一种治疗猫冠状或杯状病毒感染的方法

本申请要求在先提交的申请号为202310030217.6和202210744698.2的中国专利申请优先权，其全部内容和公开以引用方式并入本文。

技术领域

本发明涉及兽药领域，具体地涉及一类核苷类化合物及其组合制剂在治疗猫冠状病毒或杯状病毒感染中的应用。

背景技术

猫冠状病毒(FCoV)属于冠状病毒科(Coronaviridae)，是一组包膜的正链RNA病毒，通常在猫中发现。在自然界中，FCoV以两种不同的生物型存在：猫肠道冠状病毒(FECV)和猫传染性腹膜炎病毒(FIPV)，后者是FECV的突变形式。FECV感染在猫中广泛存在，全世界估计有40-80％的猫传播该病毒。FECV长期感染猫的胃肠上皮细胞，并且通常通过粪口途径传播。猫的FECV感染大多数是无症状的，有些猫会出现腹泻、呕吐、食欲不振和发烧。FIPV生物型在单核苷酸多态性或缺失(其使FECV中的病毒3c蛋白酶基因失活)之后出现，还涉及病毒刺突蛋白的突变。3c蛋白酶的失活改变细胞向性，使得病毒能够在巨噬细胞内复制，促进FIPV的系统性传播和猫传染性腹膜炎(FIP)的发作。FIP是猫的进行性免疫相关疾病。FIP疾病可以分为“湿”或“干”FIP的形式。湿FIP与内脏浆膜和网膜的炎症相关，导致流体渗出到腹部和/或胸腔中。干FIP的特征在于诸如肝脏、中枢神经系统或眼睛等薄壁组织器官(paracnchymatous organs)的肉芽肿性受累。湿或干形式的FIP的发展总是致命的。FIP是具有大的猫密度的环境(例如，多猫家庭，猫舍，庇护所和猫救援设施)中的主要问题。该疾病在较年轻的猫(<3岁)特别是小猫中最为普遍，因为FECV复制水平较高，这增加了向FIPV生物型突变的可能性，以及对携带这些突变的病毒的抗性降低。FIP是2岁以下的猫死亡的主要原因，估计全世界猫死亡率为0.3％至1％。

猫杯状病毒是一种无包膜有球形衣壳的单链RNA病毒，具有高度传染性，可引起中度、自限性的急性口腔问题及上呼吸道疾病，是猫传染性上呼吸道疾病最常见的致病原之一。目前由猫杯状病毒引发的猫口炎问题尚无针对性药物，普遍采用激素或抗生素进行支持疗法，易复发，严重时采用全口拔牙手术处理，给猫带来极大的痛苦。

目前，没有批准的疫苗或有效的抗病毒疗法用于治疗FIP或猫口炎。因此，非常需要开发有效的用于治疗猫冠状病毒或杯状病毒感染相关疾病的药物，尤其是施用方便的口服药。

发明内容

发明要解决的问题

为了解决上述问题，本发明提供了一类治疗猫冠状病毒或杯状病毒感染相关疾病的药物，该药物具有显著的抗猫冠状病毒(FIPV)活性，并且口服生物利用度高，能够用于预防和治疗猫传染性腹膜炎和猫口炎。

用于解决问题的方案

本发明提供一种式I所示的化合物或其立体异构体、溶剂化物、水合物、前药、稳定的同位素衍生物以及药学上可接受的盐在制备抑制猫冠状或杯状病毒复制的抑制剂中的应用；

和/或一种式I所示的化合物或其立体异构体、溶剂化物、水合物、前药、稳定的同位素衍生物以及药学上可接受的盐在制备治疗和/或预防、缓解由猫冠状或杯状病毒感染引起的相关疾病的药物中的应用；

其中，

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本发明提供一种含有式I所示的化合物或其立体异构体、溶剂化物、水合物、前药、稳定的同位素衍生物以及药学上可接受的盐的组合物在制备抑制猫冠状或杯状病毒复制的抑制剂中的应用；

和/或一种含有式I所示的化合物或其立体异构体、溶剂化物、水合物、前药、稳定的同位素衍生物以及药学上可接受的盐的组合物在制备治疗和/或预防、缓解由猫冠状或杯状病毒感染引起的相关疾病的药物中的应用；

其中，

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发明的效果

(a)本发明所述式I化合物可高效地抑制猫冠状或杯状病毒的复制，对猫正常细胞的毒性作用很小。

(b)本发明所述式I化合物对猫传染性腹膜炎病毒的体内抑制活性高。

(c)本发明所述式I化合物在猫体内的毒副作用低，口服生物利用度高，代谢稳定，成药性好。这提示着本发明的活性化合物在治疗猫冠状或杯状病毒感染领域有很好的药用前景。

具体实施方式

为使本发明的技术方案和有益效果能够更加明显易懂，下面通过列举具体实施例的方式进行详细说明。除非另有定义，本文所使用的技术和科学术语与本申请所属的技术领域中的技术和科学术语的含义相同。

一方面，本发明提供一种式I所示的化合物或其立体异构体、溶剂化物、水合物、前药、稳定的同位素衍生物以及药学上可接受的盐在制备抑制猫冠状或杯状病毒复制的抑制剂中的应用；

其中，

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在某些实施方式中，所述式I所示的化合物选自如下任一种：

另一方面，本发明提供一种式I所示的化合物或其立体异构体、溶剂化物、水合物、前药、稳定的同位素衍生物以及药学上可接受的盐在制备治疗和/或预防、缓解由猫冠状或杯状病毒感染引起的相关疾病的药物中的应用；

其中，

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在某些实施方式中，所述式I所示的化合物选自如下任一种：

在某些实施方式中，所述猫冠状或杯状病毒感染引起的相关疾病选自猫传染性腹膜炎和猫口炎。

另一方面，本发明提供一种含有式I所示的化合物或其立体异构体、溶剂化物、水合物、前药、稳定的同位素衍生物以及药学上可接受的盐的组合物在制备抑制猫冠状或杯状病毒复制的抑制剂中的应用；

其中，

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在某些实施方式中，所述式I所示的化合物选自如下任一种：

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另一方面，本发明提供一种含有式I所示的化合物或其立体异构体、溶剂化物、水合物、前药、稳定的同位素衍生物以及药学上可接受的盐的组合物在制备治疗和/或预防、缓解由猫冠状或杯状病毒感染引起的相关疾病的药物中的应用；

其中，

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在某些实施方式中，所述式I所示的化合物选自如下任一种：

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在某些实施方式中，所述猫冠状或杯状病毒感染引起的相关疾病选自猫传染性腹膜炎和猫口炎。

在某些实施方式中，所述药物组合物，包括至少一种前述化合物或其立体异构体、溶剂化物、水合物、前药、稳定的同位素衍生物及药学上可接受的盐，以及药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。

在某些实施方式中，所述的药物组合物还含有选自下组的其他抗病毒药：PF-07321332(Nirmatrelvir)、S-217622(Ensitrelvir)、FHPI(4-[4-(4-氟苯基)-5-吡啶-4-基-1,3-二氢-咪唑-2-亚基]环己-2,5-二烯-1-酮)、阿洛司他丁(Aloxistatin)、考尼伐坦(Conivaptan)、法匹拉韦(favipiravir)、Galidesivir、、NHC(EIDD-1931)、EIDD-2801、GC-376、洛匹那韦(Lopinavir)、利托那韦(Ritonavir)、奈非那韦(Nelfinavir)；氯喹(Chloroquine)、羟氯喹(hydroxychloroquine)、环孢菌素(cyclosporine)、可利霉素(Carrimycin)、黄芩苷(baicalin)、黄芩素(baicalein)、连翘脂苷(forsythoside)、绿原酸(chlorogenic acid)、大黄素(emodin)、霉酚酸(mycophenolic acid)、霉酚酸酯(Mycophenolate mofetil)、萘酚喹(Naphthoquine)、环索奈德(Ciclesonide)、利巴韦林(Ribavirin)、喷昔洛韦(Penciclovir)、来氟米特(Leflunomide)、特立氟胺(Teriflunomide)、萘莫司他(nafamostat)、硝唑尼特(nitazoxanide)、达芦那韦(Darunavir)、阿比多尔(Arbidol)、卡莫司他(Camostat)、氯硝柳胺(Niclosamide)、巴瑞替尼(baricitinib)、芦可替尼(Ruxolitinib)、达沙替尼(Dasatinib)、沙奎那韦(Saquinavir)、Beclabuvir、司美匹韦(Simeprevir)、帕利珠单抗、莫维珠单抗(Motavizumab)、RSV-IGIV MEDI557、A-60444(RSV-604)、MDT-637、BMS-433771、或其药学上可接受的盐、或其组合。

在某些实施方式中，所述的药物组合物还含有选自下组的其他抗病毒药：PF-07321332(Nirmatrelvir)、S-217622(Ensitrelvir)、FHPI(4-[4-(4-氟苯基)-5-吡啶-4-基-1,3-二氢-咪唑-2-亚基]环己-2,5-二烯-1-酮)、阿洛司他丁(Aloxistatin)、考尼伐坦(Conivaptan)、法匹拉韦(favipiravir)、NHC(EIDD-1931)、EIDD-2801、黄芩苷(baicalin)、黄芩素(baicalein)、连翘脂苷(forsythoside)、绿原酸(chlorogenic acid)、大黄素(emodin)、甘草酸(glycyrrhizic acid)、氯喹(Chloroquine)、羟氯喹(hydroxychloroquine)、奈非那韦(Nelfinavir)。

在某些实施方式中，所述的药物组合物还含有选自下组的其他抗病毒药：干扰素、RNA依赖的RNA聚合酶抑制剂(如法匹拉韦(favipiravir)、Galidesivir、NHC(EIDD-1931)、EIDD-2801)、3CL蛋白酶抑制剂(如GC-376)、洛匹那韦(Lopinavir)、利托那韦(Ritonavir)、奈非那韦(Nelfinavir)、S-217622(Ensitrelvir)、PF-07321332(Nirmatrelvir)；氯喹(Chloroquine)、羟氯喹(hydroxychloroquine)、环孢菌素(cyclosporine)、可利霉素(Carrimycin)、黄芩苷(baicalin)、黄芩素(baicalein)、连翘脂苷(forsythoside)、绿原酸(chlorogenic acid)、大黄素(emodin)、霉酚酸(mycophenolica cid)、霉酚酸酯(Mycophenolatemofetil)、萘酚喹(Naphthoquine)、环索奈德(Ciclesonide)、利巴韦林(Ribavirin)、喷昔洛韦(Penciclovir)、来氟米特(Leflunomide)、特立氟胺(Teriflunomide)、萘莫司他(nafamostat)、硝唑尼特(nitazoxanide)、达芦那韦(Darunavir)、阿比多尔(Arbidol)、卡莫司他(Camostat)、氯硝柳胺(Niclosamide)、巴瑞替尼(baricitinib)、芦可替尼(Ruxolitinib)、达沙替尼(Dasatinib)、沙奎那韦(Saquinavir)、Beclabuvir、司美匹韦(Simeprevir)、帕利珠单抗、莫维珠单抗(Motavizumab)、RSV-IGIVMEDI-557、A-60444(RSV-604)、MDT637、BMS-433771、FHPI(4-[4-(4-氟苯基)-5-吡啶-4-基-1,3-二氢-咪唑-2-亚基]环己-2,5-二烯-1-酮)、阿洛司他丁(Aloxistatin)、考尼伐坦(Conivaptan)或其药学上可接受的盐、或其组合。

在某些实施方式中，所述的药物组合物还含有选自下组的其他药物：锌(Zinc)、芬戈莫德(Fingolimod)、维生素C(Vitamin C)、奥美沙坦酯(Olmesartan Medoxomil)、缬沙坦(valsartan)、氯沙坦(Losartan)、沙利度胺(Thalidomide)、甘草酸(glycyrrhizic acid)、青蒿素(Artemisinin)、双氢青蒿素(dihydroartemisinin)、青蒿琥酯(Artesunate)、青蒿酮(Artemisone)、阿奇霉素(Azithromycin)、七叶皂苷(Escin)、萘普生(Naproxen)、或其组合。

在某些实施方式中，所述的药物组合物还含有选自下组的其他药物：(Y1)RNA复制酶抑制剂(如法匹拉韦(favipiravir)、Galidesivir、NHC、EIDD-2801)；(Y2)洛匹那韦(Lopinavir)；(Y3)利托那韦(Ritonavir)；(Y4)氯喹(Chloroquine)、羟氯喹(hydroxychloroquine)、或其药学上可接受的盐(如磷酸氯喹)、(Y5)奈非那韦(Nelfinavir)；(Y6)上述Y1～Y5的任意组合。

在某些实施方式中，所述的药物组合物还含有选自下组的其他药物：干扰素、RNA依赖的RNA聚合酶抑制剂(如法匹拉韦(favipiravir)、Galidesivir、NHC、EIDD-2801)；3CL蛋白酶抑制剂(如GC-376)、洛匹那韦(Lopinavir)、利托那韦(Ritonavir)、奈非那韦(Nelfinavir)；氯喹(Chloroquine)、羟氯喹、环孢菌素(cyclosporine)、可利霉素(Carrimycin)、黄芩苷(baicalin)、黄芩素(baicalein)、连翘脂苷(forsythoside)、绿原酸(chlorogenic acid)、大黄素(emodin)、霉酚酸(mycophenolic acid)、霉酚酸酯(Mycophenolate mofetil)、萘酚喹(Naphthoquine)、环索奈德(Ciclesonide)、利巴韦林(Ribavirin)、喷昔洛韦(Penciclovir)、来氟米特(Leflunomide)、特立氟胺(Teriflunomide)、萘莫司他(nafamostat)、硝唑尼特(nitazoxanide)、达芦那韦(Darunavir)、阿比多尔(Arbidol)、卡莫司他(Camostat)、氯硝柳胺(Niclosamide)、巴瑞替尼(baricitinib)、芦可替尼(Ruxolitinib)、达沙替尼(Dasatinib)、沙奎那韦(Saquinavir)、Beclabuvir、司美匹韦(Simeprevir)、帕利珠单抗、莫维珠单抗(Motavizumab)、RSV-IGIVMEDI557、A-60444(RSV-604)、MDT-637、BMS-433771或其药学上可接受的盐、或其组合。所述干扰素包括干扰素α-2a、干扰素α-2b、干扰素α-n1、干扰素α-n3、干扰素β-1a、干扰素β-1b中的一种或多种。

在某些实施方式中，所述的药物组合物还含有选自下组的其他药物：例如，应用“抗炎信号转导调节剂”(在本文中被称为AISTM)比如磷酸二酯酶抑制剂(例如PDE-4、PDE-5或PDE-7特异的)、转录因子抑制剂(例如通过IKK抑制阻断NFκB)或激酶抑制剂(例如阻断P38MAP、JNK、PI3K、EGFR或Syk)，是切断炎症的合乎逻辑的方法，因为这些小分子的目标是有限数量的常见细胞内路径-是抗炎治疗干预的关键点的那些信号转导路径(参见，由P.J.Barnes,2006综述)。这些非限制性的额外的治疗剂包括：5-(2,4-二氟-苯氧基)-1-异丁基-1H-吲唑-6-甲酸(2-二甲基氨基-乙基)-酰胺(P38Map激酶抑制剂ARRY-797)；3-环丙基甲氧基-N-(3,5-二氯-吡啶-4-基)-4-二氟甲氧基-苯甲酰胺(PDE-4抑制剂罗氟司特)；4-[2-(3-环戊氧基-4-甲氧基苯基)-2-苯基-乙基]-吡啶(PDE-4抑制剂CDP-840)；N-(3,5-二氯-4-吡啶基)-4-(二氟甲氧基)-8-[(甲基磺酰基)氨基]-1-二苯并呋喃甲酰胺(PDE-4抑制剂奥米斯特)；N-(3,5-二氯吡啶-4-基)-2-[1-(4-氟苄基)-5-羟基-1H-吲哚-3-基]-2-氧代-乙酰胺(PDE-4抑制剂AWD12-281)；8-甲氧基-2-三氟甲基-喹啉-5-甲酸(3,5-二氯-1-氧基-吡啶-4-基)-酰胺(PDE-4抑制剂Sch351591)；4-[5-(4-氟苯基)-2-(4-甲亚磺酰基-苯基)-1H-咪唑-4-基]-吡啶(P38抑制剂SB-203850)；4-[4-(4-氟-苯基)-1-(3-苯基-丙基)-5-吡啶-4-基-1H-咪唑2-基]-丁-3-炔-1-醇(P38抑制剂RWJ-67657)；4-氰基-4-(3-环戊氧基-4-甲氧基-苯基)-环己烷甲酸2-二乙基氨基-乙酯(西洛司特的2-二乙基-乙酯前药、PDE-4抑制剂)；(3-氯-4-氟苯基)-[7-甲氧基-6-(3-吗啉-4-基-丙氧基)-喹唑啉-4-基]-胺(吉非替尼，EGFR抑制剂)；和4-(4-甲基-哌嗪-1-基甲基)-N-[4-甲基-3-(4-吡啶-3-基-嘧啶-2-基氨基)-苯基]-苯甲酰胺(伊马替尼，EGFR抑制剂)。

在某些实施方式中，所述的药物组合物的单位剂量为0.001mg-1000mg。

在某些实施方式中，基于组合物的总重量，所述的药物组合物含有0.01％-99.99％的前述化合物。在某些实施方式中，所述的药物组合物含有0.1％-99.9％的前述化合物。在某些实施方式中，所述的药物组合物含有0.5％-99.5％的前述化合物。在某些实施方式中，所述的药物组合物含有1％-99％的前述化合物。在某些实施方式中，所述的药物组合物含有2％-98％的前述化合物。

在某些实施方式中，基于组合物的总重量，所述的药物组合物含有0.01％-99.99％的药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。在某些实施方式中，所述的药物组合物含有0.1％-99.9％的药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。在某些实施方式中，所述的药物组合物含有0.5％-99.5％的药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。在某些实施方式中，所述的药物组合物含有1％-99％的药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。在某些实施方式中，所述的药物组合物含有2％-98％的药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。

本发明所涉及的全部化合物及包含本发明化合物的混合物、组合物等，可以经任一给药途径给予到生物体内。给药途径可以是口服给药，静脉注射，肌肉注射，皮下注射，直肠给药，阴道给药，舌下含化，鼻腔吸入，口腔吸入，滴眼，也可局部或全身经皮给药。

本发明所涉及的全部化合物及包含本发明化合物的混合物、组合物等，可以配制成单一剂量，其中含有本发明的活性化合物以及载体、赋形剂等，给药剂型可以是片剂，胶囊剂，注射剂，颗粒剂，粉剂，栓剂，丸剂，乳膏剂，糊剂，凝胶剂，散剂，口服溶液，吸入剂，混悬剂，干悬剂，贴剂，洗剂等。这些剂型中可以含有药物制剂常用的成分，例如稀释剂，吸收剂，润湿剂，粘合剂，崩解剂，着色剂，pH调节剂，抗氧剂，抑菌剂，等渗调节剂，抗粘剂等。

上述各类剂型的合适配方可从公开途径获得，例如Remington：The Science andPractice of Pharmacy,第21版，Lippincott Williams&Wilkins于2006年出版和Rowe,Raymond C.Handbook ofPharmaceutical Excipients,Chicago,Pharmaceutical Press于2005年出版.因此本领域的技术人员可以容易的制备。

根据不同个体所患疾病的性质，强度，年龄、性别、体重，给药途径等因素，可以选择不同的给药剂量，本发明的化合物的给药剂量可以为每日0.01至500mg/kg,优选每日剂量为1-100mg/kg，可单次或多次给药。

术语解释：

除非有相反陈述，在说明书和权利要求书中使用的术语具有下述含义。

术语“C

术语“C

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环烷基可以是取代的或非取代的，当被取代时，其可以在任何可使用的连接点上被取代，所述取代基优选独立地任选选自卤素、烷基、烷氧基、卤代烷基、卤代烷氧基、环烷基氧基、杂环基氧基、羟基、羟烷基、氰基、氨基、硝基、环烷基、杂环基、芳基和杂芳基中的一个或多个取代基。

术语“C

术语“卤素”指氟、氯、溴或碘。

术语“羟基”指-OH。

术语“氨基”指-NH

术语“氰基”指-CN。

术语“取代的”指基团中的一个或多个氢原子，优选为最多5个，更优选为1～3个氢原子彼此独立地被相应数目的取代基取代。不言而喻，取代基仅处在它们的可能的化学位置，本领域技术人员能够在不付出过多努力的情况下确定(通过实验或理论)可能或不可能的取代。例如，具有游离氢的氨基或羟基与具有不饱和(如烯属)键的碳原子结合时可能是不稳定的。

本发明所述化合物的化学结构中，键

术语“立体异构体”是指具有相同化学构造，但原子或基团在空间上排列方式不同的化合物。立体异构体包括对映异构体、非对映异构体、构象异构体(旋转异构体)、几何(顺/反)异构体、阻转异构体，等等。

术语“同位素衍生物”指结构不同仅在于存在一种或多种同位素富集原子的化合物。例如，具有本发明的结构，用“氘”或“氚”代替氢，或者用

术语“药学上可接受的盐”表示本发明的化合物以它们的药用盐的形式存在，包括酸加成盐和碱加成盐。药学上可接受的盐在S.M.Berge在J.Pharmaceutical Sciences(66卷:1-19页,1977年)中描述的pharmaceutically salts中有所描述。在本发明中，药学上可接受的无毒的酸加成盐表示本发明中的化合物与有机或无机酸形成的盐，有机或无机酸包括但不限于盐酸，硫酸，氢溴酸，氢碘酸，磷酸，硝酸，高氯酸，乙酸，草酸，马来酸，富马酸，酒石酸，苯磺酸，甲磺酸，水杨酸，琥珀酸，柠檬酸，乳酸，丙酸，苯甲酸，对甲苯磺酸，苹果酸等。药学上可接受的无毒的碱加成盐表示本发明中的化合物与有机或无机碱所形成的盐，包括但不限于碱金属盐，例如锂，钠或钾盐；碱土金属盐，例如钙或镁盐；有机碱盐，例如通过与含N基团的有机碱形成的铵盐或N

术语“溶剂化物”是指本发明的化合物与一种或多种，优选地为1-3种，无论是有机的还是无机的溶剂分子的物理结合。该物理结合包括氢键。在某些情况下，例如，当在结晶固体的晶格中掺入一种或多种，优选1-3种溶剂分子时，溶剂化物将被分离。示例性的溶剂化物包括但不限于水合物、乙醇化物、甲醇化物和异丙醇化物。溶剂化方法是本领域公知的。

术语“前药”是指可以在生理条件下，例如通过在血液中水解，在体内转化以产生活性原药化合物。

术语“药物组合物”表示含有一种或多种本文所述化合物或其生理学上/可药用的盐或前体药物与其他化学组分的混合物，以及其他组分例如生理学/可药用的载体和赋形剂。药物组合物的目的是促进对生物体的给药，利于活性成分的吸收进而发挥生物活性。

以上对本发明的涉及的术语进行了定义，本领域技术人员还可以结合现有技术对以上术语进行理解，以下基于本发明的内容以及对术语的定义进一步进行描述。

以下结合实施例进一步描述本发明所述的化合物、可药用盐的制备，但这些实施例并非限制本发明中的范围。

本发明中实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照原料或商品制造厂商所建议的条件。未注明具体来源的试剂，为市场购买的常规试剂。

实施例1：化合物6的制备

本发明化合物6通过WO2021213288A1中说明书记载的相关化合物A50的合成方法制备得到。

实施例2：化合物25的制备

化合物GS-441524(CAS RN：1191237-69-0，85mg，0.292mmol)加入到N,N-二甲基甲酰胺中，加入羰基二咪唑(48mg，0.292mmol)，室温下搅拌。15分钟后，向反应液中加入水和乙酸乙酯，分出有机相，饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，硅胶柱层析分离(二氯甲烷：甲醇＝20：1)，得化合物25，白色固体19mg，收率21％。

实施例3：化合物27的制备

本发明化合物27通过WO2021213288A1中说明书记载的相关化合物A131的合成方法制备得到。

实施例4：化合物42的制备

本发明化合物42通过WO2021213288A1中说明书记载的相关化合物A151的合成方法制备得到。

实施例5：化合物4的制备

本发明化合物4通过WO2021213288A1中说明书记载的相关化合物A9的合成方法制备得到。

实施例6：化合物11的制备

本发明化合物11通过WO2021213288A1中说明书记载的相关化合物A70的合成方法制备得到。

实施例7：化合物20的制备

本发明化合物20通过WO2021213288A1中说明书记载的相关化合物A124的合成方法制备得到。

实施例8：化合物29的制备

本发明化合物29通过WO2021213288A1中说明书记载的相关化合物A138的合成方法制备得到。

实施例9：化合物40的制备

将化合物4(2g，6.84mmol)和4-二甲氨基吡啶(83mg，0.68mmol)溶于N,N-二甲基乙酰胺(20mL)中，冰水浴下，缓慢滴入乙酸酐(2.16g，21.20mmol)，升至室温反应1h，TLC监控原料反应完全。反应液中加水和乙酸乙酯，搅拌、静置、分层，有机相依次用0.1％的稀盐酸和饱和碳酸氢钠溶液洗涤，无水硫酸钠干燥、过滤、浓缩，经柱层析纯化得化合物40，泡沫状固体2.16g，收率76％。

实施例10：化合物52的制备

将化合物4(2g，6.84mmol)分散于四氢呋喃(20ml)中，升温至60℃，缓慢加入N,N-二甲基甲酰胺二甲基缩醛(3.67g，30.79mmol)，保温反应4h，TLC显示原料反应完全，反应液浓缩干得中间体52-1，油状物，该中间体不经分离直接进行下一步反应。

将上步得到的中间体52-1和4-二甲氨基吡啶(167mg，1.37mmol)溶于二氯甲烷(20mL)中，冰水浴下缓慢滴入乙酸酐(908mg，8.89mmol)，恢复至室温反应1h，TLC监控原料反应完全。向反应液加入水和乙酸乙酯，搅拌、静置、分液，水相用乙酸乙酯反萃，合并有机相，依次用0.1％的稀盐酸和饱和碳酸氢钠溶液洗涤，无水硫酸钠干燥、过滤、浓缩得化合物52-2，油状物，该中间体不经分离直接进行下一步反应。

将上步得到的中间体52-2溶于乙酸(6mL)和乙醇(20mL)中，升温至60℃反应过夜，TLC监控原料反应完全。反应液中加入饱和碳酸氢钠至碱性，乙酸乙酯萃取，合并有机相，用无水硫酸钠干燥、浓缩、二氯甲烷打浆，过滤，50℃烘干得化合物52，类白色固体510mg，收率22％。

实施例11：化合物32的制备

参考化合物52的合成方法，以化合物4(525mg，1.8mmol)为原料，得产物32，白色固体124mg，收率47％。

实施例12：化合物53的制备

室温下，将化合物4(1.01g，3.46mmol)加入到吡啶(40mL)中，加入N，N-二甲基甲酰胺二甲缩醛(1.66g，13.95mmol)，搅拌；约16小时后，反应结束，旋干溶剂得到化合物53-1，油状物，该中间体不经分离直接用于下一步反应；

室温下，将上步反应得到的中间体53-1加到吡啶(40mL)中，加入4-二甲氨基吡啶(48mg，0.39mmol)，加入异丁酸酐(826mg，5.23mmol)，搅拌5小时后，加入甲醇，搅拌30min，旋干溶剂得化合物53-2，油状物，该中间体不经分离直接用于下一步反应；

冰浴下，将上步反应得到的中间体53-2加到四氢呋喃(30mL)中，再加入羰基二咪唑(2.07g，12.7mmol)，搅拌，撤去冰浴；约12小时后，反应结束，旋干反应液得到化合物53-3，油状物，该中间体不经分离直接用于下一步反应；

50℃下，将上步反应得到的中间体53-3加入80％的冰醋酸-乙醇(50mL)溶液中，搅拌；约2小时后，反应结束，浓缩反应液，加入碳酸氢钠饱和水溶液，乙酸乙酯萃取，加入饱和氯化钠溶液，加入无水硫酸钠，抽滤、旋干，硅胶柱色谱纯化，得化合物53，白色固体583mg，收率43％。

实施例13：本发明化合物病毒抑制活性测定：

取生长状态良好的CRFK细胞，接种于96孔板上，当细胞生长到80％-90％融合时，向每孔中加入0.1MOI猫冠状病毒(FIPV)以及不同浓度的测试化合物，同时设置细胞对照和病毒对照，所有孔中含有1％的DMSO。37℃孵化72h后，细胞使用CellTiter-Glo发光法细胞活力检测试剂(Promega,Madison,WI,USA)处理，使用GraphPadprism 7软件计算化合物对病毒抑制的半数有效浓度(EC

表1本发明化合物体外对猫传染性腹膜炎病毒(FIPV)的抑制活性

从表1中可见，本发明的化合物，尤其是6、11、20和53均能在体外抑制猫传染性腹膜炎病毒(FIPV)的复制。

实施例14：大鼠体内的药代动力学评价

雄性SD大鼠，实验前禁食(静脉组不禁食)，自由饮水，给药后2h统一进食。化合物4静脉注射给药剂量为2.0mg/kg(n＝3)，灌胃给药剂量为10.0mg/kg(n＝3)，化合物53静脉注射给药剂量为5.0mg/kg(n＝3)，灌胃给药剂量为20.0mg/kg(n＝3)，给药溶媒为5％DMSO+5％enthanol+40％PEG300+50％saline。于给药后在不同时间点经颈静脉取血0.2mL，置肝素钠抗凝管中，轻轻混匀，2000g离心10min，分离血浆，于–70℃冰箱中冷冻待测。采用LC-MS-MS法测定血浆中核苷(化合物4)的浓度，计算药动学参数，结果见表2。

表2：化合物4和化合物53单次静脉注射给药和单次口服给药大鼠体内核苷(化合物4)的药动学参数

由表2可知，化合物53灌胃给药，核苷代谢产物在大鼠体内的暴露量高，口服生物利用度为71.8％，显著高于化合物4的口服生物利用度。

实施例15：猫体内的药代动力学评价

6只雄性家猫，分为2组，给药前一晚禁食过夜。用异氟烷，5VOL％/L/min速度吸入麻醉，动物进入麻醉第Ⅲ期后将家猫左后腿被毛剃掉，于后肢隐静脉处插入留置针(用于抽血)。化合物6和化合物27分别按10mg/kg和16mg/kg灌胃给药，各3只动物，化合物溶媒为5％ethanol+30％propylene glycol+45％PEG 400+20％water，给药后将家猫俯卧位固定于手术台以方便后续采血。灌胃给药后于15min，30min，1h，2h，4h，6h，8h，24h采集静脉血0.5-1mL，取200μL全血样本在4℃，3000rpm，离心10分钟，取上清液50μL加入甲醇150μL，涡旋，14800rpm，4℃离心10min，在-80℃保存。采用LC-MS-MS法测定血浆中核苷代谢物(GS-441524)的浓度，计算药动学参数，结果见表3。

表3：化合物6和化合物27单次口服给药大鼠体内核苷(GS-441524)的药动学参数

由表3可知，化合物6按10mg/kg灌胃给药，动物血浆中核苷代谢物的C

应当理解，以上实施例均为示例性的，不用于包含权利要求所包含的所有可能的实施方式。在不脱离本公开的范围的情况下，还可以在以上实施例的基础上做出各种变形和改变。同样的，也可以对以上实施例的各个技术特征进行任意组合，以形成可能没有被明确描述的本发明的另外的实施例。因此，上述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，不对本发明专利的保护范围进行限制。