的获得

定位结果如图6所示，借助目标区间开发的SSR和InDel

表4水稻越冬再生QTL-OW6紧密连锁分子标记信息

物理位置(bp)：参考日本晴基因组序列。

(三)水稻越冬再生主效QTL-qOW6分子标记的应用拓展

本发明涉及东乡野生稻越冬再生性状在田间自然冷冬环境下具有可遗传分离特性，该性状具有可“复制、粘贴”的特性，东乡野生稻资源作为基因供体，与普通栽培稻资源杂交，可将东乡野生稻携带的越冬再生基因导入到现有栽培稻骨干亲本中改良其抗寒甚至越冬再生特性。本发明采用现代分子生物技术手段精细定位了越冬再生主效QTL-qOW6在第6染色体长臂上YS5-D203标记区间，两标记之间物理距离为42.075kb。

实施例2(利用紧密连锁分子标记YS5和D203鉴定水稻越冬再生材料)

具体步骤如下：

(1)DNA的提取：取水稻幼嫩叶片，SDS法提取全基因组DNA；

(2)标准PCR扩增体系的建立：以YS5和D203中的任意一对或两对标记引物，对待测水稻单株全基因组DNA为模板，进行PCR扩增；

(3)扩增DNA片段检测分析：PCR产物经过8％的聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，如果标记YS5能扩增出196bp片段，说明该单株基因型为qOW6，其表型是越冬再生的；如果能扩增出213bp片段，说明该单株基因型为qow6，其表型是枯萎死亡；如果能扩增出杂合带型，说明该单株基因型为qOW6qow6，其表型是枯萎死亡。用D203扩增出236bp片段，说明该单株基因型为越冬再生的，如果能扩增出215bp片段，说明该单株基因型为qow6，其表型是枯萎死亡；如果能扩增出杂合带型，说明该单株基因型为qOW6qow6，说明该单株基因型为qOW6qow6，其表型枯萎死亡。

上述分子标记及方法，主要在于水稻越冬再生的分子标记辅助改良、分子标记辅助的育种和种质资源的利用。通过检测与越冬再生主效基因位点连锁的分子标记，可以确定有无控制越冬再生的主效基因位点导入到育种材料中，提高了水稻越冬再生特性改良的目标性与有效性，提高了抗寒耐低温品种的选择效率、加快了育种进度。

以上所述，仅是本发明的最佳实例而已，并非对本发明作任何形式上的限制，本领域技术人员利用上述揭示的技术内容做出些简单修改、等同变化或修饰，均属于本发明的保护范围内。

序列表

<110> 重庆师范大学

<120> 水稻越冬再生主效QTL-qOW6的分子标记方法与应用

<130> 2

<160> 34

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 20

<212> DNA