一种胶体金、乳胶微球标记联合的星状病毒免疫层析检测试剂盒及制备方法

技术领域

本发明涉及体外诊断技术领域，具体的说，涉及一种胶体金、乳胶微球标记联合的星状病毒免疫层析检测试剂盒及制备方法。

背景技术

1971年Faulk和Taytor将胶体金引入免疫化学领域，此后免疫胶体金技术作为一种新的免疫学方法，在生物医学各领域得到了日益广泛的应用。胶体金是由氯金酸（HAuCl4）在还原剂如白磷、抗坏血酸、枸橼酸钠、鞣酸作用下，聚合成为特定大小的金颗粒，并通过静电作用成为一种稳定的胶体状态，成为胶体金。胶体金在弱碱环境下带负电荷，能够与蛋白质分子的正电荷基团形成牢固的结合，由于这种结合是静电结合，所以不影响蛋白质的生物特性。胶体金颜色比较明显，肉眼即可辨别，无需任何仪器。因此胶体金技术具有操作简单，检测迅速等优点，但在检测临界样本时，胶体金法检测结果不稳定，限制了其应用。

乳胶微球在免疫检测的使用历史比胶体金要早很多，在上个世纪60年代，Singer和 Plotz在检测人血清中类风湿因子项目中就用到了乳胶，随着技术的不断更新和后期对微球工艺的改进，现如今可以合成各类具有独特性能的微球，如彩色、荧光和磁性等胶乳微球。乳胶微球又名聚苯乙烯微球，其基本粒子尺寸在100-1000nm之间，表面功能化聚合物微球由于表面羧基、氨基或者羟基等活性基团的存在而易于与酶、蛋白质、核酸等结合反应，比胶体金的吸附标记更加牢固稳定，可提高产品的检测灵敏度。

人星状病毒（Human astrovius，HAstV）属于星状病毒科哺乳动物属。星状病毒科可引起幼小动物产生腹泻症状，1975年Madeley首次在电镜下观察到星状病毒，由于病毒颗粒表面有5~6个星状突起，故而得名。星状病毒颗粒直径为28~41nm，当病毒存在于高pH值环境下，其表现为典型的星状形态。

星状病毒发现的最初10年里，主要用电镜进行观察检测，因仅有10%的星状病毒具有典型的星形外观，故敏感性较低且无法进一步分型。随着免疫学方法在实验室诊断中的应用，出现免疫电镜法（GEM）、放射免疫法（RIA）、免疫荧光法（QFA）、酶免疫法（EIA）等，亟需寻找一种快速方便的诊断试剂，能够及时有效地诊断星状病毒感染。

发明内容

本发明的目的在于提供一种胶体金、乳胶微球标记联合的星状病毒免疫层析检测试剂盒及制备方法，提高了试剂灵敏度，增加了检出率，结果判断速度快，10min内即可观察结果；同时，克服了检测临界样本时胶体金法检测结果不稳定的缺陷，操作简单，无需专业人员，无需仪器，在基层检测能够广泛应用。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：一种胶体金、乳胶微球标记联合的星状病毒免疫层析检测试剂盒的制备方法，其特征在于：包括如下步骤：

S1、胶体金垫的制备：配制金重悬液，金重悬液为包含质量百分数0.5%的PEG20000、质量百分数0.15%的Tween-20、质量百分数15%的蔗糖、质量百分数5%的海藻糖的pH8.0的Tris-HCL缓冲液，用金重悬液将胶体金颗粒标记的星状病毒单克隆抗体2进行稀释后，即得胶体金标记溶液，喷涂于结合垫上，得到胶体金垫；

S2：乳胶垫的制备：配制乳胶重悬液，乳胶重悬液为包含质量百分数0.6%的PEG20000、质量百分数0.4%的Tween-20、质量百分数20%的蔗糖、质量百分数5%的海藻糖的pH8.0的Tris-HCL缓冲液，用乳胶重悬液将乳胶微球标记的星状病毒单克隆抗体2进行稀释后，即得乳胶标记溶液，喷涂于结合垫上，得到乳胶垫；

S3、硝酸纤维素膜的制备：将星状病毒单克隆抗体1用稀释液稀释至1.2mg/mL，作为检测线液体；将羊抗鼠单克隆抗体用稀释液稀释至1.5mg/mL，作为质控线液体，分别用划膜仪喷于硝酸纤维素膜上；

S4、样品垫的制备：首先，配制处理液，处理液为包含质量百分数0.5%的PEG20000、质量百分数0.2%的Tween-20、质量百分数0.05%的表面活性剂S9、质量百分数0.8%的封闭剂酪蛋白的100mmol/L pH9.0的Tris-HCL缓冲液；其次，将处理液涂布于玻璃纤维上，得到样品垫；

S5、试纸条的制备：在底板上从左到右依次搭接步骤S4中的样品垫、步骤S2中的乳胶垫、步骤S1中的胶体金垫、步骤S3中的硝酸纤维素膜、吸水纸，即得试纸条；

S6、将试纸条放入壳体中得检测卡，试剂盒包括检测卡和带有样本稀释液的大便管。

作为一种优化方案，步骤S1中胶体金颗粒标记星状病毒单克隆抗体2的制备方法包括如下步骤：

（1）用种子生长法制备胶体金溶液，制备的胶体金粒径为40nm，包括以下步骤：

A、取1.5mL的1.0×10

B、取30mL的1.0×10

（2）用步骤（1）制得的胶体金溶液标记星状病毒单克隆抗体2，包括以下步骤：

取步骤（1）中所得胶体金溶液100mL，调节pH值至8.0，加入星状病毒单克隆抗体22.0mg，再加入质量百分数20％的牛血清白蛋白溶液1mL，离心，弃去上清液，得沉淀物，加入金重悬液10mL，即得胶体金颗粒标记星状病毒单克隆抗体2。

作为一种优化方案，步骤S2中乳胶微球标记星状病毒单克隆抗体2的制备方法包括如下步骤：

（1）取乳胶微球悬浊液1.5mL，加入干净离心管中，以10000rmp离心8min，弃上清，得乳胶微球；

（2）加入100µL乳胶缓冲液洗涤乳胶微球，以12000rmp离心8min，弃上清，共洗两次；

（3）再次加100µL乳胶缓冲液；

（4）将步骤（3）中溶液超声处理60s，制得活化后的乳胶微球悬浊液；

（5）分别称取1-乙基-3（3-二甲氨丙基）碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺各10mg，分别装于两个干净离心管中；

（6）分别在步骤（5）所述两个离心管中加入去离子水配成浓度为60mg/mL的溶液，分别从两个离心管中各取15µL溶液加入活化后的乳胶微球悬浊液中，避光反应30min；

（7）将步骤（6）中溶液以12000rmp离心8min，弃上清，得到活化后的乳胶微球；

（8）加入600µL乳胶缓冲液洗涤活化后的乳胶微球，以12000rmp离心6min，弃上清，共洗两次；

（9）再次加入600µL乳胶缓冲液，震荡混匀备用；

（10）用乳胶缓冲液将星状病毒单克隆抗体2配成终浓度为100µg/mL的溶液600µL；

（11）将步骤（10）中配好的600µL溶液加入步骤（9）所得溶液中；

（12）将步骤（11）所得溶液置于水平振荡器上，室温，避光，振荡两小时；

（13）用包含质量百分数1%BSA的10mM pH7.2的PBS缓冲液洗涤步骤（12）所得溶液两次；

（14）用包含质量百分数1%BSA的10mM pH7.2的PBS缓冲液重悬步骤（13）所得溶液，即得乳胶微球标记星状病毒单克隆抗体2。

作为一种优化方案，所述样本稀释液为包含质量百分数0.5%BSA的10mM的磷酸盐缓冲液。

作为一种优化方案，所述稀释液包括0.015mol/mL的PBS和质量百分数0.2%的蔗糖。

作为一种优化方案，所述乳胶缓冲液为包含0.001M EDTA pH6.7的0.05M MES缓冲液。

作为一种优化方案，将步骤S1中的胶体金垫和步骤S2中的乳胶垫置于37±2℃烘箱中干燥12小时。

作为一种优化方案，在步骤S3中，将制得的包被有星状病毒单克隆抗体1和羊抗鼠单克隆抗体的硝酸纤维素膜置于37℃烘箱中干燥4小时。

作为一种优化方案，所述胶体金垫上固相的星状病毒单克隆抗体2的浓度为20μg/mL；乳胶垫上包被的星状病毒单克隆抗体2的浓度为15μg/mL。

一种胶体金、乳胶微球标记联合的星状病毒免疫层析检测试剂盒的制备方法制备的试剂盒，所述胶体金垫和乳胶垫的外侧设有白贴，壳体上表面设有加样孔和观察窗。

本发明采取以上技术方案，具有以下优点：

1、采用胶体金、乳胶微球融合标记的形式，通过“不同标记联合使用”的方式制备胶体金垫及乳胶垫，相比单一标记单抗技术，最大限度地提高试剂灵敏度，增加检出率，结果判断速度快，10min内即可观察结果；

2、克服了检测临界样本时胶体金法检测结果不稳定的缺陷，能够明显提高检测试剂临界显色的稳定性，检测线质控线显色更鲜亮；

3、本发明操作简单，无需专业人员，无需仪器，在基层检测能够广泛应用。

下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步说明。

附图说明

图1为本发明一种胶体金、乳胶微球标记联合的星状病毒免疫层析检测试剂盒中检测卡的结构示意图；

图2为本发明一种胶体金、乳胶微球标记联合的星状病毒免疫层析检测试剂盒中试纸条的结构示意图。

图中，

1-样品垫，2-白贴，3-检测线，4-质控线，5-吸水纸，6-硝酸纤维素膜，7-胶体金垫，8-乳胶垫，9-底板，10-壳体，11-加样孔，12-观察窗。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，实施例中未注明具体条件，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市场购买获得的常规产品。

所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例，基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1：

如图1-2所示，一种胶体金、乳胶微球标记联合的星状病毒免疫层析检测试剂盒，包括检测卡和带有样本稀释液的大便管，检测卡包括壳体10和试纸条，试纸条包括底板9，底板9上从左到右依次搭接有样品垫1、乳胶垫8、胶体金垫7、硝酸纤维素膜6和吸水纸5，硝酸纤维素膜6粘贴在底板9的中间位置，硝酸纤维素膜6的一侧粘贴吸水纸5，硝酸纤维素膜6的另一侧依次粘贴胶体金垫7、乳胶垫8及样品垫1，样品垫1一端压住乳胶垫8一端1.5mm，乳胶垫8一端压住胶体金垫7一端1.5mm，胶体金垫7另一端压住硝酸纤维素膜6一端1mm，吸水纸5的一端压住硝酸纤维素膜6另一端2.0mm，胶体金垫7和乳胶垫8的外侧设有白贴2。

胶体金垫7上固相有胶体金颗粒标记的星状病毒单克隆抗体2，乳胶垫8上固相有乳胶微球标记的星状病毒单克隆抗体2，硝酸纤维素膜6上包被有星状病毒单克隆抗体1作为检测线3，以及包被有羊抗鼠单克隆抗体作为质控线4，胶体金垫7上固相的星状病毒单克隆抗体2的浓度为20μg/mL；乳胶垫8上包被的星状病毒单克隆抗体2的浓度为15μg/mL；检测线3上星状病毒单克隆抗体1的浓度为1.2mg/mL；质控线4上羊抗鼠单克隆抗体的浓度为1.5mg/mL。

试纸条设置在壳体10内部，壳体10上表面设有加样孔11和观察窗12，加样孔11的位置对应样品垫1所在的位置，使待测样品能滴加到样品垫1上。

一种胶体金、乳胶微球标记联合的星状病毒免疫层析检测试剂盒的制备方法，其特征在于：包括如下步骤：

S1、胶体金垫的制备：配制金重悬液，金重悬液为包含质量百分数0.5%的PEG20000、质量百分数0.15%的Tween-20、质量百分数15%的蔗糖、质量百分数5%的海藻糖的pH8.0的Tris-HCL缓冲液，用金重悬液将胶体金颗粒标记的星状病毒单克隆抗体2进行稀释后，即得胶体金标记溶液，喷涂于结合垫上，得到胶体金垫；

S2：乳胶垫的制备：配制乳胶重悬液，乳胶重悬液为包含质量百分数0.6%的PEG20000、质量百分数0.4%的Tween-20、质量百分数20%的蔗糖、质量百分数5%的海藻糖的pH8.0的Tris-HCL缓冲液，用乳胶重悬液将乳胶微球标记的星状病毒单克隆抗体2进行稀释后，即得乳胶标记溶液，喷涂于结合垫上，得到乳胶垫；

S3、硝酸纤维素膜的制备：将星状病毒单克隆抗体1用稀释液稀释至1.2mg/mL，作为检测线液体；将羊抗鼠单克隆抗体用稀释液稀释至1.5mg/mL，作为质控线液体，分别用划膜仪喷于硝酸纤维素膜上；

S4、样品垫的制备：首先，配制处理液，处理液为包含质量百分数0.5%的PEG20000、质量百分数0.2%的Tween-20、质量百分数0.05%的表面活性剂S9、质量百分数0.8%的封闭剂酪蛋白的100mmol/L pH9.0的Tris-HCL缓冲液；其次，将处理液涂布于玻璃纤维上，得到样品垫；

S5、试纸条的制备：在底板上从左到右依次搭接步骤S4中的样品垫、步骤S2中的乳胶垫、步骤S1中的胶体金垫、步骤S3中的硝酸纤维素膜、吸水纸，即得试纸条；

S6、将试纸条放入壳体中得检测卡，试剂盒包括检测卡和带有样本稀释液的大便管。

所述样本稀释液为包含质量百分数0.5%BSA的10mM的磷酸盐缓冲液。

所述稀释液包括0.015mol/mL的PBS和质量百分数0.2%的蔗糖。

步骤S1中胶体金颗粒标记星状病毒单克隆抗体2的制备方法包括如下步骤：

（1）用种子生长法制备胶体金溶液，制备的胶体金粒径为40nm，包括以下步骤：

A、取1.5mL的1.0×10

B、取30mL的1.0×10

（2）用步骤（1）制得的胶体金溶液标记星状病毒单克隆抗体2，包括以下步骤：

取步骤（1）中所得胶体金溶液100mL，调节pH值至8.0，加入星状病毒单克隆抗体22.0mg，再加入质量百分数20％的牛血清白蛋白溶液1mL，离心，弃去上清液，得沉淀物，加入金重悬液10mL，即得胶体金颗粒标记星状病毒单克隆抗体2。

步骤S2中乳胶微球标记星状病毒单克隆抗体2的制备方法包括如下步骤：

（1）取乳胶微球悬浊液1.5mL，加入干净离心管中，以10000rmp离心8min，弃上清，得乳胶微球；

所述乳胶微球悬浊液购自美国Magsphere公司。

（2）加入100µL乳胶缓冲液洗涤乳胶微球，以12000rmp离心8min，弃上清，共洗两次；

（3）再次加100µL乳胶缓冲液；

（4）将步骤（3）中溶液超声处理60s，制得活化后的乳胶微球悬浊液；

（5）分别称取1-乙基-3（3-二甲氨丙基）碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺各10mg，分别装于两个干净离心管中；

（6）分别在步骤（5）所述两个离心管中加入去离子水配成浓度为60mg/mL的溶液，分别从两个离心管中各取15µL溶液加入活化后的乳胶微球悬浊液中，避光反应30min；

（7）将步骤（6）中溶液以12000rmp离心8min，弃上清，得到活化后的乳胶微球；

（8）加入600µL乳胶缓冲液洗涤活化后的乳胶微球，以12000rmp离心6min，弃上清，共洗两次；

（9）再次加入600µL乳胶缓冲液，震荡混匀备用；

（10）用乳胶缓冲液将星状病毒单克隆抗体2配成终浓度为100µg/mL的溶液600µL；

（11）将步骤（10）中配好的600µL溶液加入步骤（9）所得溶液中；

（12）将步骤（11）所得溶液置于水平振荡器上，室温，避光，振荡两小时；

（13）用包含质量百分数1%BSA的10mM pH7.2的PBS缓冲液洗涤步骤（12）所得溶液两次；

（14）用包含质量百分数1%BSA的10mM pH7.2的PBS缓冲液重悬步骤（13）所得溶液，即得乳胶微球标记星状病毒单克隆抗体2，如需较长时间保存，用质量百分数0.05%的Proclin-300保存。

所述乳胶缓冲液为包含0.001M EDTA pH6.7的0.05M MES缓冲液。

将步骤S1中的胶体金垫和步骤S2中的乳胶垫置于37±2℃烘箱中干燥12小时。

在步骤S3中，将制得的包被有星状病毒单克隆抗体1和羊抗鼠单克隆抗体的硝酸纤维素膜置于37℃烘箱中干燥4小时。

实施例2：

一种胶体金、乳胶微球标记联合的星状病毒免疫层析检测试剂盒的检测方法，包括如下步骤：

（1）样本准备：采便勺在样本的三个不同位置取一平勺（约100mg），若为水样取两平勺（约100µL），放入采便管中，旋紧，震荡混匀，确保样本良好分散，静置，取上清液为检测液样本；

（2）检测：将检测液样本放置30分钟恢复至室温，滴加3滴（约100µL）到试剂盒的加样孔11中，5~10分钟读取结果，10分钟后无效；

（3）结果判断；

a、阳性（+）：质控线4、检测线3各出现一条红线。

b、阴性（-）：只有质控线4出现一条红线，检测线3位置无红线出现。

c、无效：质控线4位置无线条出现，说明操作失误或试剂失效。

实验

将实施例1用外购星状病毒重组抗原进行检测，在加样孔11加入不同浓度的星状病毒重组抗原，浓度分别为0.25ng/mL、0.5ng/mL、1ng/mL、2.5ng/mL、5ng/mL、10ng/mL、20ng/mL，每个浓度做3个平行，结果如下表：

备注：“+”代表阳性，“±”代表弱阳性，“-”代表阴性。

对比例：

与实施例1不同的是，实施例1中为胶体金垫与乳胶垫联合使用，对比例1仅为胶体金垫的使用，胶体金垫的制备方法如下：配制金重悬液，金重悬液为包含质量百分数0.5%的PEG20000、质量百分数0.15%的Tween-20、质量百分数15%的蔗糖、质量百分数5%的海藻糖的pH8.0的Tris-HCL缓冲液，用金重悬液将胶体金颗粒标记的星状病毒单克隆抗体2进行稀释后，喷涂于结合垫上，得到胶体金垫；

将对比例用外购星状病毒重组抗原进行检测，在加样区加入不同浓度的星状病毒重组抗原，浓度分别为0.25ng/mL、0.5ng/mL、1ng/mL、2.5ng/mL、5ng/mL、10ng/mL、20ng/mL，每个浓度做3个平行，结果如下表：

研究发现，相对于对比例，本发明实施例1中的试剂盒在实际检测应用中灵敏度更高。

本发明一种胶体金、乳胶微球标记联合的星状病毒免疫层析检测试剂盒与ELISA检测试剂盒（上市试剂盒）的符合率：

从临床中收集到100份大便样本：42例星状病毒阳性样本、58例星状病毒阴性样本，用本发明一种胶体金、乳胶微球标记联合的星状病毒免疫层析检测试剂盒与ELISA检测试剂盒同时检测，特异性、检出率如下表：

ELISA试剂盒需要配备专门的实验仪器，专业人员操作，只能在条件允许的实验室开展检测，且单个检测成本较高，由上表可知，本发明一种胶体金、乳胶微球标记联合的星状病毒免疫层析检测试剂盒与ELISA检测试剂盒总符合率高达98%，说明本发明自检测结果符合率高，特异性好，结果稳定，可有效地诊断星状病毒感染，同时，本发明操作简单，无需专业人员，无需仪器，在基层检测能够广泛应用。

最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，实施方式的举例，其中未详细述及的部分均为本领域普通技术人员的公知常识，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。