一种刺五加皂苷系列对照品及其制备方法

技术领域

本发明属于生物制药技术领域，具体涉及一种刺五加皂苷系列对照品及其制备方法。

背景技术

刺五加(拉丁学名：Acanthopanax senticosus(Rupr.Maxim.)Harms)，别名：坎拐棒子、老虎潦、一百针，为五加科五加属植物刺五加的干燥根及根茎。刺五加的药用历史悠久，明代《本草纲目》中记载刺五加具有“补中益气，强意志”之功效。刺五加有促性腺、抗疲劳和防止记忆衰退等活性，医学上被称之为“适应原”样药物。临床上五加参、刺五加片及刺五加注射液等制剂对心血管疾病具有独特疗效，近年来，各国学者对刺五加化学成分、药理活性做了许多研究。

随着近年对刺五加综合利用研究的不断深入，发现刺五加叶中的主要活性成分为齐墩果烷型的三萜皂苷。相关报道中，邵春杰等人在刺五加叶中发现了13种新的化合物，命名为Ciwujianoside(刺五加皂苷)A1、A2、A3、A4、B、C1、C2、C3、C4、D1、D2、D3和E均为三萜皂苷。Suprunov(Suprunov，NI：Chemical Abstract73:127741e，1970)从刺五加叶中分离得到了六种单体皂苷，分别鉴定为齐墩果酸皂苷A、B、C、D、E和F。

CN1468860A公开了以刺五加茎或叶为原料，制备刺五加总皂苷提取物，主要是通过碱提，大孔树脂吸附洗脱，再弱酸型离子交换树脂进行脱色获得刺五加总皂苷提取物。CN1113785A公开了以刺五加根、茎或叶为原料，采用醇提水沉，再用大孔树脂吸附脱色获得刺五加提取物。CN113440546A公开了利用刺五加根、茎水提、膜浓缩醇沉、大孔树脂吸附、氧化镁脱色获得刺五加总皂苷提取物的方法。CN110540554A公开了一种通过大孔树脂获得刺五加皂苷提取物的方法。这些专利均是以刺五加总皂苷提取物为主，未有专利报道对刺五加叶中皂苷系列对照品进行研究，且这类皂苷具有结构相似，分离难度大的特点，传统的工艺路线还是通过正相色谱过硅胶柱和反相色谱结合反复制备获得对照品，也存在工艺路线较长且收率低的问题，很难制备得到纯度大于98％以上的对照品。

CN110063961A公开了刺五加皂苷B的新用途，其有效成分皂苷类物质能够穿过动物的血脑屏障直接作用于抵抗冷应激的神经中枢，提高了畜禽抵抗冷应激相关激素的分泌。刺五加作为天然植物成分不仅对环境没有污染，动物也不会对其产生依赖性，是保证畜禽健康、提高经济效益的有效手段，在养殖领域具有十分重要的意义。说明分离刺五加系列皂苷对照品有其价值和必要性。

因此，开发一种快速简便、提取率高、纯度高的刺五加皂苷系列对照品是本领域的研究重点。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种刺五加皂苷系列对照品及其制备方法，该方法快速简便、提取率高，制备得到的刺五加系列对照品的纯度较高。

为达到此发明目的，本发明采用以下技术方案：

第一方面，本发明提供一种刺五加皂苷系列对照品的制备方法，所述制备方法包括如下步骤：

(1)将刺五加叶进行提取、萃取、过滤，得到刺五加澄清液；

(2)将所述刺五加澄清液进行富集、洗脱a、液质联用检测，收集皂苷富集段；

(3)将所述皂苷富集段进行分段、洗脱b、高效液相色谱检测b，获得皂苷段样品；

(4)将所述皂苷段样品分别进行纯化、洗脱c、高效液相色谱检测c，得到所述刺五加皂苷系列对照品。

本发明提供的刺五加皂苷系列对照品的制备工艺包括皂苷富集、皂苷切段、皂苷对照品纯化等步骤，极大的简化了现有技术中刺五加皂苷的制备工艺，且能够快速获得刺五加中皂苷系列的对照品，具有效率高，收率高等优势，能够快速获得克级别量的对照品。

优选地，所述提取前包括将刺五加叶粉碎成碎叶的步骤。

优选地，所述提取的料液比为1:(8-15)，例如可以为1:9、1:10、1:11、1:12、1:13或1:14等，以刺五加叶为1kg计，提取剂为8-15L。

优选地，所述提取采用的提取剂包括甲醇水溶液或乙醇水溶液。

优选地，所述甲醇水溶液中甲醇的体积百分含量为50-80％，例如可以为55％、60％、70％或75％等。

优选地，所述乙醇水溶液中乙醇的体积百分含量为60-90％，例如可以为65％、70％、80％或85％等。

优选地，所述提取重复进行3-5次，例如可以为3次、4次或5次。

优选地，所述提取之后还包括过滤、浓缩的步骤。

优选地，所述过滤依次进行200目纱布过滤、滤纸过滤。

优选地，所述浓缩的温度为50-60℃，例如可以为52℃、55℃或58℃等。

本发明中浓缩的方式没有特别限制，主要以减压浓缩的方式进行，过滤的方式也没有限制，常规的过滤装置、抽滤装置均可。

优选地，所述萃取的萃取剂包括石油醚或二氯甲烷，优选为石油醚。

优选地，所述萃取剂与浓缩液的体积比为(0.5-2):1，例如可以为0.8:1、1:1或1.5:1等。

优选地，所述萃取重复进行2-3次。

优选地，所述过滤的陶瓷膜孔径为30-500nm，例如可以为50nm、100nm、200nm、300nm或400nm等。

上述各项数值范围中的其他具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。

优选地，所述富集采用反相C18填料的高压制备柱。

优选地，所述反相C18填料为耐纯水系填料。

优选地，所述反相C18填料的粒径为10-30μm，例如可以为10μm、15μm、20μm、30μm等。

优选地，所述富集的上样质量占填料质量的百分比为4-10％，例如可以为5％、6％、7％、8％或9％等。

优选地，所述洗脱a采用台阶等度洗脱。

优选地，所述洗脱a采用的洗脱剂为水-乙醇体系。

优选地，所述洗脱剂的流速为250-350mL/min，例如可以为280mL/min、300mL/min或320mL/min等。

优选地，所述洗脱a的台阶等度洗脱程序为：先2体积纯水洗脱，再10％乙醇水溶液洗脱10min，20％乙醇水溶液洗脱15min，30％乙醇水溶液洗脱15min，40％乙醇水溶液洗脱15min，80％乙醇水溶液洗脱10min，乙醇洗脱10min。

优选地，所述分段采用反相C18填料的高压制备柱。

优选地，所述反相C18填料的粒径为10-30μm，例如可以为10μm、15μm、20μm、30μm等。

优选地，所述洗脱b采用台阶等度洗脱。

优选地，所述洗脱剂的流速为250-350mL/min，例如可以为280mL/min、300mL/min或320mL/min等。

优选地，所述洗脱b采用的洗脱剂为乙腈水溶液。

优选地，所述洗脱b的台阶等度洗脱程序为：30％乙腈水洗脱40min，40％乙腈水洗脱20min，40％-90％乙腈水洗脱10min，90％乙腈水洗脱10min。

上述各项数值范围中的其他具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。

皂苷分段工艺的主要目的是将皂苷按极性大小进行分段，这里使用的填料就是碳十八烷基硅烷键合硅胶，采用乙腈-水体系进行制备划段，依旧采用台阶等度的方式进行，值得注意的是由于三萜皂苷紫外吸收弱，选择低波长进行制备。

优选地，所述纯化采用的是反相制备柱和亲水色谱柱。

优选地，所述反相制备柱的填料的粒径为5-10μm，例如可以为6μm、7μm或8μm等。

优选地，所述亲水色谱柱的填料的粒径为5-10μm，例如可以为6μm、7μm或8μm等。

优选地，所述纯化采用依次上样反相制备柱、亲水色谱柱或依次上样亲水色谱柱、反相制备柱的方式均可。

优选地，所述洗脱c采用的洗脱剂为甲醇水溶液。

优选地，所述洗脱剂的流速为250-350mL/min，例如可以为280mL/min、300mL/min或320mL/min等。

优选地，上样所述反相制备柱时，洗脱剂甲醇水溶液中甲醇的体积百分含量为60-75％，例如可以为62％、65％或70％等。

优选地，上样所述亲水色谱柱时，洗脱剂甲醇水溶液中甲醇的体积百分含量为70-80％，例如可以为72％、75％或78％等。

优选地，所述液质联用检测、高效液相色谱检测b和高效液相色谱检测c的检测波长均为205-215nm，例如可以为208nm、210nm或213nm等，优选为210nm。

优选地，所述高效液相色谱检测c之后还包括减压干燥、真空干燥的步骤。

上述各项数值范围中的其他具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。

优选地，所述制备方法包括如下步骤：

(1)将刺五加叶使用甲醇水溶液或乙醇水溶液进行提取3-5次，之后进行过滤和浓缩，所得浓缩液采用石油醚或二氯甲烷萃取2-3次，合并水相，采用30-500nm陶瓷膜过滤，得到刺五加澄清液；

所述甲醇水溶液中甲醇的体积百分含量为50-80％，所述乙醇水溶液中乙醇的体积百分含量为60-90％；

(2)将所述刺五加澄清液采用反相C18填料的高压制备柱进行富集，上样质量占填料质量的百分比为4-10％，采用水-乙醇体系进行台阶等度洗脱，于205-215nm检测波长下进行液质联用检测，收集皂苷富集段；

(3)将所述皂苷富集段采用反相C18填料的高压制备柱进行分段，采用乙腈水溶液进行台阶等度洗脱，于205-215nm检测波长下进行高效液相色谱检测，获得皂苷段样品；

(4)将所述皂苷段样品上样反相制备柱和亲水色谱柱，进行纯化，上样反相制备柱时采用60-75％甲醇水溶液洗脱，上样亲水色谱柱时，采用70-80％甲醇水溶液洗脱，于205-215nm检测波长下进行高效液相色谱检测，得到所述刺五加皂苷系列对照品。

第二方面，本发明提供一种刺五加皂苷系列对照品，所述刺五加皂苷系列对照品采用如第一方面所述的制备方法制备得到。

优选地，所述刺五加皂苷系列对照品包括刺五加皂苷A(Acanthopanaxoside A)、刺五加皂苷B(Ciwujianoside B)、刺五加皂苷C1(Ciwujianoside C1)、刺五加皂苷C2(Ciwujianoside C2)、刺五加皂苷C3(Ciwujianoside C3)、刺五加皂苷C4(CiwujianosideC4)、刺五加叶苷D1(Ciwujianoside D1)、刺五加叶苷D2(Ciwujianoside D2)、刺五加皂苷A1(Ciwujianoside A1)、野木瓜甙YM12(Yemuoside YM12)、常春藤皂苷B(HederasaponinB)。

相对于现有技术，本发明具有以下有益效果：

本发明极大的简化了皂苷制备的工艺流程：皂苷富集-皂苷切段-皂苷对照品纯化，具有效率高，收率高等优势，能够快速获得克级别刺五加皂苷系列对照品，并且纯度可以达到98％以上，为进一步研究刺五加皂苷药理活性提供高质量样品。

本发明全工艺不采用正相色谱，采用反相和亲水色谱结合模式，溶剂仅适用乙醇、甲醇、乙腈、水体系，更加环保，利于生产。

附图说明

图1为制备刺五加皂苷系列对照品的工艺流程图；

图2为实施例1中液质联用检测刺五加皂苷富集段的特征谱图；

图3为实施例1制备得到的刺五加皂苷系列对照品图；

图4为实施例1制备得到的11种刺五加皂苷系列对照品的HPLC特征谱图；

图5为实施例2刺五加皂苷富集段的HPLC特征谱图。

具体实施方式

下面通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案。本领域技术人员应该明了，所述实施例仅仅是帮助理解本发明，不应视为对本发明的具体限制。

本文所用术语“包含”、“包括”、“具有”、“含有”或其任何其它变形，意在覆盖非排它性的包括。例如，包含所列要素的组合物、步骤、方法、制品或装置不必仅限于那些要素，还可包括未明确列出的其它要素或此种组合物、步骤、方法、制品或装置所固有的要素。

“任选的”或者“任意一种”是指其后描述的事项或事件可以发生或不发生，而且该描述包括事件发生的情形和事件不发生的情形。

本发明要素或组分前的不定冠词“一种”和“一个”对要素或组分的数量要求(即出现次数)无限制性。因此“一个”或“一种”应被解读为包括一个或至少一个，并且单数形式的要素或组分也包括复数形式，除非所述数量明显只指单数形式。

本发明所描述的术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例性地”、“具体示例”或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本文中，对上述术语的示意性表述不是必须针对相同的实施例或示例。

以下实施例中试剂或仪器来源如下：

石油醚：分析纯，采购于国药集团化学试剂有限公司；

亲水色谱柱：X3填料，粒径10μm，由乌苏里江制药有限公司提供；

高压制备柱：型号100×650mm，购于江苏汉邦公司。

C18YE填料：粒径10μm，由乌苏里江制药有限公司提供；

反相C18填料：粒径10μm，购于浙江华谱新创科技有限公司。

实施例1

本实施例提供一系列刺五加皂苷对照品，制备方法如下：

步骤A：药材提取：采购刺五加干叶5kg，产地黑龙江，采用粉碎机粉碎成碎叶，注意不可粉碎过细，否则导致后续难以过滤。加入90％乙醇50L进行浸泡提取，提取4次，先200目纱布过滤，再滤纸过滤，滤液于55℃浓缩至5L，加2L水进行分散，得到分散液。

步骤B：萃取：将分散液加入等体积的石油醚萃取，萃取2次，去除叶绿素和油脂，合并水层。

步骤C：澄清：将水层上500nm陶瓷膜进行澄清，进一步去除不溶物，获得澄清液。

步骤D：皂苷部位富集：将澄清液以10％载样量上高压制备柱，填料为C18YE填料，上样体积约1L，流速300mL/min，上样后先纯水洗脱2倍柱体积，再10％乙醇水洗脱10min，20％乙醇水洗脱15min，30％乙醇水洗脱15min，40％乙醇水洗脱15min，80％乙醇水洗脱10min，100％乙醇洗脱10min，HPLC分析检测，波长采用210nm，选取保留时间15-35min，收集目标段样品，液质联用进行确认皂苷富集段，其中，液质联用检测中刺五加皂苷富集段如图2所示，其中上图为总离子流图，下图为色谱图。

步骤E：将步骤D中富集的皂苷部位上高压制备柱进行制备，反相C18填料，流速300mL/min，上样20mL，先30％乙腈水洗脱40min，再40％乙腈水洗脱20min，再40％-90％乙腈水洗脱10min，再90％乙腈水洗脱10min，HPLC分析检测，波长采用210nm，该皂苷富集段总共产生9个特征峰，共计获得9个皂苷部位，根据保留时间从小到大，依次为命名为CWJY-1、CWJY-2、CWJY-3、CWJY-4、CWJY-5、CWJY-6、CWJY-7、CWJY-8、CWJY-9。

步骤F：将步骤E中9个皂苷部位分别先上反相C18填料制备柱进行制备，再上亲水色谱柱进行纯化，然后减压浓缩，真空干燥，获得高纯度对照品固体。9个皂苷部位反相-亲水色谱结合制备具体操作方法如下：

CWJY-1：进样反相C18填料制备柱，采用70％甲醇水溶液等度制备，流速300ml/min，210nm波长，制备获得HPLC纯度为97％；减压浓缩回收甲醇，浓缩后皂苷样品再上亲水色谱柱，采用25％甲醇水溶液等度洗脱，回收溶剂，流速300ml/min，210nm波长，制备获得HPLC纯度为99.6％的Ciwujianoside B，质量为2.3g；

CWJY-2：进样反相C18填料制备柱，采用65％甲醇水溶液等度制备，流速300ml/min，210nm波长，制备获得HPLC纯度为97％；减压浓缩回收甲醇，浓缩后皂苷样品再上亲水色谱柱，采用25％甲醇水溶液等度洗脱，回收溶剂，流速300ml/min，210nm波长，制备获得HPLC纯度为99.6％的Ciwujianoside B，质量为1.6g；

CWJY-3：进样反相C18填料制备柱，采用70％甲醇水溶液等度制备，流速300ml/min，210nm波长，制备获得HPLC纯度分别为96％和90％；减压浓缩回收甲醇，浓缩后皂苷样品再上亲水色谱柱，采用28％甲醇水溶液等度洗脱，回收溶剂，流速300ml/min，210nm波长，制备获得HPLC纯度为98.6％的Acanthopanaxoside A，质量为1.1g和HPLC纯度为99.1％的Ciwujianoside A1，质量为1.8g；

CWJY-4：进样反相C18填料制备柱，采用65％甲醇水溶液等度制备，流速300ml/min，210nm波长，制备获得HPLC纯度为93％；减压浓缩回收甲醇，浓缩后皂苷样品再上亲水色谱柱，采用25％甲醇水溶液等度洗脱，回收溶剂，流速300ml/min，210nm波长，制备获得HPLC纯度为98.9％的Yemuoside YM12，质量为2.3g；

CWJY-5：进样反相C18填料制备柱，采用66％甲醇水溶液等度制备，流速300ml/min，210nm波长，制备获得HPLC纯度分别为92％和95％；减压浓缩回收甲醇，浓缩后皂苷样品再上亲水色谱柱，采用25％甲醇水溶液等度洗脱，回收溶剂，流速300ml/min，210nm波长，制备获得HPLC纯度为99.6％的Ciwujianoside C2，质量为4.3g和HPLC纯度为100.0％的Hederasaponin B，质量为15.5g；

CWJY-7：进样反相C18填料制备柱，采用70％甲醇水溶液等度制备，流速300ml/min，210nm波长，制备获得3个皂苷样品，HPLC纯度分别为94％、95％和95％；减压浓缩回收甲醇，分别浓缩后皂苷样品再上亲水色谱柱，采用25％甲醇水溶液等度洗脱，回收溶剂，流速300ml/min，210nm波长，制备获得HPLC纯度为99.5％的Ciwujianoside C1，质量为1.3g，HPLC纯度为99.7％的Ciwujianoside D2，质量为2.5g和HPLC纯度为99.2％的Ciwujianoside C3，质量为1.5g；

CWJY-8：进样反相C18填料制备柱，采用70％甲醇水溶液等度制备，流速300ml/min，210nm波长，制备获得HPLC纯度为96％；减压浓缩回收甲醇，浓缩后皂苷样品再上亲水色谱柱，采用25％甲醇水溶液等度洗脱，回收溶剂，流速300ml/min，210nm波长，制备获得HPLC纯度为98.7％的Ciwujianoside C4，质量为12.2g；

CWJY-9：进样反相C18填料制备柱，采用70％甲醇水溶液等度制备，流速300ml/min，210nm波长，制备获得HPLC纯度为91％；减压浓缩回收甲醇，浓缩后皂苷样品再上亲水色谱柱，采用20％甲醇水溶液等度洗脱，回收溶剂，流速300ml/min，210nm波长，制备获得HPLC纯度为98.9％的Ciwujianoside D1，质量为2.6g。

制备刺五加皂苷系列对照品的工艺流程图如图1所示；制备得到的刺五加皂苷系列对照品如图3所示；对于11种刺五加皂苷系列对照品进行HPLC分析得到的特征谱图如图4所示。

实施例2

本实施例提供一系列刺五加皂苷对照品，制备方法如下：

其与实施例1的区别仅在于，步骤B中采用二氯甲烷进行萃取，其余原料、用量及制备方法均与实施例1相同。实施例2刺五加皂苷富集段的HPLC特征谱图如图5所示，由图可知，刺五加皂苷段的损失较大，所制备得到刺五加系列对照品产率降低。

测试例1

针对实施例1得到的11种刺五加皂苷系列对照品进行核磁共振氢谱、碳谱检测，所得检测结果如下：

Ciwujianoside B：白色粉末，HR-ESI-MS：1188.59，

Ciwujianoside C1：白色粉末，HR-ESI-MS：1042.53，

Ciwujianoside C2：白色粉末，HR-ESI-MS：1230.60，

Ciwujianoside C3：白色粉末，HR-ESI-MS：1058.56，

Ciwujianoside C4：白色粉末，HR-ESI-MS：1246.63，

Ciwujianoside D1：白色粉末，HR-ESI-MS：1100.57，

Ciwujianoside D2：白色粉末，HR-ESI-MS：1084.54，

Ciwujianoside A1：白色粉末，HR-ESI-MS：1220.62，

Yemuoside YM12：白色粉末，HR-ESI-MS：1042.53，

Hederasaponin B：白色粉末，HR-ESI-MS：1204.62，

Acanthopanaxoside A：白色粉末，HR-ESI-MS：1246.60，

申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的工艺方法，但本发明并不局限于上述工艺步骤，即不意味着本发明必须依赖上述工艺步骤才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明所选用原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。