基于纳米金的等温扩增检测结核分枝杆菌的引物探针组、试剂盒、方法及应用

技术领域

本发明涉及生物检测技术领域，尤其涉及一种基于纳米金的等温扩增检测结核分枝杆菌的引物探针组、试剂盒、方法及应用。

背景技术

结核病诊断延迟及耐药性结核病是对全球结核病疾病控制的巨大威胁，活动性结核的早期诊断，特别是对结核分枝杆菌的检测是实施有效治疗及公共卫生干预措施的必要前提

目前，实验室诊断主要依赖涂片染色镜检法和结核分枝杆菌培养等传统实验室检验方法。涂片染色镜检法存在阳性率低、操作复杂、技术要求高等缺点，结核分枝杆菌培养亦存在污染率高、检测时间长等不足，致使全球近一半的结核病例不能通过实验室确认，诊断延迟

2006年，Baptista等人首次应用金纳米粒子检测结核分枝杆菌。该分析包括在存在不同DNA靶点的情况下，探究了金纳米粒子探针的差异稳定性。金纳米粒子探针与互补DNA靶点结合，阻碍了金纳米粒子的聚集，溶液保持红色或粉红色，而其缺失DNA靶点或非互补不匹配不会阻碍金纳米粒子探针聚集，导致可见颜色从红色变为蓝色或紫色。该方法使用带有巯基修饰的寡核苷酸功能化的金纳米粒子探针，用于临床样本中结核分枝杆菌的鉴定，结合PCR进行靶向扩增的方法显示出很高的灵敏度。但是PCR分析需要专业知识和高度复杂的环境，而且诊断成本过于昂贵

环介导等温扩增技术(Loop-mediated isothermal amplification，LAMP)是一种新型的核酸等温扩增技术

胶体金法检测结核分枝杆菌，是对人体血清中抗结核分枝杆菌IgG、IgM抗体进行检测，胶体金也称纳米金，在弱碱环境下带负电荷，可与蛋白质分子的正电荷基团形成牢固的结合，由于这种结合是静电结合，所以不影响蛋白质的生物特性。胶体金标记，实质上是蛋白质等高分子被吸附到胶体金颗粒表面的包被过程。吸附机理是胶体金颗粒表面负电荷，与蛋白质的正电荷基团因静电吸附而形成牢固结合。免疫金标记技术主要利用了金颗粒具有高电子密度的特性，当这些标记物在相应的配体处大量聚集时，肉眼可见红色或粉红色斑点，因而用于定性的快速免疫检测方法中。胶体金法对人体血清中抗结核分枝杆菌IgG、IgM抗体进行检测，灵敏度低，当体内血清中抗结核分枝杆菌IgG、IgM抗体含量较少时，不易检测到，容易漏检，且不能检测早期感染。

基层结核病防治中患者的早期诊断是防治的关键环节，为了能早期发现和准确诊断结核病，特别是广泛发现具有传染性的肺结核病患者，需要准确、快速、简便的实验检测技术发挥作用

参考文献

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发明内容

本发明提供了一种基于纳米金的等温扩增检测结核分枝杆菌的引物探针组、试剂盒、方法及应用，检测结果更直观，价格更低廉，可满足相对落后的基层地区和欠发达国家进行结核分枝杆菌的现场快速、高灵敏度、可视化检测，解决了现有技术中存在的问题。

本发明所采用的技术方案之一是：

一种基于纳米金的等温扩增检测结核分枝杆菌的引物探针组，包括外引物对F3和B3、内引物对FIP和BIP、环引物对LF和LB、以及金纳米粒子探针；

所述外引物对F3和B3的序列如SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示；

所述内引物对FIP和BIP的序列如SEQ ID No.3和SEQ ID No.4所示；

所述环引物对LF和LB的序列如SEQ ID No.5和SEQ ID No.6所示；

所述金纳米粒子探针为在一定粒径金纳米粒子上修饰与扩增靶标互补的一段反义寡核苷酸链的探针分子。

进一步地，所述金纳米粒子探针所用金纳米粒子尺寸为20nm，探针序列为5’-SH-TCTGTCCGGGACCACT-3’。

进一步地，所述金纳米粒子探针的制备包括如下步骤：

(1)准备直径为20nm的金纳米粒子，制备成金纳米粒子溶液，备用；

(2)探针序列：5’-SH-TCTGTCCGGGACCACT-3’，如SEQ ID No.7所示；

(3)合成金纳米粒子探针

将步骤(2)巯基修饰的寡核苷酸链与步骤(1)制得的金纳米粒子溶液进行孵育，按照物质的量浓度SH-DNA：AuNPs＝150:1混合修饰，即得。

进一步地，步骤(1)制备金纳米粒子溶液的操作为：

向三口圆底烧瓶中加入干净的搅拌磁子和142.5mL超纯水，加入1.5mL 1％氯金酸，同时加热至微沸腾；随后迅速加入6mL 1％柠檬酸钠，继续搅拌并保持微沸，溶液颜色随即变蓝，继续加热搅拌，溶液颜色由蓝变紫，最后变成红色，等溶液颜色稳定不再变化后，继续加热搅拌10min，待溶液降至室温，测定最大吸收峰在520nm，算得浓度为1nM，剩余转入离心管用锡箔纸包住避光，4℃保存。

本发明所采用的技术方案之二是：

一种基于纳米金的等温扩增检测结核分枝杆菌的试剂盒，包括如前所述的引物探针组。

进一步地，所述的基于纳米金的等温扩增检测结核分枝杆菌的试剂盒，还包括Buffer、dNTP、MgSO

本发明所采用的技术方案之三是：

一种基于纳米金的等温扩增检测结核分枝杆菌的方法，包括如下操作步骤：

(1)构建扩增体系

扩增体系包括如权利要求1或2的引物探针组、以及Buffer、dNTP、MgSO

(2)将上述扩增体系置于65℃恒温水浴锅中，反应40min，取出后加入一定体积的6M/L的NaCl溶液，10min内可观察到颜色变化；检测结果阳性为粉红色，阴性为透明色。

进一步地，步骤(2)中扩增体系和NaCl溶液用量均为25μL。

本发明所采用的技术方案之四是：

如前所述的引物探针组或试剂盒在检测结核分枝杆菌中的应用。

进一步地，检测结核分枝杆菌的检测灵敏度为5copy/μL。

本发明的上述技术方案，结合纳米金的聚集、分散状态可产生不同颜色变化，从而实现肉眼比色检测各种病原菌的原理，首先利用环介导等温扩增技术这种新型的核酸等温扩增技术，针对目的靶基因上的四个区域设计4条引物，而另两个引物，即“环引物”，用于加速等温扩增反应，在链置换型DNA聚合酶的作用下，65℃的恒温条件下，在40min内即可大量合成目标基因，效率极高。因此，针对结核分枝杆菌IS6110基因序列，NCBI存储库中的登录号为X52471.1，选择用于设计引物的核苷酸序列为1至1000，将这1000个核苷酸碱基添加到PrimerExplorer V5软件中，设计适用于当前环介导等温扩增体系的3对引物,并构建扩增体系来放大检测信号。然后在金纳米粒子上修饰上与扩增靶标互补的一段反义寡核苷酸链，作为探针分子进行检测。将金纳米粒子探针加入到扩增体系中，进行反应，扩增完成后，加入过量的盐。在没有LAMP扩增产物的体系中，由于大量的盐中和掉了修饰的反义寡核苷酸链和纳米金上全部的负电荷，因此失去了静电排斥力的金纳米粒子大量聚集，聚集后颜色变为蓝灰色。在有LAMP扩增产物的体系中，高盐浓度下同样也会使纳米金粒子发生聚集，但是金纳米粒子探针会与靶标结合，而且由于LAMP扩增产物是具有不同个数茎环的结构DNA的混合产物，会形成复杂的网络结构，存在空间位阻作用，阻碍了金纳米粒子的聚集，因此金纳米粒子还是分散状态，还是粉红色。因此检测结果阳性为粉红色，阴性为透明色。

本发明的有益效果：

(1)检测结核分枝杆菌准确度高、特异性强：本发明针对结核分枝杆菌IS6110基因进行靶标筛选、引物设计，具有准确度高、特异性强的优点，灵敏度可达5copy/μL，可以实现结核分枝杆菌的准确检测。

(2)快速检测：本发明检测方法65℃恒温扩增，没有温度的升降及循环，因而所需时间大大缩短，扩增只需要40min，检测10min，总用时50min。

(3)结果可视化：金纳米粒子探针的加入，可实现检测结果肉眼诊断。

(4)设备简单，成本低：本发明的核酸扩增过程只需要一台恒温水浴锅就可以完成扩增，检测成本大幅降低。

本发明构建的纳米金结合环介导等温扩增检测结核分枝杆菌的肉眼比色方法，使检测结果更直观，价格更低廉，检测快速，可满足相对落后的基层地区和欠发达国家进行结核分枝杆菌的现场快速、高灵敏度、可视化检测，在结核分枝杆菌的临床诊断中发挥重要作用，有助于实现早诊断、早阻断、早治疗，减轻结核分枝杆菌诊断带来的医疗资源负担，应用前景广阔。

附图说明

图1为本发明的实验原理示意图；

图2为本发明筛选的第一套引物扩增效果示意图；

图3为本发明筛选的第二套引物扩增效果示意图；

图4为本发明筛选的第三套引物扩增效果示意图；

图5为本发明显色效果示意图。

具体实施方式

为能清楚说明本方案的技术特点，下面通过具体实施方式，结合附图，对本发明进行详细阐述。

以结核分枝杆菌所特有的IS6110基因为靶序列(下表1为序列信息)，由于扩增序列的长度不能过长，不可超过300bp，本实验最终选定扩增的是IS6110基因的部分片段，长度为199bp(具体序列为下表划线部分)。

表1

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一、引物设计

由于靶标序列区域GC含量丰富，引物GC含量控制在50-60％，引物的Tm值控制在60℃-65℃，选择最优引物大小及引物结合区之间的距离；使F1c和B1c的Tm值F2和B2稍高，以利于在单链模板释放时立刻形成环状结构；为提高引物稳定性，除避免出现的二级结构之外，使F1c(或B1c)的5’端和F2，F3(或B2，B3)的3’端6个碱基中dG的含量小于-4Kcal/mol。

采用以上设计原则筛选获得三套引物，引物信息如下：

第一套引物序列信息：

F3：5’-CGCCGCCAACTACGGT-3’

B3：5’-CGGCGCTGGACGAGAT-3’

FIP：5’-CATCTGGCCACCTCGATGCttttGGTGCCCGCAAAGTG-3’

BIP：5’-CGGCTGATGACCAAACTCGGttttGCTGTGGCCGGATCA-3’

LF：5’-TCACGGTTCAGGGTTAGCC-3’

LB：5’-CAAAGCCCGCAGGACCA-3’

第二套引物序列信息：

F3：5’-GCCCCGATGGTTTGCG-3’

B3：5’-GGGTTAGCCACACTTTGCG-3’

FIP：5’-TAGGTCGATGGGGCGATCGGttttGGGTGTCGAGTCGATCTGC-3’

BIP：5’-GCGCGATGGCGAACTCAAGGttttGGCACCGTAAACACCGTAG-3’

LF：5’-CAGCTCGGTCAGCTGTGT-3’

LB：5’-ACATCAGCCGCGTCCA-3’

第三套引物序列信息：

F3：5’-TCCACGCCGCCAACT-3’(SEQ ID No.1)

B3：5’-CGGCGCTGGACGAGAT-3’(SEQ ID No.2)

FIP：5’-GCATCTGGCCACCTCGATGCCttttCGGTGTTTACGGTGCCCG-3’(SEQ ID No.3)

BIP：5’-ACGGCTGATGACCAAACTCGGCttttGGCTGTGGCCGGATCA-3’(SEQ ID No.4)

LF：5’-CGGTTCAGGGTTAGCCACACTTTG-3’(SEQ ID No.5)

LB：5’-AAAGCCCGCAGGACCA-3’(SEQ ID No.6)

下表为扩增体系，利用ABI7500对三套引物扩增效果进行筛选，通过查看扩增荧光曲线选用扩增效果最好的一套引物用于后续显色反应。

前两套引物扩增结果均有假阳性，且灵敏度相对较低。如图2所示，为第一套引物的扩增效果示意图，由该图可知，使用该套引物起峰较早，10

对第三套引物优化后可检测到1copy/uL的质粒，灵敏度高且无假阳产生。

二、制备金纳米粒子溶液，设计寡核苷酸链探针序列，合成金纳米粒子探针

2.1制备金纳米粒子溶液：

本发明所用的金纳米粒子尺寸为20nm，制备过程如下：

向三口圆底烧瓶中加入干净的搅拌磁子和142.5mL超纯水，加入1.5mL 1％氯金酸，同时加热至微沸腾；随后迅速加入6mL 1％柠檬酸钠，继续搅拌并保持微沸，溶液颜色随即变蓝，继续加热搅拌，溶液颜色由蓝变紫，最后变成红色，等溶液颜色稳定不再变化后，继续加热搅拌10min，继续搅拌，待溶液降至室温，将其转入离心管用锡箔纸包住避光，4℃保存。

2.2探针序列选择

首先，探针序列必须要避免与引物序列重合或互补从而避免影响引物扩增效率，长度在15-20bp之间，GC％在40％-60％之间，Tm值在50℃-60℃之间，依据以上考虑设计了本探针序列：5’-SH-TCTGTCCGGGACCACT-3’(SEQ ID No.7)。

2.3合成金纳米粒子探针

将2.2中获得的巯基修饰的寡核苷酸链与2.1中制备的金纳米粒子溶液进行孵育，按照物质的量浓度SH-DNA：AuNPs＝150:1，将巯基修饰的寡核苷酸链修饰到金纳米粒子上，从而制备完成金纳米粒子探针，可用于后续扩增显色实验。

上述金纳米粒子探针合成的具体步骤如下：

a、首先是SH-DNA的还原，1μL TCEP(0.5M)与50μLSH-DNA(公司提供理论浓度为100μM)混合，室温孵育6h；

b、将5μL 3M CH

c、加入50μL水复溶混匀，取出1μL样品+9μL水稀释的DNA浓度，测定还原后浓度为84μM；剩余样品用于修饰；

d、取1mL AuNPs(15nm,2.5nM)加入10μLBSPP(20mg/mL)；混合物室温避光过夜孵育或50℃孵育1h；

e、离心(12 000rmp，25℃，12-15min)，去上清，除去过量的BSPP和柠檬酸钠；加1mL水复溶下层物质AuNPs；

f、将SH-DNA与AuNPs按照150:1(物质的量比)比例引入，室温孵育6h以上；

g、逐步加入5M NaCl到上述混合物，使溶液终浓度为50mM；

h、将上述混合物过夜孵育；然后将该混合物离心2次，第一次离心(12000rpm，25℃，30min)，弃上清，加1mL水复溶；第二次离心(12000rpm，25℃，30min)，弃上清，加45μL水复溶；并重新分散于水中，测定浓度为16.8nM，用于后续实验。

三、核酸扩增显色体系内各组分浓度如下：

四、调节最佳显色盐浓度

25μL的扩增显色体系中，加入25μL的6M/L的NaCl溶液可得到最佳显色效果。

实验步骤：将上述扩增显色体系放到65℃恒温水浴锅中反应40min，取出后加入6M/L的NaCl溶液25μL，10min内可观察到颜色变化，该体系目前最低可检测到5copy/μL的质粒。

如图5所示，左侧一列为阳性对照组，右侧一列为阴性对照组，阳性对照组是分别对质粒进行10倍和5倍倍比稀释后作为模板，然后采用上述扩增显色体系扩增，扩增结果显示阳性为粉紫色，阴性为透明色，最低可检测到5copy/mL的质粒。

上述具体实施方式不能作为对本发明保护范围的限制，对于本技术领域的技术人员来说，对本发明实施方式所做出的任何替代改进或变换均落在本发明的保护范围内。

本发明未详述之处，均为本技术领域技术人员的公知技术。