一株西尼罗病毒感染性克隆的构建及其应用

文献发布时间：2023-06-19 16:09:34

技术领域

本发明属于病毒分子生物学和基因重组技术领域，具体涉及一株西尼罗病毒感染性克隆的构建及其应用。

背景技术

西尼罗病毒(west nile virus，WNV)是一种单股正链RNA病毒，为黄病毒科黄病毒属成员，可引起人和动物发生西尼罗河热和西尼罗病毒脑膜脑炎，库蚊是其主要的传播媒介，鸟类是该病毒的中间宿主，而人和马则是终端宿主。WNV广泛分布于非洲、中东、欧洲的部分地区。目前尚无针对WNV感染的人用疫苗以及治疗药物。虽然我国至今没有WNV感染疫情发生，但有输入性传播的可能。WNV最早于1937年在乌干达西尼罗地区被发现，起初仅在小范围传播，并未引起严重疾病，直至1999年在美国纽约暴发流行后，迅速传播至美洲大陆，引发了严重的公共卫生问题。WNV除了给人类健康带来威胁外，在北美等地也导致了大量的马匹、鸟类等家禽及野生鸟禽的感染及死亡。

WNV基因组为单股正链RNA，由约11kb个核苷酸组成。整个基因组包括5’端非编码区(non-coding region，NCR)、3’端非编码区以及中间的一个开放阅读框架(open readingframe，ORF)。开放阅读框编码一个多聚前体蛋白，在病毒和宿主蛋白酶作用下可被切割成3种结构蛋白：衣壳蛋白(capsid protein，C)、膜蛋白(membrane protein，M)和包膜蛋白(envelope protein，E)以及7种非结构蛋白：NS1、NS2A、NS2B、NS3、NS4A、NS4B和NS5。结构蛋白在病毒颗粒组装成熟中发挥着重要作用，非结构蛋白主要参与病毒基因组的复制。

病毒感染性克隆，即含有病毒全长基因组的质粒是用于基础病毒学研究与抗病毒科技开发的重要工具。大肠杆菌是最常用也是操作最方便用于扩增质粒的宿主细胞，但黄病毒基因组在大肠杆菌中极不稳定，这给利用大肠杆菌为宿主菌构建病毒感染性克隆造成很大困难。

发明内容：

本发明利用基因重组技术，构建成功了一种用大肠杆菌扩增、遗传稳定的西尼罗病毒全长基因组感染性克隆，利用该克隆作为模板转录出RNA，将RNA转染BHK-21细胞，可制备出西尼罗病毒，体外可感染Vero E6细胞，体内可感染小鼠，在小鼠脑组织中复制，引起小鼠死亡。该感染性克隆为开展西尼罗感染与致病机制研究以及检测技术与疫苗和药物研发提供了一种重要且方便的工具。

本发明提供了一株西尼罗病毒感染性克隆质粒，其特征在于：含有一株西尼罗病毒全长基因组，

在病毒基因组中引入了一个核苷酸点突变，以及长度为133个核苷酸的哺乳动物细胞内含子基因。

本发明提供的一株西尼罗病毒感染性克隆，其特征在于：能在大肠杆菌中高效扩增，稳定遗传。

本发明提供的一株西尼罗病毒感染性克隆，其特征在于：作为模板转录出病毒基因组RNA，将RNA转染BHK-21细胞，产生西尼罗病毒。

本发明提供的一株西尼罗病毒感染性克隆，其特征在于：以之为模板制备出的西尼罗病毒，可感染Vero E6细胞，在细胞内表达病毒蛋白。

本发明提供的一株西尼罗病毒感染性克隆，其特征在于：以之为模板制备出的西尼罗病毒，可感染小鼠，在小鼠脑组织中复制，并引起小鼠死亡。

本发明提供的一株西尼罗病毒感染性克隆，或基于该感染性克隆构建的突变株在西尼罗病毒感染与致病机制研究以及检测技术与疫苗和药物研发中的应用。

附图说明

图1：根据限制性内切酶位点的分布将WNV基因组分为4段；

图2：质粒载体pUC18中SalI、XbaI和BamHI三个酶切位点的位次顺序；

图3：WNV感染性克隆质粒中的WNV基因表达结构(NCR:非编码区)；

图4：免疫荧光检测Vero E6细胞中的WNV核心蛋白

其中，左图为：对照BHK-21培养液感染的Vero E6细胞；

右图为：RNA转染BHK-21培养液感染的Vero E6细胞；

图5：免疫荧光检测病毒感染小鼠脑组织的中WNV核心蛋白；

其中，左图为：对照细胞培养液注射的小鼠脑组织切片

右图为：WNV注射的小鼠脑组织切片。

具体实施方式

为了更清楚地说明本发明，下面结合优选实施例对本发明做进一步的说明。本领域技术人员应当理解，下面所具体描述的内容是说明性的而非限制性的，不应以此限制本发明的保护范围。

一、WNV基因组限制性核酸内切酶位点分析：

根据序列一株WNV序列(GenBank:AF404756.1，文献：Complete genome SEQuencesand phylogenetic analysis of West Nile virus strains isolated from the UnitedStates,Europe,and the Middle East,Virology,2002,298(1),96-105)，基因组全长11029 nt(序列1)，分析基因组中限制性核酸内切酶位点的分布，利用位于第2495 nt的NgoMI酶切位点(G/CCGGC)、位于第5780nt的SplI酶切位点(C/GTACG)、位于第8870 nt的XhoI酶切位点(C/TCGAG)，将全长病毒基因组分为四段(图1)，目的是可使用这些酶切位点将四段合成的基因进行酶切、连接，从而得到病毒全长基因组。所用的质粒载体是pUC18，使用其中的三个酶切位点：SalI、XbaI和BamHI(图2)，将四段基因插入在该质粒载体中，通过酶切、连接，最终得到含有WNV全长基因组的质粒。

序列1：11029 nt

NCR：非编码区；图1显示WNV基因组的第2495 nt为NgoMI酶切位点，第5780 nt为SplI酶切位点，第8870 nt为XhoI酶切位点

二、WNV基因组分段合成：

委托生物技术公司合成四段分段基因。

片段1：病毒基因组5′端第1-2500 bp，在其5′端引入SalI酶切位点(G/TCGAC)和T7启动子，即T7噬菌体RNA聚合酶结合位点(TAATACGACTCACTATAG)，其序列如SEQ2，长2534nt，其3′端为病毒基因组第2495 nt的NgoMI酶切位点(G/CCGGC)，以及引入的XbaI酶切位点(T/CTAGA)；合成的基因插入在质粒载体pUC18的SalI和XbaI位点之间，得到质粒pUC18-WNV-F1。

片段2：病毒基因组第2495～5785 nt，其5′端为引入的SalI酶切位点以及病毒基因组中的NgoMI酶切位点，3′端为病毒基因组中5780 nt的SplI酶切位点(C/GTACG)，以及引入的XbaI酶切位点，其序列如SEQ3，长3303 nt；合成的基因插入在质粒载体pUC18的SalI和XbaI位点之间，得到质粒pUC18-WNV-F2。

片段3：病毒基因组第5780～8875 nt，其5′端为引入的XbaI酶切位点以及病毒基因组中的SplI酶切位点，3′端为病毒基因组8870 nt的XhoI酶切位点(C/TCGAG)以及引入的BamHI酶切位点(GG/ATCC)，其序列如SEQ4，长3112 nt；合成的基因插入在质粒载体pUC18的XbaI和BamHI位点之间，得到质粒pUC18-WNV-F3。

片段4：病毒基因组第8870～11029 nt，其5′端为引入的XbaI酶切位点以及病毒基因组中的XhoI酶切位点，3′端引入BamHI酶切位点，其序列如SEQ5，长2172 nt；合成的基因插入在质粒载体pUC18的XbaI和BamHI位点之间，得到质粒pUC18-WNV-F4。

三、分段合成的片段1和片段2的连接：

将质粒pUC18-WNV-F2用限制性核酸内切酶NgoMI以及XbaI同时酶切，切出WNV基因组片段2；将质粒pUC18-WNV-F1也用NgoMI以及XbaI同时酶切，使得质粒被线性化，线性化末端分别为NgoMI以及XbaI酶切位点；将切出的WNV基因组片段2插入线性化的质粒pUC18-WNV-F1，用T4 DNA连接酶连接，连接反应产物转化感受态大肠杆菌STBL3，用3～5毫升LB培养液培养大肠杆菌，抽提质粒，用NgoMI以及XbaI酶切，分析片段2是否插入质粒pUC18-WNV-F1中，如果酶切出片段2，则片段1和片段2连接成功，质粒命名为pUC18-WNV-F1F2。酶切、连接、大肠杆菌转化、质粒抽提等常规分子生物学操作均参照《分子克隆实验指南》(第三版)J.萨姆布鲁克一书所述的方法进行。

四、片段1中插入哺乳动物内含子基因：

上述分段合成的片段1和片段2的连接操作多次均成功，将片段1和片段2连接反应液转化大肠杆菌STBL3，未见到阳性菌落，重复连接和转化大肠杆菌操作3次，仍未见阳性菌落。分析原因，极可能与黄病毒属病毒基因组在大肠杆菌中的不稳定性有关。其主要原因是病毒基因组中存在大肠杆菌启动子，导致病毒基因组在大肠杆菌中表达出对大肠杆菌具有毒性的异常蛋白质。

片段1包括了WNV的C基因、M基因和E基因以及NS1基因5′端31个核苷酸，由于片段1质粒在大肠杆菌中稳定，因此分析可能是片段1和片段2衔接处的基因序列影响了两段基因连接以后在大肠杆菌中的稳定性。我们尝试在片段1的近3′端插入一段哺乳动物内含子基因，即在片段1和片段2中间引入一段干扰基因，可能中止其在大肠杆菌中转录表达出毒性蛋白。该内含子序列理论上不影响WNV的产生，因为在哺乳动物细胞mRNA中，内含子序列可被切除。由于内含子剪接具有序列选择性，如CAG/G就是一个优选的内含子剪接位点，在CAG/G之间插入侧翼序列分别为5′-GTAAGT------CAG-3′的内含子，在哺乳动物细胞转录出的前体mRNA中，内含子被切除，前体mRNA再拼接为成熟mRNA。因此，我们选择位于基因组2350-2353 nt的CAAG为内含子插入位点，将第2352 nt的A变为G，密码子CAA随之变为CAG，编码的氨基酸均为谷氨酰胺，即该突变不改变其编码的氨基酸残基，从而形成哺乳动物细胞内含子的优化剪接位点CAG/G，在CAG/G之间插入一段哺乳动物内含子基因序列SEQ6，参考哺乳动物细胞表达载体pCI-neo(Promega公司产品，Genbank：U47120.2)中的内含子序列。将含有哺乳动物内含子基因的片段1命名为片段1I，相应质粒命名为pUC18-WNV-F1I。

按照三所述的方法，将分段合成的片段1I和片段2的连接，片段1I和片段2连接成功，得到质粒pUC18-WNV-F1IF2。

五、分段合成的片段3和片段4的连接：

将质粒pUC18-WNV-F4用限制性核酸内切酶XhoI以及BamHI同时酶切，切出WNV基因组片段4；将质粒pUC18-WNV-F3也用XhoI以及BamHI同时酶切，使得质粒被线性化，线性化末端分别为XhoI以及BamHI酶切位点；将切出的WNV基因组片段4插入线性化的质粒pUC18-WNV-F3，用T4 DNA连接酶连接，连接反应产物转化感受态大肠杆菌STBL3，用3～5毫升LB培养液培养大肠杆菌，抽提质粒，用XhoI以及BamHI酶切，分析片段4是否插入质粒pUC18-WNV-F3中，如果酶切出片段4，则片段3和片段4连接成功，质粒命名为pUC18-WNV-F3F4。

SEQ2：2534 nt

SEQ3：3303 nt

SEQ4：3112 nt

SEQ5：2172 nt

SEQ6：133 nt

六、WNV全长基因组的连接：

将质粒pUC18-WNV-F1IF2用限制性核酸内切酶SalI和SplI同时酶切，切出WNV基因组片段F1F2；将质粒pUC18-WNV-F3F4也用SalI和SplI同时酶切，使得质粒被线性化，线性化末端分别为SalI和SplI酶切位点；将切出的WNV基因组片段F1IF2插入线性化的质粒pUC18-WNV-F3F4，用T4 DNA连接酶连接，连接反应产物转化大肠杆菌STBL3，用3～5毫升LB培养液培养大肠杆菌，抽提质粒，用SalI和SplI酶切，分析片段F1IF2是否插入质粒pUC18-WNV-F3F4中，如果酶切出片段F1IF2，则WNV全长基因组连接成功，即为WNV感染性克隆，质粒命名为pUC18-WNV2KI。

将质粒pUC18-WNV2KI转化大肠杆菌STBL3，抽提质粒，再转化大肠杆菌STBL3，连续10次，将每一次抽提的质粒送生物公司进行基因测序，结果未发现有核苷酸突变，表明该质粒能在大肠杆菌中稳定遗传。

如图3所示，感染性克隆pUC18-WNV2KI质粒中含有全长WNV基因表达结构，包括T7启动子和WNV全长基因组，该结构全长11192 bp，序列见SEQ7，插入在质粒载体pUC18的SalI和BamHI位点。其中1-6 nt为Sal酶切位点，7-24 nt为T7启动子，第2376 nt的G为WNV基因组原始序列中第2352 nt的A突变而来，2377-2509 nt为哺乳动物内含子基因，11187-11192nt为BamHI位点。

SEQ7：11192 nt

七、WNV基因组RNA的转录：

质粒pUC18-WNV2KI以限制性核酸内切酶BamHI酶切，然后以酶切线性化的质粒pUC18-WNV2KI为模板，用T7 RNA体外转录试剂盒转录出WNV基因组RNA，所用试剂为HiScribe

八、WNV基因组RNA转染BHK-21细胞：

将幼仓鼠肾细胞系BHK-21细胞接种于24孔板，培养基用含10％胎牛血清的DMEM(Thermo Fisher公司产品)，次日细胞密度约80-90％时，将制备的WNV基因组RNA转染细胞，转染试剂用Lipofectamine

九、病毒测序：

对上述WNV RNA转染BHK-21细胞培养液中的病毒进行测序鉴定，用Trizol Regent(Thermo Fisher公司产品)抽提培养液中的RNA，进行二代测序，获得WNV基因组全序列，结果显示：除2352nt为G以外，其余与WNV原始序列相同，不含哺乳动物内含子序列，表明该感染性克隆的构建方案达到其初始目的，即通过插入内含子序列获得了含WNV全长基因组、能在大肠杆菌中稳定复制的质粒，用该质粒为模板能制备出WNV，且WNV基因组中的内含子序列被剪切，而WNV基因组中第2352nt A→G突变不改变其编码的氨基酸残基。

十、Vero E6细胞感染：

将非洲绿猴细胞系Vero E6细胞接种于96孔板，培养基用含10％胎牛血清的DMEM，体积100μl。次日细胞密度约80-90％时，将收集的WNV RNA转染的BHK-21细胞培养液以三倍连续梯度稀释，加入Vero E6细胞培养孔中，每孔100μl。18小时以后，细胞用免疫荧光法检测WNV核心蛋白的表达。

十一、免疫荧光检测Vero E6细胞中的WNV核心蛋白：

吸除Vero E6细胞培养板中的培养液，每孔加100μl甲醇，将培养板至于-20℃冰箱，20分钟后，取出培养板，吸除甲醇，每孔以磷酸盐缓冲液(PBS)洗孔一次，随后加入100μl含3％牛血清白蛋白(BSA)的PBS(以下简称3％BSA-PBS)，置于水平摇床上，室温缓慢摇1小时，吸除培养板中的3％BSA-PBS，每孔加100μl含抗WNV核心蛋白多克隆抗体(Sigma-Aldirch公司产品)的1％BSA-PBS(抗体1000倍稀释)，室温缓慢摇1小时，吸除培养板中的抗体工作液，每孔以PBS洗3次，随后加入100μl含荧光素Alexa Fluor 488-标记的抗兔IgG(Thermo Fisher公司产品)的1％BSA-PBS(荧光素抗体1500倍稀释)，室温避光缓慢摇1小时，吸除培养板中的荧光素抗体工作液，每孔加入DAPI细胞核染色液100μl，室温避光缓慢摇10分钟，吸除培养板中的DAPI细胞核染色液，每孔以PBS洗3次，用细胞成像及分析系统(BioTek Cytation 5 Imaging Reader)对每孔细胞的荧光分布进行拍照，并计数绿色荧光阳性细胞，计算感染细胞的病毒滴度，即每毫升BHK-21细胞培养液感染Vero E6细胞的数量FFU(focus-forming unit，灶形成单位)。

在荧光显微镜下观察可见：WNV RNA转染的BHK-21细胞培养液感染的Vero E6细胞中可见绿色荧光分布(绿色荧光素标记的二抗)，而对照细胞内未见绿色荧光(图4)，表明RNA转染的BHK-21细胞培养液感染的Vero E6细胞可表达WNV核心蛋白，表明RNA转染的BHK-21细胞培养液中存在感染性的WNV。通过荧光细胞计数、分析，病毒滴度达10

十二、小鼠感染实验：

6周龄、雌性C57B/6小鼠，共12只，分为两组。病毒感染组腹腔注射WNV(即WNV RNA转染的BHK-21细胞培养液)，剂量1*10

结果显示：小鼠腹腔注射WNV以后的第四天，出现行动迟缓、弓背、竖毛等发病症状，第7天开始死亡。对照组小鼠未出现发病症状。免疫荧光检测脑组织中的WNV核心蛋白，在荧光显微镜下可见病毒感染小鼠脑组织中分布有红色荧光(红色荧光素标记的二抗)，不同位置的荧光强度有所不同，而对照组小鼠脑组织中无红色荧光(图5)，表明WNV感染小鼠并侵入了小鼠大脑。至感染后第11天，WNV感染的小鼠全部死亡，而对照组未处死的小鼠全部存活。

上述在细胞和小鼠的实验结果均表明，本发明利用基因重组技术，构建成功了一种用大肠杆菌扩增、遗传稳定的西尼罗病毒全长感染性克隆，利用该克隆作为模板转录出RNA，将RNA转染BHK-21细胞，可制备出西尼罗病毒，体外可感染Vero E6细胞，体内可感染小鼠，在小鼠脑组织中复制，引起小鼠死亡。为开展西尼罗病毒感染与致病机制研究以及检测技术与疫苗和药物研发提供了一种重要且方便的工具。

以上显示和描述了本发明的主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等同物界定。

序列表

<110> 中国人民解放军海军军医大学

<120> 一株西尼罗病毒感染性克隆的构建及其应用

<160> 7

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 11029

<212> DNA

<213> Artificial

<400> 1

agtagttcgc ctgtgtgagc tgacaaactt agtagtgttt gtgaggatta acaacaatta 60

acacagtgcg agctgtttct tagcacgaag atctcgatgt ctaagaaacc aggagggccc 120

ggcaagagcc gggctgtcaa tatgctaaaa cgcggaatgc cccgcgtgtt gtccttgatt 180

ggactgaaga gggctatgtt gagcctgatc gacggcaagg ggccaatacg atttgtgttg 240

gctctcttgg cgttcttcag gttcacagca attgctccga cccgagcagt gctggatcga 300

tggagaggtg tgaacaaaca aacagcgatg aaacaccttc tgagttttaa gaaggaacta 360

gggaccttga ccagtgctat caatcggcgg agctcaaaac aaaagaaaag aggaggaaag 420

accggaattg cagtcatgat tggcctgatc gccagcgtag gagcagttac cctctctaac 480

ttccaaggga aggtgatgat gacggtaaat gctactgacg tcacagatgt catcacgatt 540

ccaacagctg ctggaaagaa cctatgcatt gtcagagcaa tggatgtggg atacatgtgc 600

gatgatacta tcacttatga atgcccagtg ctgtcggctg gtaatgatcc agaagacatc 660

gactgttggt gcacaaagtc agcagtctac gtcaggtatg gaagatgcac caagacacgc 720

cactcaagac gcagtcggag gtcactgaca gtgcagacac acggagaaag cactctagcg 780

aacaagaagg gggcttggat ggacagcacc aaggccacaa ggtatttggt aaaaacagaa 840

tcatggatct tgaggaaccc tggatatgcc ctggtggcag ccgtcattgg ttggatgctt 900

gggagcaaca ccatgcagag agttgtgttt gtcgtgctat tgcttttggt ggccccagct 960

tacagcttca actgccttgg aatgagcaac agagacttct tggaaggagt gtctggagca 1020

acatgggtgg atttggttct cgaaggcgac agctgcgtga ctatcatgtc taaggacaag 1080

cctaccatcg atgtgaagat gatgaatatg gaggcggcca acctggcaga ggtccgcagt 1140

tattgctatt tggctaccgt cagcgatctc tccaccaaag ctgcgtgccc gaccatggga 1200

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gtggccattt ttgtccatgg accaactact gtggagtcgc acggaaacta ctccacacag 1440

gttggagcca ctcaggcagg gagattcagc atcactcctg cggcgccttc atacacacta 1500

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aatgcatact acgtgatgac tgttggaaca aagacgttct tggtccatcg tgagtggttc 1620

atggacctca acctcccttg gagcagtgct ggaagtactg tgtggaggaa cagagagacg 1680

ttaatggagt ttgaggaacc acacgccacg aagcagtctg tgatagcatt gggctcacaa 1740

gagggagctc tgcatcaagc tttggctgga gccattcctg tggaattttc aagcaacact 1800

gtcaagttga cgtcgggtca tttgaagtgt agagtgaaga tggaaaaatt gcagttgaag 1860

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aagtcagcac ctaaacgcct caccgccacc acggaaaaat tggaaattgg ctggaaggcc 2820

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tttggatttg gtctcaccag cactcggatg ttcctgaagg tcagagagag caacacaact 3000

gaatgtgact cgaagatcat tggaacggct gtcaagaaca acttggcgat ccacagtgac 3060

ctgtcctatt ggattgaaag caggctcaat gatacgtgga agcttgaaag ggcagttctg 3120

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gagagtgact tgataatacc agtcacactg gcgggaccac gaagcaatca caatcggaga 3240

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gattactgcc caggaactac ggtcaccctg agtgagagct gcggacaccg tggacctgcc 3360

actcgcacca ccacagagag cggaaagttg ataacagatt ggtgctgcag gagctgcacc 3420

ttaccaccac tgcgctacca aactgacagc ggctgttggt atggtatgga gatcagacca 3480

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aagaggtgga cagccaagat cagcatgcca gctatactga ttgctctgct agtcctggtg 3660

tttgggggca ttacttacac tgatgtgtta cgctatgtca tcttggtggg ggcagctttc 3720

gcagaatcta attcgggagg agacgtggta cacttggcgc tcatggcgac cttcaagata 3780

caaccagtgt ttatggtggc atcgtttctc aaagcgagat ggaccaacca ggagaacatt 3840

ttgttgatgt tggcggctgt tttctttcaa atggcttatc acgatgcccg ccaaattctg 3900

ctctgggaga tccctgatgt gttgaattca ctggcggtag cttggatgat actgagagcc 3960

ataacattca caacgacatc aaacgtggtt gttccgctgc tagccctgct aacacccggg 4020

ctgagatgct tgaatctgga tgtgtacagg atactgctgt tgatggtcgg aataggcagc 4080

ttgatcaggg agaagaggag tgcagctgca aaaaagaaag gagcaagtct gctatgcttg 4140

gctctagcct caacaggact tttcaacccc atgatccttg ctgctggact gattacatgt 4200

gatcccaacc gtaaacgcgg atggcccgca actgaagtga tgacagctgt cggcctgatg 4260

tttgccatcg tcggagggct ggcagagctt gacattgact ccatggccat tccaatgact 4320

atcgcggggc tcatgtttgc tgctttcgtg atttctggga aatcaacaga tatgtggatt 4380

gagagaacgg cggacatttc ctgggaaagt gatgcagaaa ttacaggctc gagcgaaaga 4440

gttgatgtgc ggcttgatga tgatggaaac ttccagctca tgaatgatcc aggagcacct 4500

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atcttgccct cagtagttgg attttggata actctccaat acacaaagag aggaggcgtg 4620

ttgtgggaca ctccctcacc aaaggagtac aaaaaggggg acacgaccac cggcgtctac 4680

aggatcatga ctcgtgggct gctcggcagt tatcaagcag gagcgggcgt gatggttgaa 4740

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cgcctggacc catactgggg cagtgtcaag gaggatcgac tttgttacgg aggaccctgg 4860

aaattgcagc acaagtggaa cgggcaggat gaggtgcaga tgattgtggt ggaacctggc 4920

aagaacgtta agaacgtcca gacgaaacca ggggtgttca aaacacctga aggagaaatc 4980

ggggccgtga ctttggactt ccccactgga acatcaggct caccaatagt ggacaaaaac 5040

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ctgggagaac catctgcagt gacagcagct agtgccgccc agagacgtgg acgtatcggt 6000

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ccatatagaa cctggaacta tcacggcagt tatgatgtga agcccacagg ctccgccagt 8640

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<210> 2

<211> 2534

<212> DNA

<213> Artificial

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gtcgactaat acgactcact atagagtagt tcgcctgtgt gagctgacaa acttagtagt 60

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attggactga ggcacgaatc atgctggaca acatcaacat gccaaacgga ctgatcgctc 360

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caacaactgc catcggactc tgccacatca tgcgtggggg ttggttgtca tgtctatcca 1860

taacatggac actcataaag aacatggaaa aaccaggact aaaaagaggt ggggcaaaag 1920

gacgcacctt gggagaggtt tggaaagaaa gactcaacca gatgacaaaa gaagagttca 1980

ctaggtaccg caaagaggcc atcatcgaag tcgatcgctc agcagcaaaa cacgccagga 2040

aagaaggcaa tgtcactgga gggcatccag tctctagggg cacagcaaaa ctgagatggc 2100

tggtcgaacg gaggtttctc gaaccggtcg gaaaagtgat tgaccttgga tgtggaagag 2160

gcggttggtg ttactatatg gcaacccaaa aaagagtcca agaagtcaga gggtacacaa 2220

agggcggtcc cggacatgaa gagccccaac tagtgcaaag ttatggatgg aacattgtca 2280

ccatgaagag tggggtggat gtgttctaca gaccttctga gtgttgtgac accctccttt 2340

gtgacatcgg agagtcctcg tcaagtgctg aggttgaaga gcataggacg attcgggtcc 2400

ttgaaatggt tgaggactgg ctgcaccgag ggccaaggga attttgcgtg aaggtgctct 2460

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gactggtcag aaacccactc tcacggaatt ccacgcacga gatgtattgg gtgagtcgag 2580

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aaaaaaggac ctggaaggga ccccaatacg aggaagatgt aaacttggga agtggaacca 2700

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ggaactatca cggcagttat gatgtgaagc ccacaggctc cgccagttcg ctggtcaatg 2880

gagtggtcag gctcctctca aaaccatggg acaccatcac gaatgttacc accatggcca 2940

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cgtttttggc cagagaaaaa cgtcccagaa tgtgctctcg agactgggat cc 3112

<210> 5

<211> 2172

<212> DNA

<213> Artificial

<400> 5

tctagactcg agaggaattc ataagaaagg tcaacagcaa tgcagctttg ggtgccatgt 60

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ccatttggtt catgtggctc ggagctcgct ttctggagtt cgaggctctg ggttttctca 300

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