一种编码高亲水性重组类人IV型胶原蛋白YS-hydro-col4的核苷酸及其应用

技术领域

本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种编码高亲水性重组类人IV型胶原蛋白YS-hydro-col4的核苷酸及其应用。

背景技术

胶原蛋白(Collagen)是一类生物高分子蛋白的总称，它是动物结缔组织的主要成分之一，也是哺乳动物体内含量最多和分布最广的功能性蛋白，占总蛋白质含量的25％-30％。比如，作为胶原蛋白其中一种类型的Ⅳ型胶原蛋白，其是构成基底膜的重要成分，也就是位于表皮和真皮边界处的膜附近。Ⅳ型胶原蛋白能为皮肤提供稳固的真一表皮连接，保证皮肤的机械完整性，同时调控并作为配体信号传递介质与细胞受体如整合素结合，从而影响细胞的增生、迁移及分化，并以同样的方式影响表皮基底层角质形成细胞的极性向上迁移分化过程。因此它在体内起到一个至关重要的作用，例如皮肤肿瘤浸润、转移首先需要突破基底膜带；而在肝病中，随炎症发展，纤维组织增生活跃，纤维组织生成过程中有大量胶原沉积，各种胶原均有所增加，但其中最为重要的就是构成基底膜的Ⅳ型胶原的增加。

胶原蛋白或Ⅳ型胶原蛋白独特的生物构造，以及其良好的生物兼容性、可降解性和低抗原性，在近年来被广泛运用到生物医学、化妆品、保健品或食品等生产生活的多个领域。比如，目前Ⅳ型胶原蛋白可以用于固化酶的膜材料和肉食品标签、作为食品粘合剂合成纤维膜与食品保护层、抗氧化保持食品颜色的鲜亮等方面，还比如能改善肉制品的嫩度、含水性和柔软度；除此之外，其还有可能具有制备人造基底膜潜在用途等。

因此，挖掘或设计一种可以编码高亲水性IV型类胶原蛋白的核苷酸具有重大意义。

发明内容

针对以上问题，本发明目的之一在于提供一种可以编码一种亲水性比较高的重组类人IV型胶原蛋白YS-hydro-col4的核苷酸，该核苷酸编码得到的高亲水性重组类人IV型胶原蛋白YS-hydro-col4是对重组人源IV型胶原蛋白进行改造而得，得到的高亲水性重组类人IV型胶原蛋白YS-hydro-col4亲水性测试中的接触角可以低至约24°，亲水性良好，较未改造的重组人源IV型胶原蛋白的接触角(约47°)明显降低，亲水性明显提高。

为了达到上述目的，可以采用以下技术方案：

本发明一方面提供一种编码高亲水性重组类人IV型胶原蛋白YS-hydro-col4的核苷酸，高亲水性重组类人IV型胶原蛋白YS-hydro-col4包含如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列。

本发明另一方面提供一种重组表达载体或基因表达试剂盒，包含上述的核苷酸。

本发明再一方面提供一种工程菌，包含上述的核苷酸或上述的重组表达载体。

本发明再一方面提供一种上述的重组表达或上述的工程菌在制备高亲水性重组类人IV型胶原蛋白YS-hydro-col4中的应用。

本发明再一方面提供一种高亲水性重组类人IV型胶原蛋白YS-hydro-col4，包含如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列。

本发明再一方面提供一种组合物，包含高亲水性重组类人IV型胶原蛋白YS-hydro-col4，高亲水性重组类人IV型胶原蛋白YS-hydro-col4包含如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列。

本发明再一方面提供一种制剂，包含上述的高亲水性重组类人IV型胶原蛋白YS-hydro-col4或上述的组合物。

本发明再一方面提供一种上述的高亲水性重组类人IV型胶原蛋白YS-hydro-col4、上述的核苷酸、上述的重组表达载体、上述的工程菌或上述的组合物在制备制剂中的应用，制剂包括药物、医疗器材、生物材料、组织工程产品、化妆品或保健品。

本发明有益效果包括：本发明提供的可以编码一种亲水性比较高的重组类人IV型胶原蛋白YS-hydro-col4的核苷酸，该核苷酸编码得到的高亲水性重组类人IV型胶原蛋白YS-hydro-col4亲水性测试中的接触角可以低至约24°，亲水性良好，较未改造的重组人源IV型胶原蛋白的接触角(约47°)明显降低，亲水性明显提高。

附图说明

图1为高亲水性重组类人IV型胶原蛋白YS-hydro-col4的SDS-PAGE检测结果；M为marker；

图2为高亲水性重组类人IV型胶原蛋白YS-hydro-col4与重组人源IV型胶原蛋白标准品的接触角实验结果图；横坐标为组别；纵坐标为接触角度数值。

具体实施方式

所举实施例是为了更好地对本发明进行说明，但并不是本发明的内容仅局限于所举实施例。所以熟悉本领域的技术人员根据上述发明内容对实施方案进行非本质的改进和调整，仍属于本发明的保护范围。

本文中使用的术语仅用于描述特定实施例，并且无意于限制本公开。除非在上下文中具有明显不同的含义，否则单数形式的表达包括复数形式的表达。如本文所使用的，应当理解，诸如“包括”、“具有”、“包含”之类的术语旨在指示特征、数字、操作、组件、零件、元件、材料或组合的存在。在说明书中公开了本发明的术语，并且不旨在排除可能存在或可以添加一个或多个其他特征、数字、操作、组件、部件、元件、材料或其组合的可能性。如在此使用的，根据情况，“/”可以被解释为“和”或“或”。

本发明实施例提供一种编码上述的高亲水性重组类人IV型胶原蛋白YS-hydro-col4的核苷酸，该高亲水性重组类人IV型胶原蛋白YS-hydro-col4包含如SEQ ID NO:1所示序列。需要说明的是，所有可以编码包含如SEQ ID NO:1所示序列的IV型高亲水性胶原蛋白的核苷酸均为本发明中的核苷酸。

在一些具体实施例中，上述编码上述的高亲水性重组类人IV型胶原蛋白YS-hydro-col4的核苷酸可以包括如SEQ ID NO:2所示序列，也可是包括将SEQ ID NO:2进行改造后的仍然可以编码上述IV型高亲水性胶原蛋白的核苷酸。

本发明另一实施例提供一种重组表达载体或基因表达试剂盒，包含上述的核苷酸。需要说明的是，可以将上述的编码高亲水性重组类人IV型胶原蛋白YS-hydro-col4的核苷酸装载在表达载体上形成重组表达载体用于上述核苷酸的表达，表达载体为本领域所已知的，比如pPIC9K载体；或者可以使用本领域所已知的基因表达试剂盒进行表达。

本发明再一实施例提供一种工程菌，包含上述的核苷酸或上述的重组表达载体。需要说明的是，可以将上述的重组表达载体通过工程菌进行表达，工程菌可以是克隆宿主菌或表达宿主菌；克隆宿主菌可以是大肠杆菌(Escherichia coli)DH5α菌株；表达宿主菌可以是巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)GS115。另外，重组表达载体导入工程菌的方法为本领域所已知的，比如可以通过电击转化法导入工程菌中。

本发明再一实施例提供一种上述的重组表达或基因表达试剂盒上述的工程菌在制备Ⅰ型高亲水性胶原蛋白中的应用，需要说明的是，高亲水性重组类人IV型胶原蛋白YS-hydro-col4可以通过重组表达或基因表达试剂盒以及工程菌制备得到。在一些具体实施例中，制备IV型高亲水性胶原蛋白的方法可以包括如下步骤：将高亲水性重组类人IV型胶原蛋白YS-hydro-col4的编码基因导入工程菌中，获得重组菌，培养重组菌，诱导蛋白表达，提取和纯化蛋白。在另外的一些具体实施例中，可构建重组载体pPIC9K-YS-hydro-col4(高亲水性重组类人IV型胶原蛋白YS-hydro-col4)，然后分别导入毕赤酵母GS115中，得到重组毕赤酵母Pichia-pPIC9K-YS-hydro-col4；培养Pichia-pPIC9K-YS-hydro-col4，向培养基中添加甲醇以诱导蛋白表达，然后收集上清液；可使用三氯乙酸沉淀法纯化所述上清液中的蛋白质，得到高亲水性重组类人IV型胶原蛋白YS-hydro-col4。

本发明再一实施例提供一种高亲水性重组类人IV型胶原蛋白YS-hydro-col4，其包含如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列。需要说明的是，该高亲水性重组类人IV型胶原蛋白YS-hydro-col4是对重组人源IV型胶原蛋白进行改造而得，其亲水性测试中的接触角可以低至约24°，亲水性良好，较未改造的重组人源IV型胶原蛋白的接触角(约47°)明显降低，亲水性明显提高。

本发明再一实施例提供一种组合物，其至少包含氨基酸序列包含如SEQ ID NO:1所示序列的高亲水性重组类人IV型胶原蛋白YS-hydro-col4。需要说明的是，可以本发明中的高亲水性重组类人IV型胶原蛋白YS-hydro-col4与其他胶原蛋白或其他药物活性成分联用组成组合物，协同增强功效。

本发明再一实施例提供一种制剂，包含上述的高亲水性重组类人IV型胶原蛋白YS-hydro-col4或上述的组合物。需要说明的是，可以将上述的高亲水性重组类人IV型胶原蛋白YS-hydro-col4或上述的组合物添加辅料制备成制剂。

在一些具体实施例中，制剂包括但不限于药物、医疗器材、生物材料、组织工程产品、化妆品或保健品。

需要说明的是，上述制剂的剂型可以是粉剂、片剂、颗粒剂、丸剂、乳剂、膏剂或溶液、凝胶。给药或者使用方式可以是口服、注射、滴注或外敷。

还需要说明的是，上述制剂可以是保湿抗皱或组织修复的化妆品，基于高亲水性重组类人IV型胶原蛋白YS-hydro-col4的亲水性，该化妆品可以具有良好保湿效果，使皮肤保持良好的亲水性，增加皮肤弹性，即可以提高滋润保湿和消皱美容的作用；上述制剂还可以是用于组织修复的药物，可以较好地保留了IV型类胶原蛋白皮肤支架，修复皮肤屏障等优点的同时，有助于增强伤口愈合的能力，即可以增强吸液、保液透湿功能，促进伤口愈合；上述制剂还可以是作为添加剂用在食品中，改善肉制品的嫩度、含水性和柔软度。

本发明再一实施例提供一种上述的高亲水性重组类人IV型胶原蛋白YS-hydro-col4、上述的核苷酸、上述的重组表达载体、上述的工程菌或上述的组合物在制备制剂中的应用，制剂包括药物、医疗器材、生物材料、组织工程产品、化妆品或保健品。需要说明的是，如上所述，基于高亲水性重组类人IV型胶原蛋白YS-hydro-col4的亲水性，可以将其及其核酸苷酸和表达载体及工程菌应用在药物、医疗器材、生物材料、组织工程产品、化妆品或保健品的制备中，提高药物、医疗器材、生物材料、组织工程产品、化妆品或保健品的品质。

为了更好地理解本发明，下面结合具体示例进一步阐明本发明的内容，但本发明的内容不仅仅局限于下面的示例。

以下实施例中，大肠杆菌DH5α感受态细胞购买自北京索莱宝科技有限公司；毕赤酵母GS115感受态细胞购买自Invitrogen公司。

以下实施例中，pPIC9K质粒是毕赤酵母表达载体，购买自Invitrogen公司，该质粒的启动子为AOX1，载体大小为9276bp，载体抗性为Ampicillin(氨苄青霉素)和Kanamycin(卡那霉素)。该质粒利用alpha因子分泌信号肽，分泌表达蛋白基因。

以下实施例中，使用的MD固体培养基、YPD固体培养基、BMGY培养基、BMMY培养基均为实验室配制得到，其配方如下：MD固体培养基：称取15g琼脂粉于860ml蒸馏水中，高压灭菌121度20min，冷却至60度左右，依次加入10×YNB 100ml、500×生物素2ml和50％葡萄糖40ml，混匀后迅速倒入灭菌的培养皿中；YPD固体培养基：称取蛋白胨20g、酵母抽提物10g和琼脂粉15g，溶于蒸馏水后定容至960ml，高压灭菌121度20min，冷却至60度左右，加入50％葡萄糖40ml，混匀后迅速倒入灭菌的培养皿中；BMGY培养基：蛋白胨20g、酵母抽提物10g，溶于780ml蒸馏水中，高压灭菌121度20min，待冷却至室温后，加入1M磷酸钾缓冲液(PH6.0)100ml、10×YNB 100ml、500×生物素2ml、50％甘油20ml；BMMY培养基：BMGY培养基中的甘油使用甲醇替换，其他同BMGY培养基。

以下实施例中，G418(Geneticin，遗传霉素)是一种氨基糖苷类抗生素，购买自上海麦克林生化科技有限公司。

以下实施例中，未特别说明的实验试剂均为本领域常规试剂，可按照本领域常规方法配制而得或从相关试剂供应商购买获得；未特别说明的实验方法，均为本领域常规方法，可参考相关实验手册，例如分子克隆实验手册或相关试剂生产商的说明书。

以下实施例中，重组人源IV型胶原蛋白标准品购买自Abcam公司。

实施例1高亲水性重组类人IV型胶原蛋白YS-hydro-col4的设计与表达

(1)YS-hydro-col4蛋白质设计

本发明实施例对重组人源IV型胶原蛋白标准品进行改造设计得到高亲水性重组类人IV型胶原蛋白YS-hydro-col4(以下也用YS-hydro-col4表示)，YS-hydro-col4的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，其全长1395个氨基酸。

(2)表达载体构建

(a)将YS-hydro-col4的氨基酸序列分别翻译为对应的DNA序列，Col4A1的编码基因序列如SEQ ID NO:2所示，其全长4185个碱基。在YS-hydro-col4的编码基因序列的5’端加上限制性内切酶SnaB I的识别序列(TACGTA)，3’端加上限制性内切酶Avr II的识别序列(CCTAGG)，得到YS-hydro-col4目的基因序列，委托生工生物工程(上海)股份有限公司对目的基因序列进行全基因合成。

(b)采用pPIC9K质粒作为表达载体，使用限制性内切酶SnaB I(Thermo FisherScientific)和Avr II(Thermo Fisher Scientific)分别对pPIC9K质粒和合成的目的基因进行双酶切反应。其中，酶切体系(20μl)：ddH

(c)分别回收酶切后的pPIC9K质粒和目的基因，使用T4 DNA连接酶(New EnglandBiolabs)通过连接反应将目的基因连接到pPIC9K载体中。其中，连接体系(20μl)：10×buffer 2μl、T4 DNA连接酶0.2μl，pPIC9K 3μl，目的基因1μl，ddH

(d)使用热激法将连接产物转入大肠杆菌DH5α克隆菌株中。转化方法如下：将大肠杆菌DH5α感受态细胞从-80℃冰箱中取出，冰浴5min。待感受态细胞的甘油融化后，将感受态细胞加入连接产物中，枪头吸放3-4次混匀，冰浴静置30min。用吸水纸迅速擦干管壁的水分，置于42℃热激90s，然后立即冰浴2min。在无菌条件下加入800μl的LB液体培养基，于37℃，150rpm培养45min。于8000rpm离心5min收集菌体，弃掉部分上清，用余下的100μl左右的上清重悬大肠杆菌，然后均匀地涂布在含有100μg/ml氨苄青霉素的LB固体培养基上，放入37℃恒温箱中，倒置培养10-16h。挑取单克隆接种于含有100μg/ml氨苄青霉素的液体LB培养基中，37℃培养10-16h后，将菌液送至生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序，鉴定阳性克隆。

(e)使用质粒提取试剂盒(Omega，D6943-01)按照试剂盒说明书提取序列正确的阳性克隆的质粒，得到重组质粒pPIC9K-YS-hydro-col4。

(3)毕赤酵母转化

(a)取20μg重组质粒(pPIC9K-YS-hydro-col4)，使用限制性内切酶Sac I(Promega)对重组质粒进行酶切；酶切体系(20μl)：ddH

(b)取15μl回收的线性化的重组质粒，同100μl毕赤酵母GS115感受态细胞于1.5mlEP管内混匀，然后转移至0.2cm电击转化杯内，冰上放置10min，放入电穿孔仪内进行电击转化；电击条件为：电压1.5kv，电容25μF，电阻200Ω，电击时间10ms。

(c)电击完成后取出电击转化杯，向电击转化杯中加入1ml冰上预冷的浓度为1M的山梨醇溶液，枪头轻轻吹打混匀。

(d)将电击转化杯内的液体转移至2ml EP管内，30℃摇床摇震40min；将全部液体涂布于MD固体培养基上，30℃恒温培养2d。

(e)用接种环挑取MD固体培养基上生长出的单菌落，接种至含有4.0mg/ml G418的YPD固体培养基上，30℃过夜培养，筛选阳性克隆，得到重组毕赤酵母Pichia-pPIC9K-YS-hydro-col4。

(4)蛋白表达与纯化

(a)挑取重组毕赤酵母(Pichia-pPIC9K-YS-hydro-col4)的单菌落，分别接种至装有50ml BMGY培养基的锥形瓶内，然后放入摇床中，于30℃，220rpm过夜培养至OD600＝1-2。

(b)转移菌液至离心管内，于室温下，3000g离心5min，去除上清，收集细胞。

(c)使用BMMY培养基菌液重悬细胞至OD600＝0.2-0.6；转移菌液至500ml锥形瓶内，于30℃，200rpm进行诱导表达，每24h向培养基内添加甲醇至终浓度为1％(v/v)。

(d)诱导表达结束后，于4℃，3000g离心20min，收集上清液，用于纯化蛋白。

(e)取等同于1/9上清液体积的浓度为100％的三氯乙酸(TCA)，加入上清液所在的离心管中，振荡混匀，于4℃沉淀过夜。

(f)于12000rpm离心10min，弃去上清，收集沉淀；将EP管倒置于吸水纸上，置于37℃烘箱中静置10min-20min，使管壁无明显液体残留。

(g)加入200μl冷丙醇，振荡混匀，室温下静置10min，洗去管壁和管底残留的TCA。

(h)重复步骤(6)和(7)，2-3次，得到纯化的蛋白质YS-hydro-col4。

(5)蛋白的SDS-PAGE检测

(a)配制SDS-PAGE蛋白电泳凝胶，其中分离胶的浓度为10％，浓缩胶的浓度为5％，其配方如下：分离胶10％：30％丙烯酰胺溶液3.3ml，ddH

(b)样品处理：取适量待测蛋白，加入Loading Buffer，震荡混匀，沸水煮5mim-10mim使蛋白变性，12000rpm离心10min，取上清，10μl上样。其中，电泳参数：恒压80V，进入分离胶后120V。

SDS-PAGE结果如图1所示，YS-hydro-col4的蛋白分子量约为95kDa与预期的蛋白质分子量相符。

实施例2亲水性试验

本发明实施例中对胶原纤维膜接触角进行测试，具体如下：

以乙酸水溶液作为溶剂，实施例1中的蛋白质Col4A1和PEO(聚氧化乙烯)为溶质配制总质量浓度7％的胶原蛋白溶液(其中，蛋白质YS-hydro-col4和PEO的质量比为90：10)，室温搅拌2h；将胶原蛋白溶液倒入带有金属喷头的10mL注射器中，把注射器固定在螺旋推进仪上并设置好参数，高压发生器正极接到注射器针头上，负极接到带有铝箔的支架上；在室温条件下，静电纺工艺参数：纺丝电压25Kv，接收距离为20cm，推进速率0.8mL/h，温度20℃，空气相对湿度50％以下；纺丝完成后将收集铝箔，并得到将胶原纤维膜。

将胶原纤维膜裁剪为长方形，采用视频接触角测定仪检测不同薄膜的接触角大小(接触角测试是评价物质亲疏水性的实验，接触角大小被看作评价亲疏水性程度的指标；若θ<90°，则固体表面是亲水性的，即液体较易润湿固体，其角越小，表示润湿性越好；若θ>90°，则固体表面是疏水性的，即液体不容易润湿固体，容易在表面上移动。)，将煮沸后冷却的蒸馏水，每次通过仪器自动滴加5μl至样品表面，内置数码相机记录水滴形态并记录与计算表面接触角大小，每种样品各测3个平行样，求平均值。

将重组人源IV型胶原蛋白保准品也按照上述方法进行亲水性测试。

蛋白质YS-hydro-col4和重组人源IV型胶原蛋白标准品的亲水性测试结果如图2所示，重组人源IV型胶原蛋白标准品(改造前)的接触角约为47°，而YS-hydro-col4(改造后)约为24°，与重组人源IV型胶原蛋白标准品相比，YS-hydro-col4的接触角减小，说明本发明高亲水性重组类人IV型胶原蛋白YS-hydro-col4的亲水性较重组人源IV型胶原蛋白标准品显著提高。

最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的宗旨和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围。