一种提高植物中花青素含量的基因BnaPAP2.c6.a及其应用

技术领域

本发明属于植物基因工程领域，特别是涉及一种提高植物中花青素含量的基因BnaPAP2.c6.a及其应用。

背景技术

花青素是自然界一类广泛存在于植物中的水溶性天然色素，属于黄酮类的次生代谢物。花青素具有较强的抗氧化特性，其在植物抵抗生物和非生物逆境以及人类延缓衰老、癌症治疗等健康领域中具有重要作用。

甘蓝型油菜(Brassica napus L.，2n＝38)中富含花青素的种质资源缺乏，有关花青素合成基因的研究较为匮乏。

发明内容

为了解决上述问题，本发明提供了一种提高植物中花青素含量的基因BnaPAP2.c6.a及其应用。上调表达本发明提供的基因BnaPAP2.c6.a能够有效提高甘蓝型油菜中花青素的合成，探究了甘蓝型油菜中花青素合成的关系。

为了实现上述目的，本发明提供了如下技术方案：

本发明提供了一种提高植物中花青素含量的基因BnaPAP2.c6.a，所述基因BnaPAP2.c6.a的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。

本发明还提供了上述基因BnaPAP2.c6.a的扩增引物，所述扩增引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3所示。

本发明提供了上述基因BnaPAP2.c6.a的表达在提高植物中花青素含量中的应用。

本发明提供了上述基因BnaPAP2.c6.a的表达在提高甘蓝型油菜中花青素含量中的应用。

本发明提供了上述基因BnaPAP2.c6.a的表达在提高甘蓝型油菜的茎秆中花青素含量中的应用。

本发明提供了上述的基因BnaPAP2.c6.a的表达在提高甘蓝型油菜的角果皮中花青素含量中的应用。

本发明提供了上述基因BnaPAP2.c6.a在植物育种中的应用。

本发明提供了一种提高植物中花青素含量的基因BnaPAP2.c6.a，所述基因BnaPAP2.c6.a的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。由实施例数据可知，上调表达本发明提供的基因BnaPAP2.c6.a能够有效提高甘蓝型油菜的的茎秆和角果皮中花青素的合成。

附图说明

图1为PR、ZS11及杂种F

图2为BSA分析SNP分布图；

图3为紫秆性状精细定位；其中，RN为重组单株数量；Phen为表型；G为绿色；P为紫色；

图4为PR重测序数据部分同源交换分析；

图5为ZS11和PR茎秆9个AtPAP2同源基因表达量和qRT-PCR分析；其中，A为ZS11和PR茎秆9个AtPAP2同源基因表达量分析；B为BnaPAP2.C6.a特异引物qRT-PCR分析；

图6为甘蓝型油菜AtPAP2同源基因不同拷贝在PR不同组织表达模式分析。

具体实施方式

本发明提供了一种提高植物中花青素含量的基因BnaPAP2.c6.a，所述基因BnaPAP2.c6.a的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。所述SEQ ID NO:1为：

TGATCCATTCCTTGAAGCCATCAGGATCCAAAACCAGTTCAGAGGACTCCCCGAAGGAACTGTAATAATGAAGATACAGACAAGCAGGCAGAACTGTCTATCAGAAGAGAGCAAGATTGTGTGGAACAATGGAAAGATTGTCCAGAATATGTTCCTTAAGCTCCAGAACGTTGAGTGTGGAGAGGTCGAGCTTCAACTTGAGTGGATCGATGTCTCAGGTCTTCTGAGTATAAATGAGCATGAGGATGTTGCTTACTAGATCTATTATCTTATTACATCAAGTTTGTTAGAAAATATACTAGTTATGAAGCTGGCGTGGGGGAGTTATGGGCTTTAAACCAAAACTCCCCCAATTGTTTTTTTATAAATTGAAAAGAAAAAACTCTTCTCTGGTTTTGTGTTCTTACTCTAACAAGAAAAACATAACACACTTTGTTGTAGAGAGAGGAAACAAGGAATGAGATGAAATCAAGTAGATAGCATAAGATGAGATGGAGAAACTGATTTTTTTCTCTCATTTTACACAACATCTTCTACTACATATTCATATAAGAAAATCAGAGTAATGAACTCTGTTTTCTCTACCCTTACACATGTTATAAAGCCCCATAAAGCTACCACTCTAGACACCACATTTTAGCAAAAGAAACAAGCAACTTCAAGAACTTGAACAATTCAAAATAAACAGTTAACTTCAACAACTTCCTTGACTTGTTGTACTTTGTTTTCTTTCATTATTCTCACTTGTTTTGTTGATACCATTGTGCAGGATTAACAGAGATGAGATTTCAGCATACTTGTTATGATAAATGTAAAAAAGCTACTGAATCAACGATATGGTTTTTATGTGTTTCTGACCTTTGTTTTTGTTTTCAACACTTTAATTGCATCTTATTGAAAGAGAGACTTGCTCGGGTCCTGTTTAGTAATGACAAATGGTGATCATCAAATGTGAAAAGATCAAGAATCGATATGCTTGCATCTAAGTTTGAAAATCCGCAGATGGATGAGAATTAATCATTTGAGGAACTCAGTGGAAAACTGAGTGCAACAGCAAATATGAAGCACAAACAATGGGAAAGACATACAAAGACAAAAAGCTTGGAAGAAACTTCTCAGATGTTTACCCTCAAAGTTAAATCCAAGAAGACAGCTATGGACACTGCACTAGACACTGACACAATGGATTTTGGTGAAGTCACGGGTCACTTACAAGCATATGAGATGAATGAGAAACTCAAGGAAGAACTGTCTAAAAAAATCTGAAACTAGAAAGCAGATTCACATGCTGAATAGTGGAACCAAGAATCTGGAGAAGATTCTCTCTGTTAGAAGGGTAGGCAAGTCCAACTTTGTGTCTCGGTTACAGTGGAAAACTACAGAAAAACAGAGTTTGTTCCGGCTAAGACTTGAGAGATTGCGTCTGATACTACAGGAAGTAGGATATCAACCAAGATCATCTATTGTGAAACTGAAACCAGTAAGAACTATAATGTAGGCTACTTCTGTGGTAAATACATGCACATACCAAGAGATACTTACAAATTTCAAAAAAGAATCACTCCAGAGTTGACTTTGCTTTCCAATCTTTACAGGTTTAACGTTAAATATGAAATTTGTAGTCAAACGATTATGATGGATTTCATCAAATCTTATTGTTTTAATATCAAATGAGGTTCAAGTTACATATTTCTGAACTCCCTAGCCAAAAGTACATACTCACAATGTGAGACACTTTAAATACGGAACAATTTGCAAAATAGTGATTTGTGTACTCATAATTATTGTAGCTGATTTTTGTCTACATACATTTGTTGACAGAAAAACAATACGCTACTTATCAAGTTGTGTACTCATACATCAACCCTCTGTCTCTCTGTCTCCCTGTCCCTGTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTATTCTGTTTTTAACTCTGGTGCATGAAGCTGTTCTCTCTTTTAATCATATAAACCACCTTTCCACCAATCATTAATCGTCCTTTCTGCTAACTTTGCTAAGAGGCATGTTTTTCCTTTAAAGTACTGAAAAATATGAAGAGACTAAGTGATATGCTATGCTATGACGAAAATGGACTAAGTGCTATGAACCTTTTCTGTATTTAGTTTGAATCAGTAGCAGAACATAAATAACTAAATTAGCAAATTAGACACGACAAAATGTGCTATGAACCTTTTTTGTTTCTGCATCGTACCCTGGAAGTTGTTAAAAAAAAAAGACACGACAAAAATGTGGATGTTAGACATGCACGTCACTTCTCTTTGCCCGTCACGTGTATAAATAAAGTCCTCGAAGGATTTGTCAAGCCACAATAGAAACCCTTTTCCTCAAGCCTGCCTTTACGTATAACTTTTTAAAATAAAATTTGGTTAGATACTTCTAAAATTATCGCTGGTCCATGGAGGGTATGTCCAAAGGGTTGAAAAAAGGTGCATGGACTGCTGAAGAAGATAATCTCTTGAGGCAATGCATTGATAAGTATGGAGAAGGGAAATGGCACCAAGTTCCTTTAAGAGCTGGTATGTCTTTTTTTTTTTGATAAAATAAGAGCTGGTATGCTACTTTTATTAATTTTCACACACACACACATATATATATATACATATAACTAATAAGTACGTATACTCTTTTTATTTTTCAGTACATTTATTTTCTTTCTCTCTGTCTACTATTAGGAAATTAATTAACACCGGGGTACACAATCATTGTTTTTTTTTTTTGTAACTGAGGCTTACAATCACAATCATTGTTTTTCTTTTCGTTTTAATGAAGGAATCATAGATTCAAATGTTTGTTTTTCATGAGAAAAAAAAAATATTTGCGTTCTTCATGTTTAAGTATAAAGCGAGAAGGCAATTCTCTTTATTGATTCGTAGTTTTTTTTTGAGAAATAGCTTTTTTTATTTGTTGAATTTTCTGCACGAACCAGTATGTTTGTGTGGAATATGTTGTTTATACTGGTGTACTTTGATTCTTCTTTTAATAATATTAAATGTCAATTGGTTTTGTAGGTCTAAATCGGTGCAGGAAGAGTTGTAGACTAAGATGGTTGAACTATTTGAAGCCAAGTATCAAGAGAGGAAAACTCAACTCTGATGAAGTTGATCTTCTTATTCGCCTTCATAAGCTTTTAGGAAACAGGTTTACATTCAAGACACAAATTCAACTTTATTTCGTATCCTCATTCGGTCTAATCTAATCATTTGATTTGTTTTTTTTTTTGATAAAAAGTACTTTTCATATGTAATGATCCATTACTAAGTCATATATATCCCTAATTTTTCAAATGCATGCTTAGGTGGTCTTTAATTGCTGGTAGATTACCCGGTCGGACCGCCAATGACGTCAAAAATTACTGGAACACCCATTTGAGTAAGAAACATGAACCAGGTTGTAAGACCCAGATGAAAAAGAGAAACATTCCTTGCTCTTATACCACACCAGCCCAAAAAATCGACGTTTTCAAACCTCGACCTCGATCCTTCACCGTTAACAACGGCTGCAGCCATATTAATGGCATGCCAGAAGCTGACATTGTTCCTCTATGCCTTGGACTCAACGACACTAATAATGTTTCTGAAAATATAATCACATGTAACAAAGATGATGATAAATTTGAGCTTGTTAGTAATTTAATGGATGGTCAGAATAGGTGGTGGGAAAGTTTGCTAGATGAGAGCCAAGATCCAGCTGCGCTCTTTCCAGAAGCTACAGCAACAAAAAAAGGCGCAACCTCCGCGTTTGACGTTGAGCAACTTTGGAGCCTGTTGGATGGAGAAACTGGAACTTGA。上调表达本发明提供的基因BnaPAP2.c6.a能够有效提高花青素的合成。

本发明还提供了上述基因BnaPAP2.c6.a的扩增引物，所述扩增引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3所示。本发明提供的扩增引物能够应用于提高花青素合成中。

本发明提供了上述基因BnaPAP2.c6.a的表达在提高植物中花青素含量中的应用。

本发明提供了上述基因BnaPAP2.c6.a的表达在提高甘蓝型油菜中花青素含量中的应用。

本发明提供了上述基因BnaPAP2.c6.a的表达在提高甘蓝型油菜的茎秆中花青素含量中的应用。

本发明提供了上述的基因BnaPAP2.c6.a的表达在提高甘蓝型油菜的角果皮中花青素含量中的应用。在本发明中，所述甘蓝型油菜的品种优选为PR(甘蓝型油菜，来自中国农业科学院油料作物研究所，型号为L1)。由实施例可知，BnaPAP2.C6.a参与了不同PR组织的花青素的转录调控，BnaPAP2.C6.a主要调控茎秆和角果皮中花青素的合成。

本发明提供了上述基因BnaPAP2.c6.a在植物育种中的应用。所述的BnaPAP2.C6.a基因表型相较于现有技术中的BnaPAP2.A7更稳定，更容易被观察，具有更高的育种价值。

为了进一步说明本发明，下面结合附图和实施例对本发明提供的一种提高植物中花青素含量的基因BnaPAP2.c6.a及其应用进行详细地描述，但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例

1、甘蓝型油菜PR纯化

申请人于2015年5月将PR种植于青海大学实验基地，于7月26日初花，选取PR初花期花序，用显微镜观察油菜小孢子的发育时期，选取单核靠边期的小花蕾，测定花蕾大小，便于后期花蕾挑选。利用小孢子培养技术，获得双单倍体PR幼苗，于2015年11月种植于华中农业大学试验基地。

2、紫秆性状的遗传分析

选取ZS11(中双11号)为绿色茎秆亲本，与纯化后的双单倍体PR分别做正反杂交。杂交F

3、BnaPS.C6的初步定位

从F

由图2可知，以甘蓝型油菜Darmor-bzh为参考基因组，紫秆亲本和紫秆混池在C6染色体有一个显著的上调的SNP峰，效应值较高；绿秆混池在C6染色体有一个显著的下调的SNP峰，差异最明显。因此，BnaPS.C6位于C6染色体，根据SNP最高峰在参考基因组C6染色体上的物理位置，推测紫秆性状目标基因位于C6染色体27～28.6M区间。

4、BnaPS.C6的精细定位

利用PR和ZS11的SNP信息，设计了从27～32M区间的InDel引物837对，设计条件为插入或缺失碱基数大于等于2个。首先，利用亲本PR和ZS11筛选差异引物，其中763对引物在两个亲本之间存在差异。其次，利用PR、ZS11和两个极端单株混池(极端紫秆10株混合成一个样，极端绿秆单株混合成一个样)筛选双亲间存在差异的标记，其中546对引物存在差异且与表型一致(紫色表型的紫叶油菜和极端紫色单株带型一致，绿色表型的ZS11和极端绿秆单株带型一致)。随后，利用PR、ZS11、极端紫秆单株10株和极端绿秆单株10株共22个DNA样品筛选上述546对差异引物，其中505对引物在PR和紫秆极端单株与ZS11和绿秆极端单株间存在差异，用于后续基因定位。

构建了约22000株的F

为了确定候选基因，结合Darmor-bzh参考基因组基因注释信息，在约18.5Kb的目标区间内没有发现与花青素相关的基因。甘蓝型油菜基因组测序和大量的研究表明甘蓝型油菜A7和C6染色体同源性较高，容易发生部分同源交换，随后利用PR的重测序数据做了部分同源交换(Homeologous exchanges，HEs)分析，分析结果如图4所示。

由图4可知，PR在A7和C6染色体不存在部分同源交换，排除定位在C6染色体上的目标基因为A7交换到C6的可能。推测在该区间Darmor-bzh基因组在组装时可能存在gap，导致目标性状基因在定位区间未能找到。

5、BnaPS.C6候选基因预测

利用BLAST比对获得了目标区段在NY7(宁油7号)和ZS11基因组C6染色体序列上的同源区段，NY7对应的区间大小约284Kb，包含34个获得注释的基因；ZS11对应的区间大小约292Kb，获得注释的的基因数为28个。结合花青素代谢通路相关基因在NY7和ZS11中同源基因的信息，发现在NY7和ZS11区间均存在三个与拟南芥AtPAP2基因高度同源的基因，且均分别以串联重复的形式存在。NY7中的三个基因为chrC06g003359、chrC06g003363和chrC06g003367，ZS11中的三个基因为BnaC06G0328400、BnaC06G0328700和BnaC06G0329100。将这三个基因分别命名为BnaPAP2.C6.a(BnaC06G0329100-chrC06g003367)，BnaPAP2.C6.c(BnaC06G0328700-chrC06g003363)和BnaPAP2.C6.b(BnaC06G0328400-chrC06g003359)(如图3所示)。

6、BnaPAP2.C6.a是调控PR紫色茎秆的关键基因

BnaPAP2.A7全长基因能够显著上调花青素晚期合成基因的表达，从而促进受体植株叶片紫色的产生。

分别选取了3株PR和ZS11，收集幼嫩茎秆并提取RNA，用于转录组测序(对AtPAP2的9个同源基因进行测序检测，检测目的是为了分析不同基因的表达)，结果见图5中的A(图5中的A为ZS11和PR茎秆9个AtPAP2同源基因表达量分析)及表1。

表1 转录组测序表达量

注：BnaPAP2.c6.b和BnaPAP2.c6.a在ZS11中的表达为正常的误差数据；未表达的基因序列与公布的参考基因组序列相同。

由图5中的A和表1可知，转录组测序分析表明，BnaPS.C6位点的三个AtPAP2的同源基因BnaPAP2.C6.a、BnaPAP2.C6.b和BnaPAP2.C6.c中，基因BnaPAP2.C6.a在PR茎秆中上调表达，在ZS11茎秆中不表达，而基因BnaPAP2.C6.a的同源基因BnaPAP2.C6.b和BnaPAP2.C6.c在ZS11和PR茎秆中均不表达。

分别选取了3株PR和ZS11，收集幼嫩茎秆并提取RNA，经反转录后获得相应的cDNA。结合NY7和ZS11参考基因组信息，分别针对基因BnaPAP2.C6.a、BnaPAP2.C6.b和BnaPAP2.C6.c设计三对特异引物如SEQ ID NO:2～7所示。

表2 C6染色体目标区间三个PAP2同源基因定量特异引物

设置62℃条件进行退火延伸，直至基因BnaPAP2.C6.a、BnaPAP2.C6.b和BnaPAP2.C6.c的特异引物在ZS11和PR的DNA中均能扩增得到单一目的基因片段。随后，利用扩增得到的ZS11和PR的cDNA进行荧光定量分析，结果见图5中的B(图5中的B为BnaPAP2.C6.a特异引物qRT-PCR分析)和表3。

表3 实时表达量

由图5中的B和表3可知，只有BnaPAP2.C6.a的在PR中表达，在ZS11中不表达。说明基因BnaPAP2.C6.a是调控PR中花青素合成的关键基因。

7、基因BnaPAP2.C6.a在不同组织部位表达模式分析

分别选取PR的叶片(Leaf)、茎秆(Stem)、花(Flower)和幼嫩角果(Pod skin)做了转录组测序分析(对AtPAP2的9个同源基因)。结果见图6(图6为甘蓝型油菜AtPAP2同源基因不同拷贝在PR不同组织表达模式分析)和表4。

表4 转录组测序分析

由图6和表4可知，在PR的茎秆中，BnaPAP2.C6.a有较高的表达，而BnaPAP2.C6.a的表达量远高于BnaPAP2.A7，表明所述的BnaPAP2.C6.a基因表型更稳定，更容易被观察，育种利用价值更高。在幼嫩的角果皮中，BnaPAP2.A7和BnaPAP2.C6.a均有一定的表达，BnaPAP2.C6.a的表达量高于BnaPAP2.A7。上述结果表明，在PR中，BnaPAP2.A7和BnaPAP2.C6.a参与了不同组织的花青素的转录调控，BnaPAP2.C6.a主要调控茎秆和角果皮中花青素的合成。

虽然本发明已以较佳的实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可以做各种改动和修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

序列表

<110> 赣南师范大学

<120> 一种提高植物中花青素含量的基因BnaPAP2.c6.a及其应用

<160> 7

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 3885

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

tgatccattc cttgaagcca tcaggatcca aaaccagttc agaggactcc ccgaaggaac 60

tgtaataatg aagatacaga caagcaggca gaactgtcta tcagaagaga gcaagattgt 120

gtggaacaat ggaaagattg tccagaatat gttccttaag ctccagaacg ttgagtgtgg 180

agaggtcgag cttcaacttg agtggatcga tgtctcaggt cttctgagta taaatgagca 240

tgaggatgtt gcttactaga tctattatct tattacatca agtttgttag aaaatatact 300

agttatgaag ctggcgtggg ggagttatgg gctttaaacc aaaactcccc caattgtttt 360

tttataaatt gaaaagaaaa aactcttctc tggttttgtg ttcttactct aacaagaaaa 420

acataacaca ctttgttgta gagagaggaa acaaggaatg agatgaaatc aagtagatag 480

cataagatga gatggagaaa ctgatttttt tctctcattt tacacaacat cttctactac 540

atattcatat aagaaaatca gagtaatgaa ctctgttttc tctaccctta cacatgttat 600

aaagccccat aaagctacca ctctagacac cacattttag caaaagaaac aagcaacttc 660

aagaacttga acaattcaaa ataaacagtt aacttcaaca acttccttga cttgttgtac 720

tttgttttct ttcattattc tcacttgttt tgttgatacc attgtgcagg attaacagag 780

atgagatttc agcatacttg ttatgataaa tgtaaaaaag ctactgaatc aacgatatgg 840

tttttatgtg tttctgacct ttgtttttgt tttcaacact ttaattgcat cttattgaaa 900

gagagacttg ctcgggtcct gtttagtaat gacaaatggt gatcatcaaa tgtgaaaaga 960

tcaagaatcg atatgcttgc atctaagttt gaaaatccgc agatggatga gaattaatca 1020

tttgaggaac tcagtggaaa actgagtgca acagcaaata tgaagcacaa acaatgggaa 1080

agacatacaa agacaaaaag cttggaagaa acttctcaga tgtttaccct caaagttaaa 1140

tccaagaaga cagctatgga cactgcacta gacactgaca caatggattt tggtgaagtc 1200

acgggtcact tacaagcata tgagatgaat gagaaactca aggaagaact gtctaaaaaa 1260

atctgaaact agaaagcaga ttcacatgct gaatagtgga accaagaatc tggagaagat 1320

tctctctgtt agaagggtag gcaagtccaa ctttgtgtct cggttacagt ggaaaactac 1380

agaaaaacag agtttgttcc ggctaagact tgagagattg cgtctgatac tacaggaagt 1440

aggatatcaa ccaagatcat ctattgtgaa actgaaacca gtaagaacta taatgtaggc 1500

tacttctgtg gtaaatacat gcacatacca agagatactt acaaatttca aaaaagaatc 1560

actccagagt tgactttgct ttccaatctt tacaggttta acgttaaata tgaaatttgt 1620

agtcaaacga ttatgatgga tttcatcaaa tcttattgtt ttaatatcaa atgaggttca 1680

agttacatat ttctgaactc cctagccaaa agtacatact cacaatgtga gacactttaa 1740

atacggaaca atttgcaaaa tagtgatttg tgtactcata attattgtag ctgatttttg 1800

tctacataca tttgttgaca gaaaaacaat acgctactta tcaagttgtg tactcataca 1860

tcaaccctct gtctctctgt ctccctgtcc ctgtctctct ctctctctct ctctctctct 1920

ctctctctct ctctctctct ctctctctct ctctctctct ctctctctct ctctctctct 1980

ctctctctct ctctattctg tttttaactc tggtgcatga agctgttctc tcttttaatc 2040

atataaacca cctttccacc aatcattaat cgtcctttct gctaactttg ctaagaggca 2100

tgtttttcct ttaaagtact gaaaaatatg aagagactaa gtgatatgct atgctatgac 2160

gaaaatggac taagtgctat gaaccttttc tgtatttagt ttgaatcagt agcagaacat 2220

aaataactaa attagcaaat tagacacgac aaaatgtgct atgaaccttt tttgtttctg 2280

catcgtaccc tggaagttgt taaaaaaaaa agacacgaca aaaatgtgga tgttagacat 2340

gcacgtcact tctctttgcc cgtcacgtgt ataaataaag tcctcgaagg atttgtcaag 2400

ccacaataga aacccttttc ctcaagcctg cctttacgta taacttttta aaataaaatt 2460

tggttagata cttctaaaat tatcgctggt ccatggaggg tatgtccaaa gggttgaaaa 2520

aaggtgcatg gactgctgaa gaagataatc tcttgaggca atgcattgat aagtatggag 2580

aagggaaatg gcaccaagtt cctttaagag ctggtatgtc tttttttttt tgataaaata 2640

agagctggta tgctactttt attaattttc acacacacac acatatatat atatacatat 2700

aactaataag tacgtatact ctttttattt ttcagtacat ttattttctt tctctctgtc 2760

tactattagg aaattaatta acaccggggt acacaatcat tgtttttttt ttttgtaact 2820

gaggcttaca atcacaatca ttgtttttct tttcgtttta atgaaggaat catagattca 2880

aatgtttgtt tttcatgaga aaaaaaaaat atttgcgttc ttcatgttta agtataaagc 2940

gagaaggcaa ttctctttat tgattcgtag tttttttttg agaaatagct ttttttattt 3000

gttgaatttt ctgcacgaac cagtatgttt gtgtggaata tgttgtttat actggtgtac 3060

tttgattctt cttttaataa tattaaatgt caattggttt tgtaggtcta aatcggtgca 3120

ggaagagttg tagactaaga tggttgaact atttgaagcc aagtatcaag agaggaaaac 3180

tcaactctga tgaagttgat cttcttattc gccttcataa gcttttagga aacaggttta 3240

cattcaagac acaaattcaa ctttatttcg tatcctcatt cggtctaatc taatcatttg 3300

atttgttttt ttttttgata aaaagtactt ttcatatgta atgatccatt actaagtcat 3360

atatatccct aatttttcaa atgcatgctt aggtggtctt taattgctgg tagattaccc 3420

ggtcggaccg ccaatgacgt caaaaattac tggaacaccc atttgagtaa gaaacatgaa 3480

ccaggttgta agacccagat gaaaaagaga aacattcctt gctcttatac cacaccagcc 3540

caaaaaatcg acgttttcaa acctcgacct cgatccttca ccgttaacaa cggctgcagc 3600

catattaatg gcatgccaga agctgacatt gttcctctat gccttggact caacgacact 3660

aataatgttt ctgaaaatat aatcacatgt aacaaagatg atgataaatt tgagcttgtt 3720

agtaatttaa tggatggtca gaataggtgg tgggaaagtt tgctagatga gagccaagat 3780

ccagctgcgc tctttccaga agctacagca acaaaaaaag gcgcaacctc cgcgtttgac 3840

gttgagcaac tttggagcct gttggatgga gaaactggaa cttga 3885

<210> 2

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

ctggtccatg gagggtat 18

<210> 3

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

cgaataagaa gatcaacttc atca 24

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

ggttgagaaa aggtgcatgg 20

<210> 5

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

caaaagttta tgaaggcgga gc 22

<210> 6

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

aaacgtttga gaaaaggtgc atatat 26

<210> 7

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

caaaagttta tgaaggcgga gc 22