近红外二区发光化合物、聚集体及其制备方法和应用
文献发布时间:2023-06-19 19:30:30
技术领域
本发明属于生物医学材料领域,特别涉及一类近红外二区发光聚集体造影剂的制备方法及其在肾移植手术中的应用。
背景技术
终末期肾病(ESRD)在全球的发病率逐年提高,而且预后差、花费高,已成为全球范围内的严重危害人类健康、加重经济负担的公共卫生问题。肾移植是ESRD患者的首选治疗方法,与血液透析、腹膜透析相比,肾移植患者具有更高的生存率和更好的生活质量。肾移植手术的成功主要取决于血管吻合后的通畅程度与移植肾再灌注质量。目前,用于评估术中血管吻合与移植肾再灌注质量的方式有血管造影、彩色多普勒超声和肾组织氧合测量等。然而,这些技术都存在一定的缺陷,如血管造影剂的肾毒性、X射线的暴露、超声检测区域的有限性,且不能实时、精准的显示肾血管吻合与肾灌注情况。因此,需要更安全、更灵敏的技术来实现肾移植手术的实时监测。
由于近红外二区(NIR-II)荧光造影技术具有实时、高分辨率的特点,越来越受到外科医生的青睐。但目前FDA批准的NIR荧光造影剂吲哚菁绿(ICG)和亚甲基蓝(MB),不仅具有聚集导致荧光猝灭(ACQ)现象,而且具有稳定性差、亮度低及循环时间短(最佳成像窗口期短)等缺点,不能在整个手术中高质量的显示解剖结构,故在临床使用中受到了限制。
与聚集导致荧光猝灭(ACQ)相反,具有聚集诱导发光(AIE)特性的NIR-II荧光造影剂,在分散态时亮度减弱,但在聚集态时亮度和稳定性增加。尽管目前对具有AIE特性和NIR-II发射的造影剂有较多报道,但同时具有NIR-II吸收与发射的AIE聚集体造影剂鲜有报道。因此,在本发明中设计并合成了种具有NIR-II发射的AIE分子,并通过进一步聚集体化制备了同时具有NIR-II吸收与发射的聚集体造影剂。
发明内容
本发明的首要目的是提供一种同时具备NIR-II吸收与发射的新型AIE聚集体造影剂。
本发明的又一目的是提供上述新型AIE聚集体造影剂的制备方法及其在肾移植手术中的应用。
本发明目的基于如下技术方案实现:在设计时选择合适的中心给体(D)单元显得格外重要,中心D单元的给电子能力越强,其构建的小分子吸收范围就越宽,从而更有可能获得高效的性能。因此,选用吡咯并[2,3-b:4,5-b']二吲哚(DIP)为D单元,氟代和非氟代的2-(3-氧-2,3-二氢-1H-茚-1-亚基)丙二腈(IC和ICF)为A单元构筑系列基于N,S-芳杂环的A-D-A型小分子受体或给体材料。再借助表面活性剂,通过聚集体化实现光物理特性的进一步提升以及水溶液中的良好分散性。
本发明至少具有以下有益效果:
1、本发明所述的NIR-II荧光造影剂在血液循环中的滞留时间长,成像分辨率高,组织穿透深度大,最佳成像窗口期长,稳定性好,且具有良好的生物相容性,而目前FDA批准临床使用的荧光造影剂排泄速度快,成像分辨率低,稳定性差,不利于长时手术导航;
2、本发明所述NIR-II聚集体荧光造影剂制备简单。
附图说明
图1所示为DIPT-IC和DIPT-ICF的合成路线。
图2所示为DIPT-ICF Aggs的合成路线。
图3(a)和(b)分别为DIPT-IC和DIPT-ICF在THF中的吸收光谱和发射光谱;(c)和(d)分别为DIPT-IC和DIPT-ICF在不同f
图4(a)为DIPT-IC和DIPT-ICF的摩尔吸光度;(b)为DIPT-IC、DIPT-ICF和IR-26的五种不同浓度下的荧光光谱图;(C)为DIPT-IC和DIPT-ICF的摩尔吸光度、量子产率和亮度的量化曲线。
图5为DIPT-IC和DIPT-ICF Aggs的表征:(a)DIPT-ICF Aggs在去离子水中的吸收光谱和发射光谱;(b)DIPT-IC、DIPT-ICF和DIPT-ICF Aggs的吸收光谱。
图6(a)为动态光散射(DLS)数据和透射电子显微镜(TEM)图像(插图中的比例尺为50nm);(b)为DIPT-ICF Aggs在去离子水中不同pH、不同时间的粒径稳定性。
图7为不同浓度下的DIPT-ICF Aggs对HeLa与3T3细胞的毒性分析。
图8为将DIPT-ICF Aggs静脉注射至Balb/c裸鼠(a)和新西兰大白兔(b)体内,2周后进行血液学检查(血细胞与血生化检测),实验组与对照度组的各项指标无明显差异。
图9为将DIPT-ICF Aggs静脉注射至Balb/c裸鼠(a)和新西兰大白兔(b)体内,2周后摘取裸鼠及兔的重要器官(心、肝、脾、肺、肾、肠、皮肤)进行HE染色;根据实验结果,未发现DIPT-ICF Aggs对鼠和兔的重要脏器产生器质性损伤。
图10(a)为含有DIPT-ICF Aggs生理盐水溶液的毛细管玻璃管NIR-I/II图像,箭头对应NIR-I和NIR-II区域的截面荧光强度分布图的位置和方向,将不同厚度(1.0mm、2.0mm、3.0mm、4.0mm和5.0mm)的鸡胸肉组织覆盖在毛细管玻璃管上;(b)和(c)分别显示NIR-I/II荧光信号强度随毛细管玻璃管覆盖鸡胸肉的厚度的增加而降低;(d)显示3mm以内各鸡胸肉的深度下,NIR-II和NIR-I显像的SBR差异有统计学意义(P<0.05)。
图11(a)分别在808nm激光器-900nm长通滤光片(LP900nm)、808nm激光器-1319nm长通滤光片(LP1319nm)和980nm激光器-1319nm长通滤光片条件下对小鼠腹壁皮下血管进行NIR-Ⅱ造影;(b)在980nm激光器搭配LP1020nm、LP1100nm和LP1319nm滤光片的条件下,对小鼠腹部皮下血管进行NIR-Ⅱ造影;(c、d)在不同的激光和滤光片条件下,NIR-Ⅱ血管造影的SBR有显著性差异;采用配对t检验计算显著性,**p<0.01,*p<0.05。
图12显示了DIPT-ICF Aggs在小鼠血液循环中的滞留时间:(a)NIR-II荧光造影剂DIPT-ICF Aggs通过尾静脉注射到小鼠体内,在给药后不同的时间点(0h、0.5h、1h、2h、4h、8h、24h、48h、72h、96h、120h和144h)收集血清,并放置在96孔板中进行NIR-II成像;(b)a中DIPT-ICF Aggs的近红外信号强度分布曲线;(c)a中DIPT-ICF Aggs的近红外-平均信号强度定量分析曲线;(d)应用980nm激光器-长通1319nm滤光片对小鼠腹部皮下血管造影;(e)d中小鼠腹部皮下血管的NIR-II血管造影信号强度曲线(虚线标记);(f)d中小鼠腹部皮下血管造影的信号背景比(SBR)。
图13显示了DIPT-ICF Aggs在兔血液循环中的滞留时间:(a)DIPT-ICF Aggs通过兔耳静脉注射,然后在注射后不同时间点(0h、0.25h、0.5h、1h、2h、4h、8h、20h、48h、72h、96h和120h)收集血清,并将其置于96孔板中进行NIR-II成像(980nm激光、1319nm长通滤光片和曝光时间200ms);(b)a中DIPT-ICF Aggs的NIR-II信号强度分布曲线;(c)a中DIPT-ICFAggs的NIR-II平均信号强度定量分析曲线;(d)在不同时间点(980nm激光、1319nm长通滤光片和曝光时间200ms)进行兔耳血管NIR-II造影;(e)d中兔耳血管的NIR-II血管造影信号强度曲线;(f)d中用黄色虚线标记的兔耳血管的NIR-II信号背景比(SBR)。
图14以DIPT-ICF Aggs为造影剂的肾移植血管吻合后的NIR-II造影:(a)-(d)分别显示了血管吻合成功的眀场图像(上)和NIR-II图像(下);(a)移植肾血管成功吻合图像;(b)肾动脉吻合口部分狭窄;(c)肾静脉吻合口部分及完全狭窄;(d)肾动脉完全狭窄;(e)至(h)分别在(a)、(b)、(c)和(d)中NIR-II荧光信号强度定量曲线;(j)a-d中移植肾再灌注后的NIR-II平均荧光强度定量分析。
具体实施方式
下面结合实施例和附图对本发明作进一步详细的描述,但本发明的实施方式不限于此。
下列实施例中使用的试剂均可从商业渠道获得。
实施例1:基于高性能稠环电子受体吡咯并[2,3-b:4,5-b']二吲哚(DIP)的NIR-II发光材料(DIPT-IC和DIPT-ICF)的合成
合成路线如图1所示:
(1)在氩气氛围下,依次将化合物1(3.962g,4.75mmol),2-溴噻吩-3-羧酸乙酯(3.35g,14.25mmol),Pd(PPh
(2)在氩气的保护下,-78℃的低温环境中,分别往100ml圆底烧瓶加入THF(16mL),1-溴-4-己基苯(2.85g,11.8mmol),接下来缓慢滴加2.4M正丁基锂的己烷(4.50mL,10.82mmol)溶液。并于-78℃下保温搅拌2h后,缓慢滴入溶在THF(15mL)中的化合物DIP-COOEt(1.751g,1.97mmol),然后移动到室温并搅拌过夜。反应完后,加水淬灭,并用乙酸乙酯萃取旋干后,将粗产物转移至250mL的三颈烧瓶中,然后加入乙酸(40mL)和辛烷(40mL)并回流5h。冷却至室温后,将反应用水淬灭,用乙酸乙酯萃取后用石油醚作为洗脱剂柱层析分离,得到蓝黄色中间体3(DIPT),产率60%。
(3)在氩气氛围中,向100mL圆底烧瓶中先加入10.19ml的无水DMF,将反应装置置于冰水浴中冷却到0℃,然后滴加2.03ml的三氯氧磷,在0℃并搅拌2h后,缓慢滴加溶在1,2-二氯乙烷(10ml)的中间体3(0.721g,0.51mmol)。滴加完毕,将反应装置移至85℃油浴锅搅拌10h。反应完后,将混合物倒入冰水中,搅拌1h,并用二氯甲烷萃取后以石油醚/二氯甲烷(1:1)作为洗脱剂柱层析纯化,得到呈橙红色中间体4(DIPT-CHO),产率60%。
(4)氩气氛围下,将化合物DIPT-CHO(0.42g,0.28mmol),2-(3-氧代-2,3-二氢-1H-茚-1-亚基)丙二腈(IC)(0.22g,1.12mmol),吡啶(1mL)和氯仿(40mL)依次加入100mL圆底烧瓶中,然后回流8h。反应完后,将混合物滴入甲醇(200mL)中沉降,抽滤后收集固体。以石油醚/二氯甲烷为洗脱剂柱层析分离,得到DIPT-IC,是一种亮黑色固体DIPT-IC,产率70%。
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(5)在DIPT-IC的基础上合成得到蓝黑色固体DIPT-ICF,产率63%。
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实施例2:分子DIPT-IC与DIPT-ICF的AIE特性表征
图3为基于实例1所得材料在不同水含量条件下的荧光光谱图。从图中可以看出,两种实例材料在良溶剂二甲基甲酰胺中发光微弱,随着不良溶剂水的加入,荧光开始逐渐增强。当水含量提高至90%时,荧光强度达到最强状态,说明DIPT-IC和DIPT-ICF光敏剂均具有AIE特性。此外,实例1所得材料的吸收波长峰值为746nm和818纳米,荧光发射波长峰值分别为979nm和1014nm,说明分子DIPT-IC在引入4个氟原子后,吸收与发射明显红移,DIPT-ICF的光物理特性较DIPT-IC更优。
实施例3:分子DIPT-IC与DIPT-ICF的亮度表征
图4为DIPT-IC与DIPT-ICF的摩尔吸光度与量子产率曲线。从图4a中可以发现DIPT-ICF在808nm处的摩尔吸光度是DIPT-IC的3.13倍。DIPT-IC与DIPT-ICF的量子产率分别为2%和0.7%,即使DIPT-ICF的量子产率低于DIPT-IC,但DIPT-ICF的亮度高于DIPT-IC。
实施例4:DIPT-ICF聚集体造影剂(DIPT-ICF Aggs)的制备
从实例2和实例3表征参数可以看出,DIPT-ICF较DIPT-IC具有更优的光物理特性,因此选用DIPT-ICF作为聚集体造影剂的分子材料,进一步聚集体化制备DIPT-ICF Aggs。
制备路线如图2所示,溶剂置换法制备DIPT-ICF Aggs:称取1mg DIPT-ICF与6mg
实施例5:DIPT-ICF Aggs光物理特性表征
图5为DIPT-ICF Aggs在水溶液中的光谱曲线及从分子DIPT-IC到DIPT-ICF Aggs的吸收光谱的变化。DIPT-ICF Aggs的吸收与发射峰值分别为974nm和1074nm。吸收光谱从小分子DIPT-IC到DIPT-ICF红移72nm,吸收峰红移至818nm;从DIPT-ICF到DIPT-ICF Aggs,吸收再次红移156nm,吸收峰值红移至974nm,吸收光谱拖尾至1100nm。通过分子工程与聚集体化过程,DIPT-ICF Aggs的吸收光谱共红移228nm,实现了吸收与发射同时达到近红外二区,提高了活体组织穿透深度及成像的信噪比。
实施例6:DIPT-ICF Aggs粒径与稳定性表征
图6为DIPT-ICF Aggs的动态光散射粒径分布与透射电镜(TEM)的聚集体形貌及聚集体在不同pH环境中的稳定性。DIPT-ICF Aggs的粒径约为80nm,在酸性环境、中性环境及碱性环境中均表现出了良好的形貌与发光的稳定性。
实施例7:DIPT-ICF Aggs在细胞水平与动物水平的生物相容性评估
采用HeLa细胞和3T3细胞对DIPT-ICF Aggs进行细胞毒性评估。分别将HeLa细胞与3T3细胞铺在96孔板中培养24h,然后与不同浓度DIPT-ICF Aggs共培养24h,应用MTT检测两种细胞的毒性。测试结果见图7,DIPT-ICF Aggs无明显细胞毒性。
分别用Balb/c裸鼠与新西兰大白兔评估DIPT-ICF Aggs动物水平的毒性。取0.5mg/mL的DIPT-ICF Aggs 200μL经尾静脉注射至Balb/c裸鼠体内,2周后留取裸鼠血液样本及重要脏器(心、肝、脾、肺、肾、肠及皮肤),进行血生化、血细胞计数及重要脏器的病理分析。取0.5mg/mL的DIPT-ICF Aggs 10mL,经耳缘静脉注射至新西兰大白兔体内,2周后留取血液及重要脏器(心、肝、脾、肺、肾、肠及皮肤)标本,进行血生化、血细胞计数及重要脏器的病理分析,结果见图8,图9。
结合图7、图8和图9可以看出,DIPT-ICF Aggs具有出色的生物相容性。
实施例8:DIPT-ICF Aggs作为造影剂,在体外脉管模拟造影中的NIR-I与NIR-II分辨率比较
将毛细玻璃管中吸入0.33mg/mL DIPT-ICF Aggs造影剂,用不同厚度的鸡胸肉组织(厚度依次为1mm,2mm,3mm,4mm和5mm)覆盖毛细玻璃管,用小动物成像仪分别进行NIR-II成像(用毛细玻璃管模拟动物组织中穿行的血管,鸡胸肉组织模拟动物活体组织)。如图9所示,荧光信号强度和信号-背景-比值(SBR)随鸡胸肉深度的增加而降低。在小于3mm深度的鸡胸肉组织覆盖,NIR-II的SBR显著高于NIR-I,提示DIPT-ICF Aggs是一种出色的NIR-II荧光造影剂。
实施例9:DIPT-ICF Aggs作为造影剂,对动物体表血管NIR-II造影的分辨率评估
取0.5mg/mL的DIPT-ICF Aggs 200μL,经尾静脉注射至Balb/c裸鼠体内并用小动物成像仪进行成像。分别应用不同的激光器(808nm和980nm)搭配不同的滤光片(长通900nm,长通1020nm,长通1100nm和长通1319nm)对体表血管进行多组造影成像。如图11所示,980nm激光器+1319nm长通滤光片组,腹部血管走行最清晰,其SBR最高。
实施例10:DIPT-ICF Aggs在Balb/c裸鼠与新西兰大白兔血液循环中具有较长的滞留时间
取0.5mg/mL的DIPT-ICF Aggs 200μL,经尾静脉注射至Balb/c裸鼠体内,在不同的时间点(0h,0.5h,1h,2h,4h,8h,24h,48h,72h,96h,120h和144h)收集血清,并置于96孔板进行NIR-II成像。如图12所示,尾静脉注射8h后,血清中保留的DIPT-ICF Aggs仍具有较高的荧光信号;小鼠腹腔皮下血管造影图像显示,给荧光造影剂10h后,腹部血管纹理仍清晰可见。
同时,取0.5mg/mL的DIPT-ICF Aggs 10mL,经耳缘静脉注射至新西兰大白兔体内,并在注射后不同时间点(0h,0.5h,1h,2h,4h,8h,24h,48h,72h,96h和120h)采集血清。然后将收集的血清置于96孔板进行NIR-II成像。一次给药,兔血清中DIPT-ICF Aggs的NIR-II高信号强度可维持20h。如图13所示,注射24h后兔耳血管造影显示耳内血管清晰可见,SBR较高。
从图12和图13可以看出,聚集体造影剂DIPT-ICF Aggs在Balb/c裸鼠与新西兰大白兔体内循环滞留时间长,血管造影SBR高,具有出色的长时血管造影能力。
实施例11:DIPT-ICF Aggs作为NIR-II造影剂,对肾移植术中血管吻合口的通畅程度进行实时-高分辨率成像,并实现移植肾再灌注监测
4只新西兰大白兔(体重2.5~3kg),经异氟烷吸入麻醉成功后,自兔耻骨联合至剑突,沿腹部中线切口,打开腹腔,切口长约15cm。将肠管推向右侧,暴露左侧腹膜后肾组织及左肾动静脉。迅速分离并结扎左肾动脉,在左肾动脉远端植入24G静脉留置针,快速推入预冷的肾脏保存液,直至肾脏颜色变为黄白色,离断左肾动脉。结扎并离断左肾静脉,将灌洗后的左肾脏取出,放入4℃的肾脏保存液中。其他3只麻醉成功的新西兰大白兔,以同样的方法取出左肾并保存在预冷的肾脏保存液中。分别对新西兰大白兔进行异体原位肾移植(模型分类:肾血管良好吻合、肾静脉吻合口狭窄、肾动脉吻合口部分狭窄和肾动脉吻合口完全狭窄)。将实验兔放入近红外二区小动物成像仪内,调好焦距,使眀场状态下清晰地看到肾脏及肾脏血管。8mL DIPT-ICF Aggs(浓度为0.33mg/mL)的生理盐水溶液,经耳缘静脉快速注入实验兔体内,实时采集图像。从图13中可以看出,四种实验模型的肾移植血管吻合口的通常程度及移植肾再灌注情况得到了清晰的显示。通过NIR-II成像可以清楚地看到移植肾血管吻合口狭窄和再灌注状态,有助于泌尿科医师及时发现手术的不足,提高移植肾手术的成功率。
上述实施例为本发明较佳的实施方式,但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制,其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化,均应为等效的置换方式,都包含在本发明的保护范围之内。
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