检测新型阿卡斑病毒S基因的荧光定量RT-PCR引物及其试剂盒

技术领域

本发明属于新型阿卡斑病毒检测领域，尤其涉及检测新型阿卡斑病毒S基因的荧光定量RT-PCR引物及其试剂盒。

背景技术

阿卡斑病毒(Akabane vrius,AKAV)是阿卡斑病(又称赤羽病)病原，该病是一种虫媒性传染病，可导致牛、羊流产、死胎、胎儿畸形，并通过垂直传播，侵害胎儿中枢神经，造成积水性无脑综合症和新生胎儿关节弯曲；主要流行于热带、亚热带及温带地区，如亚洲、非洲的部分国家和大洋洲，并在我国多省广泛流行，严重威胁动物健康，因此被列为国际动物贸易的重点检疫对象、我国二类动物疫病和我国进口牛、羊必检7种疫病之一。

AKAV属于布尼亚病毒科(Bunyaviridae)正布尼亚病毒属(Orthobunyavirus)辛波(Simbu)病毒血清群，为分节段单股负链RNA病毒，基因组全长12kb，由S、M、L共3个基因节段构成。S基因编码核衣壳蛋白，高度保守；M基因编码病毒囊膜糖蛋白，高度变异；L基因编码具有RNA酶活性的L蛋白，变异程度仅次于M蛋白。根据S、M基因进化分析，可将全球分离到的AKAV分为4个基因型，其中基因I型可分为Ia、Ib两个亚型。

除牛、羊外，AKAV可以感染马、水牛、骆驼，还可以在猪、兔、野牛、河马、长颈鹿、大象、大羚羊甚至灵长动物等十几种家畜、野生动物中检出AKAV抗体。2016年申请人在竹鼠中分离到新型阿卡斑病毒并申请中国专利(“用于检测新型竹鼠源阿卡斑病毒的RT-PCR引物及其试剂盒”，专利号ZL201710372744.X，公开日2017.05.24)，该研究首次证实AKAV可以感染啮齿动物，而且与传统毒株相比，该毒株发生一定程度变异，临床症状也有变化，说明新型阿卡斑病毒在宿主范围和致病力上发生改变。随后，云南、广东、湖南、海南等省相继在牛、蠓虫、中华按蚊、致倦库蚊中发现与新型阿卡斑病毒同源性高的AKAV毒株，说明该毒株可能已在一定范围内流行，十分有必要加强对新型阿卡斑病毒的监控。

前述专利公开了采用普通RT-PCR检测新型阿卡斑病毒，其最低检测限10

孟锦昕等研究了阿卡斑病毒荧光定量RT-PCR检测(阿卡斑病毒qRT-PCR检测方法的建立及应用[J].云南畜牧兽医，2020(4)：1-4.)，其中使用的AKAV毒株为云南分离株，与前述专利及本发明使用毒株GXLCH16-70同属Ia亚型。然而，二者NSs蛋白氨基酸序列中存在两处氨基酸位点差异，分别是S22N、F70S，这两个重要位点的差异可能影响蛋白结构，进而影响蛋白功能。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种特异、敏感、快速且可定量的检测新型阿卡斑病毒S基因的荧光定量RT-PCR引物及其试剂盒。

为解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案：

检测新型阿卡斑病毒S基因的荧光定量RT-PCR引物，包括引物AKAVSF1和引物AKAVSR1，它们分别具有序列表SEQ.ID.No.1和SEQ.ID.No.2的碱基序列。

引物AKAVSF1和引物AKAVSR1的摩尔比为1:1。

上述荧光定量RT-PCR引物在扩增新型阿卡斑病毒S基因中的应用。

扩增反应条件为：95℃30s 1个循环；95℃30s、64℃30s、72℃30s共40个循环。

检测新型阿卡斑病毒S基因的荧光定量RT-PCR试剂盒，含有引物AKAVSF1和引物AKAVSR1，它们分别具有序列表SEQ.ID.No.1至SEQ.ID.No.2的碱基序列。

引物AKAVSF1和引物AKAVSR1浓度均为10μM。

该试剂盒还包括以下试剂：RNA提取试剂、反转录试剂、荧光定量RT-PCR扩增试剂、新型阿卡斑病毒阳性对照和阴性对照。

RNA提取试剂、反转录试剂分别为Takara的MiniBEST Universal RNA Extraction试剂盒(9767)和PrimeScript RT Master Mix(RR036Q)，荧光定量RT-PCR扩增试剂为SYBRPremix Ex Taq II(RR820A)；阳性对照为新型阿卡斑病毒S基因片段的质粒，阴性对照为新型阿卡斑病毒阴性的昆明小鼠血清。

上述荧光定量RT-PCR试剂盒在扩增新型阿卡斑病毒S基因中的应用。

扩增反应条件为：95℃30s 1个循环；95℃30s、64℃30s、72℃30s共40个循环。

针对目前新型阿卡斑病毒PCR检测存在的问题，结合新型阿卡斑病毒S基因的特点，发明人设计并制备了检测新型阿卡斑病毒S基因的荧光定量RT-PCR引物，包括引物AKAVSF1和引物AKAVSR1，它们分别具有序列表SEQ.ID.No.1和SEQ.ID.No.2的碱基序列。据此，发明人还建立相应的荧光定量RT-PCR检测方法并制备相应的荧光定量RT-PCR试剂盒。实验表明，本发明具有特异、敏感、快速、简便的特点，而且检测灵敏度高，在标准品为1.0×10

附图说明

图1是新型阿卡斑病毒S基因荧光定量RT-PCR标准曲线，图中：横轴为重组质粒标准品拷贝数的对数值，纵轴为Ct值。

图2是新型阿卡斑病毒S基因荧光定量RT-PCR特异性检测结果图，图中：1-3是新型阿卡斑病毒细胞培养上清(3个重复)，4-15分别是蓝舌病、鹿流行性出血热、竹鼠圆环病毒和布鲁氏杆菌(各3个重复)。

具体实施方式

实施例1引物设计

根据Genbank的新型阿卡斑病毒GXLCH16-70毒株的S基因保守区(登录号KY381274)，用Primer 5.0等软件设计引物AKAVSF1和AKAVSR1、AKAVSF2和AKAVSR2(SEQ.ID.NO.1-SEQ.ID.NO.4)，由南宁捷尼斯生物科技有限公司合成，用DEPC ddH

表1引物序列

实施例2荧光定量RT-PCR检测方法的建立

(1)标准品的制备

以感染新型阿卡斑病毒的Vero细胞培养提取物为模板，分别采用AKAVSF1和AKAVSR1、AKAVSF2和AKAVSR2分别扩增新型阿卡斑病毒基因组S基因129bp、135bp扩增产物(SEQ.ID.NO.5、SEQ.ID.NO.6)，按经典分子克隆方法，将其连接pMD-18T载体，进行克隆。抽提阳性克隆质粒pMD-AKAVS1、pMD-AKAVS2，利用分光光度计测定质粒浓度，分别制备1.0×10

(2)荧光定量RT-PCR反应条件优化

对引物AKAVSF1和AKAVSR1、AKAVSF2和AKAVSR2的荧光定量RT-PCR反应条件进行优化探索，在不同引物用量(0.2μL、0.4μL、0.6μL和1.0μL)、退火温度(58℃、60℃、62℃、64℃和66℃)、添加Mg

(3)荧光定量RT-PCR反应体系的建立

以各浓度标准品为模板，配置荧光定量RT-PCR反应液(表2)，置于荧光定量PCR仪中进行反应，反应条件：95℃30s 1个循环；95℃30s、64℃30s、72℃30s共40个循环。每浓度标准品3个平行重复。

根据标准品浓度的对数值和Ct值为坐标，分别绘制标准曲线，如图1所示，引物AKAVSF1和AKAVSR1荧光定量RT-PCR标准曲线的回归方程为y＝-3.3556x+38.072，R

(4)检测结果的判定

根据荧光定量RT-PCR反应收集荧光信号，若待测样品荧光信号超过阈值且Ct≤35，同时扩增曲线为平滑的“S”型，则可判定待测样品中含有新型阿卡斑病毒。

同时，根据荧光定量RT-PCR的标准曲线，可以对样品中新型阿卡斑病毒进行定量测定。

表2荧光定量RT-PCR反应液组份

(4)荧光定量RT-PCR的评价

1)特异性试验

应用建立的荧光定量RT-PCR方法，分别对蓝舌病、鹿流行性出血热、竹鼠圆环病毒和布鲁氏杆菌进行检测，结果发现，蓝舌病、鹿流行性出血热、竹鼠圆环病毒和布鲁氏杆菌均不能有效扩增，只有新型阿卡斑病毒能够有效扩增(图2)。

以上试验结果表明，本发明具有较强的特异性，引物与新型阿卡斑病毒特异性结合，与其他牛源和竹鼠源病原都没有交叉反应，方法特异性好。

2)灵敏性和检测范围试验

应用建立的荧光定量RT-PCR方法，分别以浓度为1.0×10

3)重复性试验

应用建立的荧光定量RT-PCR方法，分别以浓度为1.0×10

表3 AKAV S基因荧光定量RT-PCR检测方法重复性实验结果

实施例3荧光定量RT-PCR试剂盒组成及评价

(1)荧光定量RT-PCR试剂盒组成

特异性引物AKAVSF1和AKAVSR1，浓度均为10μM；

RNA提取试剂：Takara的MiniBEST Universal RNA Extraction试剂盒(9767)；

RNA反转录试剂：Takara的PrimeScript RT Master Mix(RR036Q)；

扩增试剂：Takara的SYBR Premix Ex Taq II(RR820A)以及Rnase-Free ddH

阴阳性对照：阳性对照为实施例2中制备的标准品，即新型阿卡斑病毒S基因质粒，阴性对照为新型阿卡斑病毒阴性的昆明小鼠血清。

(2)试剂盒反应条件

根据RNA提取试剂盒说明书操作，抽提正常Ver细胞和接种新型阿卡斑病毒的Vero细胞总RNA，并去除其中基因组DNA，用实施例2中建立的荧光定量RT-PCR进行检测并分析结果。

若待测样品荧光信号超过阈值且Ct≤35，同时扩增曲线为平滑的“S”型，则可判定待测样品中含有新型阿卡斑病毒。

同时，根据荧光定量RT-PCR的标准曲线，可以对样品中新型阿卡斑病毒进行定量测定。

(3)荧光定量RT-PCR试剂盒与普通RT-PCR灵敏性比较

将新型阿卡斑病毒S基因标准品稀释成1.0×10

(4)荧光定量RT-PCR试剂盒的应用

用经过鉴定的新型阿卡斑病毒感染Vero细胞为实验组，同时以PBS接种Vero细胞为对照组，待实验组Vero细胞出现明显细胞病变后收毒。抽提实验组和对照组Vero细胞总RNA，并去除其中基因组DNA，应用上述试剂盒及实施例2中建立的荧光定量RT-PCR进行检测并分析结果。

结果发现，实验组Vero细胞中检出新型阿卡斑病毒S基因，符合预期，表明本发明的检测方法准确、可靠。

序列表

<110> 广西壮族自治区兽医研究所

<120> 检测新型阿卡斑病毒S基因的荧光定量RT-PCR引物及其试剂盒

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

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<210> 2

<211> 20

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<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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