用于快速诊断川崎病的分子生物标志物和分析方法

本申请是2023年5月16日提交的题为“用于快速诊断川崎病的分子生物标志物和分析方法”的中国专利申请202310544514.2的分案申请。

技术领域

本发明涉及生物标志物组合和表征方法，用于在临床环境中诊断川崎病(KD)。具体而言，本发明声称使用RNA/DNA分子生物标志物及其拷贝数(浓度)的组合来得出KD得分，以辅助诊断、预后、风险评估和KD的治疗/监测。更具体地说，这些生物标志物表征试剂，如引物和聚合酶，将与测试系统，例如Applied Biosystems QuantStudio 6一起打包在套件中，该测试系统可以测量生物标志物的浓度，生成KD得分，以区分KD与其他发热性儿科症状。

背景技术

川崎病(KD)是一种罕见的儿童急性炎症性疾病，与血管炎和持续发热有关。KD是美国儿童获得性心脏病的主要原因，KD在发展中国家有明显增加的趋势。如果不及时治疗，会发生严重的并发症，大约25％的儿童会患冠状动脉损伤。KD死亡率很低，然而，由于受损动脉的血管重构，狭窄性病变可能会晚期发展。长期结果研究表明，初期因KD患冠状动脉瘤的50％的儿童需要再血管化手术或有心肌梗死的高风险。

KD的病因目前尚不清楚。然而，广泛认为它是特定遗传易感个体对感染因子异常和持续的免疫反应。不幸的是，到目前为止还没有确定一致的感染因子，进一步增加了诊断困难。此外，还观察到不同的KD族群分布。KD在东亚地区发病率最高，日本每150个儿童中就有1个受影响，它约占韩国儿童住院的1-2％。在白种人人口中，KD显著较低，患病率为9-17/10万人，而在5岁以下儿童中，日本的患病率为265/10万人。其他亚洲国家的平均患病率为51-194/10万人。

目前，KD的诊断主要依靠临床症状，目前没有可用的客观分子检测辅助诊断。由于KD具有许多儿童常见的自限性发热疾病的症状和特征，例如发热、皮疹、粘膜表现、淋巴结肿大和炎症等，因此临床诊断很困难。约15％至36.2％的KD病例被认为是不完全KD，不显示完整的临床特征，根据美国心脏协会的标准，缺少四个以上的KD临床表现，这会严重影响诊断的准确性。对于表现为“不完全”KD且未达到全部临床标准的患者，及时诊断至关重要。在发热发作后十天内进行早期诊断和治疗，使用静脉免疫球蛋白(IVIG)可显著降低冠状动脉疾病的发生率，从而减少永久性心脏损伤和冠状动脉瘤的风险。

对于许多临床医生来说，及时识别、诊断和治疗通常是具有挑战性的。对于那些不熟悉或对复杂临床算法感到困惑的医生，根据持续发热和临床标准进行KD诊断的指南常常会延误诊断。此外，目前没有临床有用且易于获取的客观分子生物标志物测试，以帮助医生诊断KD。因此，迫切需要一种基于血液生物标志物的客观检测方法，以帮助医生识别不符合全部临床标准但需要治疗以预防心血管损伤的KD患者。

我们通过GEO、文献和多重蛋白质平台等研究了与川崎病相关的潜在分子生物标志物(图1)。我们筛选出了61个候选基因，包括ABCC1、ADM、C10ORF59、C1S、CAMK4、CD274、CD55、CD59、CLEC4D、CR1、CRTAM、CTGF、FCGR1B、FKBP1A、FKBP5、FKBP6、FUT7、IFI30、LCN2、LGALS2、LILRA5、MAPK14、MMP8、MPO、MYD88、NKTR、NOTCH4、OLFM4、PCOLCE2、PPARG、PVRL2、S100A12、S100A8、S100A9、SLC11A1、SLC11A2、TLR7、TREML4、VEGFA、HGF、ZBTB20、CASP5、CACNA1E、CLIC3、IFI27、KLHL2、PYROXD2、RTN1、S100P、SMOX、ZNF185、C11ORF82、PlGF、CXCL16、OSM、NPPB、TNFSF14、CXCL6、CKM、CKB、IL1R1。我们使用定量聚合酶链式反应(qPCR)平台和测定系统，例如Applied Biosystem QuantStudio、7500实时PCR系统或Bio-Rad CFX系统，来测定这些生物标志物在样品中的RNA拷贝数。然后，基于这些关键生物标志物的RNA拷贝，我们开发了KD诊断模型和KD得分，能够将KD与其他发热患者区分开来。

发明内容

本发明披露了使用血液/血浆/血清蛋白生物标志物进行KD的诊断、风险评估和治疗/监测的方法。特别是，发明人发现并使用了一组基因生物标志物(RNA、DNA或蛋白质)来计算KD风险得分，可用于诊断、确定风险、监测KD治疗以及将KD与其他发热性疾病区分开来。生物标志物可以使用适当的检测系统(例如应用生物系统QuantStudio、7500实时PCR系统或Bio-Rad CFX系统)的套件来确定，以确定RNA拷贝数以推导出可单独使用或与其他KD临床标准结合使用的KD得分以确定和确认KD诊断。

RNA/DNA生物标志物的浓度，例如但不限于ABCC1、ADM、C10ORF59、C1S、CAMK4、CD274、CD55、CD59、CLEC4D、CR1、CRTAM、CTGF、FCGR1B、FKBP1A、FKBP5、FKBP6、FUT7、IFI30、LCN2、LGALS2、LILRA5、MAPK14、MMP8、MPO、MYD88、NKTR、NOTCH4、OLFM4、PCOLCE2、PPARG、PVRL2、S100A12、S100A8、S100A9、SLC11A1、SLC11A2、TLR7、TREML4、VEGFA、HGF、ZBTB20、CASP5、CACNA1E、CLIC3、IFI27、KLHL2、PYROXD2、RTN1、S100P、SMOX、ZNF185、C11ORF82、PlGF、CXCL16、OSM、NPPB、TNFSF14、CXCL6、CKM、CKB、IL1R1，这些生物标志物在血液/血浆/血清中组合出现与KD的发展和诊断有关，利用定量PCR系统(例如应用生物系统QuantStudio、7500实时PCR系统或Bio-Rad CFX系统)测量血液生物标志物拷贝数精确分离KD患者与其他发热患者(图1)。

本发明揭示了一种使用生物标志物的方法，可在本发明实践中使用，包括来自生物标志物的蛋白质生物标志物或RNA/DNA序列，包括但不限于IFI27，C19ORF59，CACNA1E，CASP5，CR1，CLIC3，CRTAM，FKBP5，HGF，IL1RL1，KLHL2，MAPK14，NKTR，SLC11A1，S100A12，S100A9，TLR7和ZHF185等。

在某些实施例中，使用这些生物标志物的组合组用于诊断KD。KD诊断的生物标志物组可以包括至少2个生物标志物(一对)和最多18个生物标志物(9对基因)的完整组，如上所述。这将包括上述第1段描述的任何生物标志物的任何组合，其中至少包括2个，4个，6个，8个，10个，12个，14个，16个和18个生物标志物。较小的生物标志物组合组足以区分KD和其他发热疾病，并且更经济实惠。但是，较大的组可能提供更详细的信息，并且可以在不同的区域人群中用于本发明的实践。

在二元得分系统中，基于计算KD得分的方法用于区分患者和其他发热疾病。低KD得分表示患者不太可能患有KD。高KD得分表示患者很可能患有KD(规则)。

基于上述生物标志物和方法计算KD得分，并确定具有三个不同范围的KD风险的风险确定KD的方法。低于低分截断值的低KD风险表示患者患KD的风险很低。高于高分截断值的高KD风险表示患者患KD的风险很高。在低和高KD得分截断值之间的得分表示中等KD风险。

在某些情况下，临床参数与本文中描述的生物标志物结合使用来诊断KD。例如，本发明包括一种用于确定疑似患有KD的患者的KD得分的方法，该患者连续发烧5天。该方法包括根据患者的标准护理测量至少七个临床参数，包括发热持续时间、血液中血红蛋白浓度、血液中C-反应蛋白浓度、白细胞计数、血液中嗜酸性粒细胞百分比、血液中单核细胞百分比和血液中未成熟中性粒细胞百分比。

KD得分可以通过几何平均值、多元线性判别分析(LDA)或分布式梯度提升决策树(GBDT)机器学习，例如XGBoost，从所测量的血液生物标志物值中计算出来。在二元模型中，可以从生物标志物组合或配对中得出受试者工作特征(ROC)曲线。然后，可以通过本文所述的方法将KD得分分类为低风险KD临床得分、中危险KD临床得分或高风险KD临床得分。

在另一个方面，本发明包括使用所述的生物标志物组合和计算KD得分的方法和程序来诊断患有KD的患者的方法。该方法包括：1)从患者中获取生物样品，2)测量生物样品中每个生物标志物的RNA/DNA拷贝数或浓度，3)将每个生物标志物的水平与生物标志物的相应参考值范围进行比较。参考值范围可以代表来自无KD的受试者的一个或多个样品的生物标志物的水平(即正常样品)，或代表来自一个或多个患有KD的一个或多个受试者的生物标志物的水平。生物标志物组合的血液生物标志物的差异水平与对照组主体的生物标志物的参考值相比，表明患者患有KD。在一种实施例中，该方法还包括计算KD得分的方法，以区分患者的发热疾病是否为KD。

生物标志物可以通过使用特定引物和报告系统来测量，以确定上述生物标志物和方法中生物标志物的拷贝数。例如，但不限于，执行定量PCR分析(qPCR)、反转录定量PCR(RT-qPCR)、基因微阵列、RNA或DNA测序(RNAseq/DNAseq)、夹心试验、磁性捕获、微球捕获、电泳印迹、表面增强拉曼光谱(SERS)、流式细胞术或质谱分析等方法，以确定这些生物标志物的拷贝数。在某些实施例中，从特定DNA引物与生物标志物RNA的结合开始测量生物标志物的拷贝数，然后进行逆转录和聚合酶链式反应，以确定具有可检测的报告者(例如BYBR绿色染料等)的生物标志物的拷贝数。其中引物特异性地结合到生物标志物或其片段。

本发明还包括一种用于评估治疗患有KD患者的干预剂的疗效的方法。该方法包括：使用本文所述的生物标志物组从患者的样品中分析治疗前后每个生物标志物的拷贝数或浓度。可以通过相应的参考值范围和计算的KD得分来确定治疗的有效性。

特别地，本发明包括一种用于选择疑似患有KD的患者接受静脉免疫球蛋白(IVIG)治疗的方法，该过程包括：1)根据本文所述的方法对患者进行诊断；b)如果患者确诊KD，则选择该患者接受IVIG治疗。在另一实施例中，该方法包括1)确定患者的KD得分；并且b)根据包含本文所述的生物标志物组的表达谱的高危险区或中危险区的KD得分和确诊KD来选择患者接受IVIG治疗。

另一方面，本发明涉及一种用于治疗疑似患有KD的患者的方法，包括以下步骤：1)按照本文所述的方法对患者进行诊断或接收有关患者诊断的信息；以及2)对患者进行静脉免疫球蛋白(IVIG)治疗，如果患者确诊KD。在一方面，该方法包括1)确定患者的KD临床得分；以及2)如果患者具有高危KD临床得分或中等危险KD临床得分并且根据第1至11段的生物标志物组的表达谱确诊KD，则向受试者施用静脉免疫球蛋白(IVIG)的治疗有效剂量。

另一方面，本发明涉及用于定量qPCR系统(即用于测量样品中RNA/DNA生物标志物的系统)的试剂盒。该试剂盒可以包括用于容纳从疑似患有KD的人类患者采集和分离的生物样品的容器。该试剂盒至少包含一种用于测量KD生物标志物的试剂和印刷说明书，用于将试剂与生物样品或生物样品的一部分反应，以在生物样品中测量至少一个KD生物标志物。试剂可以包装在单独的容器中。该试剂盒还可以包括一种或多种控制参考样品和用于执行检测生物标志物复制数的qPCR的试剂，如本文所述。

另一方面，本发明涉及一种检测方法，包括：a)在从疑似患有KD的患者采集的血液、血浆或血清样品中测量生物标志物组(如本文所述)中每个生物标志物的拷贝数；并b)将每个生物标志物的测量值与控制受试者每个生物标志物的参考值进行比较，其中与参考值相比血液、血浆或血清样品中的生物标志物的差异表达表明患者患有KD。在一方面，该检测方法进一步包括根据患者的这些生物标志物浓度确定KD得分。

在某些情况下，通过引物靶向生物标志物的测量至少一种生物标志物，其中引物专门结合到生物标志物或生物标志物的一个片段，并通过PCR反应确定生物标志物的拷贝数。在某些实施方式中，引物是从生物标志物的编码区(外显子)序列中选择的。在一个案例中，至少选择一对引物从包括特异性结合到IFI27的引物对、特异性结合到C19ORF19的引物对、特异性结合到S100A12的引物对、特异性结合到S100A9的引物对、特异性结合到CACNA1E的引物对、特异性结合到SLC11A1的引物对、特异性结合到NKTR的引物对、特异性结合到CAMK4的引物对、特异性结合到CLIC3的引物对和特异性结合到LGALS2的引物对的群组中选择。

本发明提供用于测量选自以下生物标志物组的一种或多种川崎病生物标志物的量的检测试剂在制备用于确定受试者川崎病生物标志物水平呈现的试剂盒中的用途，其特征在于，所述川崎病生物标志物组包括IFI27、C19ORF59、CACNA1E、CASP5、CR1、CLIC3、CRTAM、FKBP5、HGF、IL1RL1、KLHL2、MAPK14、NKTR、SLC11A1、S100A12、S100A9、TLR7和ZHF185中的一种或多种，所述确定受试者川崎病生物标志物水平呈现的方法包括：

a.评估来自受试者的样品中的一组川崎病生物标志物，所述样品为血液、血清或血浆，以确定样品中每个川崎病生物标志物的表达水平；

b.基于组中每个川崎病生物标志物的水平来获得川崎病生物标志物的水平表示。

在一些具体实施方案中，测量每个川崎病生物标志物的寡核苷酸的全长或其核苷酸序列、RNA或DNA水平。

在一些具体实施方案中，所述生物标志物表达水平以循环阈值C(t)表示。

在一些具体实施方案中，所述组包括C19ORF59和IFI27。

在一些具体实施方案中，所述组包括C19ORF59、IFI27、S100A12和S100A9。

在一些具体实施方案中，所述组包括C19ORF59、IFI27、S100A12、S100A9、CLIC3和SLC11A1。

在一些具体实施方案中，所述组包括C19ORF59、IFI27、S100A12、S100A9、CLIC3、SLC11A1、CACNA1E和LGALS2。

在一些具体实施方案中，所述组包括C19ORF59、IFI27、S100A12、S100A9、CLIC3、SLC11A1、CACNA1E、LGALS2、ABCC1和CAMK4。

在一些具体实施方案中，还包括提供川崎病生物标志物水平表示的报告。

在一些具体实施方案中，所述川崎病生物标志物水平呈现导出川崎病得分，其中所述川崎病得分：

a.从两个不同基因之间的循环阈值C(t)差异导出；

b.通过几何均值、多元线性判别分析(LDA)或分布式梯度增强决策树(GBDT)机器学习，从所测量的血液生物标志物的值导出；或

c.是每个生物标志物水平的倍数。

本发明提供一种诊断系统，包括试剂盒、试剂和从来自受试者的样品中产生川崎病得分的仪器，所述样品为血液、血清或血浆，其特征在于，包括：用于测量选自以下生物标志物组的一种或多种川崎病生物标志物的量的检测试剂，所述川崎病生物标志物组包括IFI27、C19ORF59、CACNA1E、CASP5、CR1、CLIC3、CRTAM、FKBP5、HGF、IL1RL1、KLHL2、MAPK14、NKTR、SLC11A1、S100A12、S100A9、TLR7和ZHF185中的一种或多种。

在一些具体实施方案中，进一步包括：

a.用于测量川崎病生物标志物的平台系统；

b.计算川崎病得分的计算表，以及

c.确定患者是否患有川崎病的指示。

在一些具体实施方案中，所述组包括C19ORF59和IFI27。

在一些具体实施方案中，所述组包括C19ORF59、IFI27、S100A12和S100A9。

在一些具体实施方案中，所述组包括C19ORF59、IFI27、S100A12、S100A9、CLIC3和SLC11A1。

在一些具体实施方案中，所述组包括C19ORF59、IFI27、S100A12、S100A9、CLIC3、SLC11A1、CACNA1E和LGALS2。

在一些具体实施方案中，所述组包括C19ORF59、IFI27、S100A12、S100A9、CLIC3、SLC11A1、CACNA1E、LGALS2、ABCC1和CAMK4。

本发明提供川崎病生物标志物组，其特征在于，包括选自IFI27、C19ORF59、CACNA1E、CASP5、CR1、CLIC3、CRTAM、FKBP5、HGF、IL1RL1、KLHL2、MAPK14、NKTR、SLC11A1、S100A12、S100A9、TLR7和ZHF185的一种或多种生物标志物。

在一些具体实施方案中，包括C19ORF59和IFI27。

在一些具体实施方案中，包括C19ORF59、IFI27、S100A12和S100A9。

在一些具体实施方案中，包括C19ORF59、IFI27、S100A12、S100A9、CLIC3和SLC11A1。

在一些具体实施方案中，包括C19ORF59、IFI27、S100A12、S100A9、CLIC3、SLC11A1、CACNA1E和LGALS2。

在本文所述的披露方案的技术领域内，对于这些和其他实施方案，对于技术人员而言会很容易想到。

附图说明

本发明的最佳理解方式是结合附带的表格和图示进行详细描述。专利或申请文件中至少包含一张图示。强调根据通常做法，图示的各个特征并非按比例尺绘制。相反，为了更清晰地呈现各个特征的尺寸，各个特征的尺寸是任意扩展或缩小的。

图1.KD病生物标志物的发现和验证过程。通过GEO分析、文献发现和多重Luminex蛋白生物标志物研究，最初确定潜在的分子生物标志物。在发现队列中，61个基因靶位被缩小到18个基因。最终组在一个KD(n＝80)和发热对照组(n＝80)的验证队列中得到验证。

图2为基于IFI27和C19ORF59的模型构建，其中a为组基于IFI27和C19ORF59的delta C(t)构建。利用qPCR仪器QuantStudio 6测量了各个生物标志物的血清拷贝数，使用相应的引物。b为该模型根据ROC分析获得AUC为0.930，最佳截断值为3.274。c为该模型在最佳截断值处的表现。

图3为基于截断值的风险预测，其中a为二个阈值和三个风险级别得分模型将队列人群分为高危、中间和低风险群体，实线为FC(Febrile controls，发烧但非KD)组，虚线为KD组。b为人群的分类基于风险得分系统。c为在最佳截断值4.958处，高危的阳性预测值(PPV)达到91.8％，风险得分低于3.558的低风险患者人群具有89.5％的阴性预测值(NPV)。

图4.根据KD风险分类对冠状动脉Z分数进行分类。我们的组捕获了大多数动脉瘤病例。该组还可识别具有正常或扩张冠状动脉的KD患者。

具体实施方式

提供了针对川崎病(KD)的生物标志物、KD生物标志物组以及获取样品的KD生物标志物水平表示的方法。这些组合物和方法在许多应用中都有用途，包括例如诊断KD、评估是否患有KD、监测患有KD的受试者以及确定治疗KD的方法。此外，还提供了用于实施所述方法的系统、装置和试剂盒。这些和其他本发明的目标、优点和特点将在下文更详细地描述这些组合物和方法的细节时，对于熟悉本领域技术的人员变得明显。

在描述当前的方法和组合物之前，需理解本发明不限于所描述的特定方法或组合物，因为它们当然可以变化。此外，本文所用术语仅用于描述特定实施方式的目的，不应限制本发明的范围，因为本发明的范围仅限于附加的权利要求所限制的范围。

除非另有定义，否则本文中使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域中普遍理解的相同含义。虽然任何与所描述的方法和材料相似或等效的方法和材料均可用于实施或测试本发明，但现在描述了一些可能的和首选的方法和材料。提到的所有出版物均被引用并并入此文中，以揭示和描述与所引用出版物有关的方法和/或材料。了解到本文披露的内容覆盖了任何与已并入的出版物的披露相矛盾的内容。

如对于本领域技术人员显然，所述的每个具体实施方式都具有离散的组件和特征，这些组件和特征可以轻松地与任何其他几个实施方式的特征分开或组合在一起，而不超出本发明的范围或精神。可以按照所述事件的顺序执行任何所述的方法，也可以在逻辑上可能的任何其他顺序中进行。

需要注意的是，在本文以及附加的权利要求中，单数形式“一个”、“一个”和“所述”包括复数指代，除非语境明确说明。因此，例如，“细胞”的引用包括多个这样的细胞，“RNA序列”的引用包括一个或多个肽和等效物，例如熟练者已知的多肽等，等等。

如上所述，本发明涉及用于提供Kawasaki病(KD)评估的方法、组合物、系统(例如AB QuantStudio 6等qPCR系统)和试剂盒，包括诊断、风险评估、监测和/或治疗主题中的KD。所谓的“Kawasaki病”或“KD”是指一种多系统炎症和发热病的并发症，可能伴随皮疹、手脚肿胀(水肿)、眼白红肿和发炎、颈部淋巴结肿大以及口腔、唇和喉部刺激和发炎。KD主要发生在5岁以下的儿童中，但大一点的儿童、青少年和成人仍然可能感染KD。如果在发热开始后10天内不加以处理，KD可能导致心血管疾病和动脉瘤。所谓的“诊断”KD或“提供KD诊断”，一般指提供KD的诊断，例如确定是否受KD影响(例如患有完整或不完整的KD症状的对象)；对主题的KD进行分类以确定其疾病或障碍的亚型；确定KD的严重程度等。所谓的“风险评估”KD或“提供KD风险评估作为临床征象之一”，一般指作为另一临床征象提供KD风险，例如在其他临床症状存在的情况下，对主题的风险或易感性进行诊断；评估疾病进展和/或疾病结果的风险；预测主题对KD治疗的反应，例如积极反应、消极反应、没有反应等。所谓的“监测”KD一般指监测主题的情况，例如为KD诊断提供信息，为KD预后/风险提供信息和其他临床征象一起，提供有关KD治疗效果或功效的信息等。所谓的“治疗”KD是指在哺乳动物中规定或提供KD的任何治疗方法，包括：(a)预防可能易感于KD但尚未被诊断出来的主题发生KD和相关的心血管事件；(b)抑制KD和心脏事件，即阻止其症状和心脏动脉瘤的发展；或(c)缓解KD，即使KD退化并降低心脏动脉。

在描述本发明时，首先将描述用于提供KD评估的组合物，然后是其使用的方法、系统和试剂盒。

川崎病生物标志物和组

在本发明的某些方面中，提供了川崎病生物标志物和川崎病生物标志物的组。所谓“川崎病生物标志物”，是指与川崎病表型相关的分子实体在样品中的表示。例如，川崎病生物标志物可能在一个个体的样品中与一个健康个体相比具有不同的表示(即在不同水平上表示)。在某些情况下，该生物标志物的升高水平，如C10ORF59，与川崎病表型相关。例如，在与川崎病表型相关的样品中，该生物标志物的RNA拷贝数可能比与川崎病表型不相关的样品高出1.5倍、2倍、2.5倍、3倍、4倍、5倍、7.5倍、10倍或更多。在其他情况下，该生物标志物的降低水平与川崎病表型相关，如IFI27。例如，在与川崎病表型相关的样品中，该生物标志物的RNA拷贝数可能比与川崎病表型不相关的样品低10％、20％、30％、40％、50％或更多。

川崎病生物标志物可能包括与川崎病相关的蛋白质和肽以及它们相应的遗传序列，即RNA、DNA等。所谓“基因”或“重组基因”，是指包括一个开放阅读框，用于编码蛋白质的核酸。

编码序列的边界由5'端(氨基)的起始密码子和3'端(羧基)的翻译终止密码子确定。转录终止序列可以位于编码序列的3'端。此外，基因可能可选地包括其自然启动子(即基因的外显子和内含子在非重组细胞中与之操作性连接的启动子，即自然存在的细胞)，以及相关的调节序列，可能具有在AUG起始位点上游的序列和/或不包括未翻译的前导序列、信号序列、下游未翻译序列、转录起始和终止序列、多聚腺苷酸信号、翻译起始和终止序列、核糖体结合位点等序列。

如本公开说明的实例所示，发明人已经确定了许多与KD相关的分子实体，并将它们组合使用(即作为一组)来提供KD评估，例如诊断KD、评估患KD的风险、监测患KD的受试者、确定治疗患KD的受试者等。其中包括但不限于IFI27、C19ORF59、CACNA1E、CASP5、CR1、CLIC3、CRTAM、FKBP5、HGF、IL1RL1、KLHL2、MAPK14、NKTR、SLC11A1、S100A12、S100A9、TLR7和ZHF185等。

此外，本文还提供了KD组。所谓的“KD生物标志物组”是指两个或两个以上的KD生物标志物，例如2、4、6、8、10、12、14、16和18个生物标志物，当将它们的水平(即拷贝数)结合起来考虑时，能够用于提供KD评估，例如进行KD诊断、风险评估、监测和/或治疗。特别重要的是包括IFI27、C19ORF59、S100A12、S100A9、CACNHA1E和CLIC3的组。例如，在某些实施例中，KD组可以包括C19ORF59和IFI27的ΔC(t)。

其他在本方法中作为KD组使用的KD生物标志物组可以由通常技术熟练者使用任何方便的统计方法容易确定，例如，如本文所知道的或在本文的工作实例中描述的。例如，可以通过组合遗传算法(GA)和全配对(AP)支持向量机(SVM)方法进行KD分类分析，自动确定预测特征，例如通过迭代GA/SVM，导致非冗余的KD相关分析物非常紧凑的集合，以获得最佳的分类性能。虽然不同的分类器集合通常只会拥有少量重叠的基因特征，但它们将具有与上述描述及在本文的工作实例中类似的提供KD评估的准确性水平。

方法

本发明在某些方面提供了获取受试者的KD生物标志物水平表示的方法。所谓的KD生物标志物水平表示，是指受试者生物样品中一个或多个KD生物标志物水平的表示，例如一个KD生物标志物组。术语“生物样品”包括从生物体中获取的各种样品类型，可用于诊断、预后或监测测定。该术语包括来自生物来源的血液和其他液态样品或其衍生物和其子代。该术语包括在采集后以任何方式经过处理的样品，例如通过试剂处理、溶解或富集某些组分等。该术语包括临床样品，也包括细胞上清、细胞裂解液、血清、血浆、生物体液和组织样品。用于本发明方法的临床样品可以从各种来源获得，特别是血液样品。

特别的，样品来源包括血液样品或其制备物，例如全血、血清或血浆。在许多实施例中，适用于人类样品的合适初始来源是血液样品。因此，用于受试者测定的样品通常是来自血液的样品。血液样品可以来源于全血或其一部分，例如血清、血浆等，在某些实施例中，样品来源于血液，让其凝结，将血清分离并收集以进行测定。

在某些实施例中，样品是血清或血清衍生的样品。可以采用任何方便的方法来制备流体血清样品。在许多实施例中，该方法采用皮肤穿刺(例如手指刺、静脉穿刺)抽取静脉血进入凝血或血清分离管，让血液凝结，离心血清离开凝固的血液。然后收集血清并保存直到进行测定。一旦获得了来自患者的样品，就可以对样品进行测定以确定KD生物标志物的水平。

主体样品通常是在患者持续反复发热的临床就诊期间从个体中获得的。川崎病最有可能发生在五岁以下的儿童，但它也可能发生在任何年龄段，包括青少年和成人。

一旦获得样品，可以直接使用、冷冻或在适当的培养基中短时间维持。通常，样品将来自人类患者，虽然动物模型也可能会被使用，例如：马、牛、猪、犬、猫、啮齿动物(如老鼠、大鼠、仓鼠)和灵长类动物等。任何方便的组织样品，只要在川崎病患者中表现出一种或多种此处披露的川崎病生物标志物的差异表达，都可以在本主题方法中进行评估。通常，合适的样品来源将源自能够分析所关注的分子实体(例如蛋白质、肽和RNA)已被释放的体液。

主体样品可能会通过多种方式进行处理，以增强一种或多种川崎病生物标志物的检测。例如，如果样品是血液，则在进行检测之前可以将红细胞从样品中去除(例如通过离心)。这种处理可以减少使用亲和试剂检测川崎病生物标志物水平的非特异性背景水平。使用在本领域中广为人知的程序(例如酸沉淀、酒精沉淀、盐沉淀、亲疏水性沉淀、过滤)可以浓缩样品以增强川崎病生物标志物的检测。在一些实施例中，测试和对照样品的pH值将被调整并维持在接近中性的pH值。这种pH值调整将防止复合物的形成，从而提供样品中生物标志物水平的更准确的定量。在样品是尿液的实施例中，将调整样品的pH值并浓缩样品以增强生物标志物的检测。

在实施本方法时，将个体生物样品中的KD生物标志物水平进行评估。可以使用任何方便的方法来评估样品中一个或多个KD生物标志物的水平。例如，可以通过测量一个或多个寡核苷酸的水平/数量来检测RNA生物标志物。可以通过测量一个或多个KD基因的核酸转录本(例如mRNA)的水平/数量来检测KD基因表达水平。术语“评估”、“检测”、“测量”、“评估”和“确定”可以互换使用，用于指任何形式的测量，包括确定元素是否存在以及包括定量和定性测量。评估可以是相对的或绝对的。

例如，可以通过检测样品中一个或多个RNA/DNA或其片段的数量或水平来评估至少一个KD生物标志物的水平，以获得拷贝数表示。本申请中使用的术语“RNA”和“核酸”是可以互换使用的。“寡核苷酸”指的是核酸聚合物(RNA或DNA序列)，而不是分子的特定长度。因此，RNA、DNA及其片段均包含在寡核苷酸的定义内。该术语还涵盖修改的寡核苷酸，例如甲基化的DNA、连接有荧光染料/猝灭剂的DNA、改性基RNA/DNA、DNA引物等。包括定义中的是包含一种或多种碱基类似物的寡核苷酸，具有替换的连接方式的寡核苷酸以及在自然界和非自然界中已知的其他修饰。

作为另一个例子，至少一个肾脏疾病生物标志物的水平可以通过检测患者样品中编码所需基因的一个或多个RNA转录本或其片段的数量或水平来评估，以得出核酸生物标志物的表达。可以使用任何方便的协议检测样品中的核酸水平。虽然已知许多不同的检测核酸的方法，例如在差异基因表达分析领域使用的方法，但生成生物标志物表达的代表性和便利类型的协议是基于阵列的基因表达分析协议。这些应用是杂交分析，其中使用显示要测量/分析的基因的“探针”核酸的核酸来生成生物标志物表达。在这些检测中，首先从进行检测的初始核酸样品中准备出靶标核酸样品，其中准备可能包括用标记物，例如信号产生系统中的成员，标记靶标核酸。在靶标核酸样品准备后，在杂交条件下将样品与阵列接触，从而形成与附着在阵列表面的探针序列互补的靶标核酸复合物。然后定性或定量地检测到杂交的复合物的存在。

用于生成所述方法所采用的生物标志物表征的具体杂交技术包括在美国专利号5,143,854；5,288,644；5,324,633；5,432,049；5,470,710；5,492,806；5,503,980；5,510,270；5,525,464；5,547,839；5,580,732；5,661,028；5,800,992中所描述的技术，其披露内容在此引用，并包括WO 95/21265；WO 96/31622；WO 97/10365；WO 97/27317；EP 373 203；以及EP 785 280。在这些方法中，包含用于每个表达被测定的表型决定基因的探针的"探针"核酸的阵列被如上所述的目标核酸接触。接触在杂交条件下进行，例如在严格的杂交条件下进行，未结合的核酸然后被去除。本文中使用的术语“严格的检测条件”是指与产生足够互补性的结合对的条件相容，例如，表面结合和溶液相核酸，以提供所需的检测特异性，同时不相容于结合互补性不足以提供所需特异性的结合成员之间的结合对的形成。严格的检测条件是杂交和洗涤条件的总和或组合。

由杂交的核酸产生的模式提供了有关每个被探测基因的表达信息，其中表达信息以基因是否表达及通常表达水平为基础，表达数据，例如转录组形式的生物标志物表示可能是定性和定量的。

或者，可以采用非基于阵列的方法来量化样品中一个或多个核酸的水平，包括基于扩增协议的方法，例如聚合酶链反应(PCR)基础的检测，包括定量PCR，逆转录PCR(RT-PCR)，实时PCR等。

当需要检测蛋白质水平时，可以采用任何便利的方案来评估蛋白质水平，其中测定待测样品中一个或多个蛋白质的水平。例如，一种代表性且便利的测定蛋白质水平的协议类型是酶联免疫吸附实验(ELISA)。在ELISA和基于ELISA的测定中，可以在选定的固体表面上固定一个或多个特异于目标蛋白质的抗体，最好是表现出蛋白质亲和性的表面，如聚苯乙烯微孔板的孔。在清除未完全吸附的物质后，检测板的孔被涂覆上一种非特异的“阻断”蛋白质，该蛋白质已知在抗原方面与测试样品呈抗原性中和，例如牛血清白蛋白(BSA)、酪蛋白或乳粉溶液。这样可以阻止固定表面上的非特异性吸附位点，从而减少由抗原非特异性结合在表面上引起的背景。清除未结合的阻断蛋白质后，将待测样品在有利于免疫复合物(抗原/抗体)形成的条件下与固定表面接触。这样的条件包括将样品用稀释剂(例如PBS/Tween或PBSATriton-X 100中的牛血清白蛋白(BSA)或牛γ球蛋白(BGG))稀释，这也有助于减少非特异性背景，并且允许样品在约25°-27℃的温度下孵育约2-4小时(虽然也可以使用其他温度)。孵育后，抗血清接触的表面进行清洗，以去除非免疫复合物形成的物质。一种示例的清洗程序包括使用PBS/Tween、PBS/Triton-X 100或硼酸盐缓冲液等溶液进行清洗。然后，通过使结合的免疫复合物接受第二个具有与第一个抗体不同靶点特异性的抗体，并检测第二个抗体的结合来确定免疫复合物的出现和数量。在某些实施例中，第二抗体将具有一个相关的酶，例如尿酶、过氧化物酶或碱性磷酸酶，它将在与适当的显色底物孵育时产生一种颜色沉淀。例如，可以采用尿酶或过氧化物酶偶联的抗人IgG，在有利于免疫复合物形成的条件下进行一段时间的孵育(例如，在含PBS/Tween的PBS溶液中在室温下孵育2小时)。在与第二抗体孵育并清洗以去除未结合物质后，可以通过与显色底物(如尿素和溴甲酚紫)或过氧化氢和2,2'-联氨基苯并噻唑啉-6-磺酸(ABTS)在过氧化物酶标记的情况下孵育，然后通过测量色彩生成程度(例如使用可见光谱光度计)来量化标记的数量。

前面的方法可以通过首先将样品与检测板结合来进行修改。然后，将第一抗体与检测板孵育，随后使用具有针对第一抗体特异性的标记化第二抗体检测结合的第一抗体。

抗体或抗体固定的固体基质可以由各种材料和各种形状制成，例如微孔板、微珠、浸渍棒、树脂颗粒等。可以选择基质以最大化信噪比，最小化背景结合，并易于分离和成本低廉。清洗可以以最适合所使用的基质的方式进行，例如通过从储罐中取出珠子或浸渍棒，排空或稀释微孔板孔或用清洗溶液或溶剂冲洗珠子、颗粒、色谱柱或过滤器。

或者，也可以采用基于非ELISA的方法来测量样品中一个或多个蛋白质的水平。代表性示例包括但不限于质谱分析、蛋白质组学阵列、xMAP

所得数据提供有关已被探测的每种生物标志物在样品中的水平的信息，其中信息通常是定性和定量的。因此，在检测是定性的情况下，该方法提供了有关正在检测的目标生物标志物(例如核酸或蛋白质)是否存在于被检测的样品中的读数或评估。在其他实施例中，该方法提供了定量检测正在被检测的目标生物标志物是否存在于被检测的样品中的评估或评估目标分析物(例如核酸或蛋白质)在被检测的样品中的实际量或相对丰度。在这种实施例中，定量检测可以是绝对的，或者如果该方法是检测样品中两个或更多不同分析物(例如目标核酸或蛋白质)的方法，则是相对的。因此，在涉及定量检测样品中的目标分析物(例如核酸或蛋白质)时，术语“定量化”可以指绝对定量或相对定量。可以通过包含一个或多个控制分析物的已知浓度并将检测到的目标分析物的水平与已知的控制分析物(例如通过生成标准曲线)进行参考来完成绝对定量。或者，可以通过比较两个或多个不同目标分析物之间的检测水平或量来实现相对定量，以提供每个两个或多个不同分析物的相对定量，例如相对于彼此。

一旦确定了一个或多个KD生物标志物的水平，就可以通过多种方法对测量结果进行分析，以获得KD生物标志物水平的表示。

例如，可以单独分析一个或多个KD生物标志物的测量结果以开发KD得分。如本文所述，“KD得分”是患者样品中一个或多个KD生物标志物的标准化水平，例如患者样品中血清蛋白浓度的标准化水平。可以通过多种已知的方法生成KD概要。例如，可以对每个生物标志物的水平进行log2转换，并相对于所选的基因表达或整个组的信号进行标准化。其他计算KD概要的方法对于普通技术人员来说也是常识性的。

另一个例子是，可以集体分析一组KD生物标志物的测量结果，以得出单个KD得分。所谓“KD得分”是指代表KD组中每个KD生物标志物加权水平的单个度量值。因此，在一些实施例中，所述方法包括检测样品中KD组的生物标志物水平，并根据KD生物标志物的加权水平计算KD得分。可以使用已知的多种方法和算法计算患者样品的KD得分。例如，可以将带权生物标志物水平(例如，将每个标准化的生物标志物水平乘以一个加权因子)相加，并在某些情况下对其进行平均，以得出代表分析的KD生物标志物组的单个值。

在某些情况下，对于KD组中的每个生物标志物，其权重因子或简称“权重”，可能反映了样品中分析物水平的变化。例如，每个KD生物标志物的分析物水平可能被对数转换，并分别加权为1(对于在KD中水平增加的那些生物标志物)或-1(对于在KD中水平降低的那些生物标志物)，然后确定增加的生物标志物总和与降低的生物标志物总和之比以得出KD签名。在其他情况下，权重可能反映了每个生物标志物对于生物标志物组在进行诊断、预后或监测评估中的特异性、灵敏性和/或准确性的重要性。这些权重可以通过任何方便的统计机器学习方法确定，例如主成分分析(PCA)、线性回归、支持向量机(SVM)和/或随机森林等，并且可以使用从所得样品的数据集中获得的数据集来进行计算。在某些情况下，每个生物标志物的权重由从患者样品获得的数据集定义。在其他情况下，每个生物标志物的权重可能基于参考数据集或“训练数据集”而定义。

这些分析方法可以通过使用计算机系统轻松地由一般技术人员进行，例如使用任何已知的硬件、软件和数据存储介质，并采用任何方便的算法进行此类分析。例如，数据挖掘算法可以通过“云计算”、基于智能手机或客户端服务器平台等进行应用。

在某些实施方案中，仅评估一个生物标志物(例如寡核苷酸水平)的表达，以产生生物标志物水平的表示。在其他实施方案中，评估两个或更多的生物标志物(即组)的水平。因此，在该方法中，评估至少一个生物标志物在样品中的表达。在某些实施方案中，进行的评估可以被视为对蛋白质组的评估，如该术语在技术领域中所使用的那样。

在某些情况下，对于一个受试者确定或获得KD生物标志物表示(例如KD分数或KD轮廓)的方法还包括将KD生物标志物表示作为报告提供。因此，在某些情况下，该方法还可能包括生成或输出提供样品中KD生物标志物评估结果的报告，该报告可以以电子媒介形式(例如计算机显示器上的电子显示)或有形媒介形式(例如打印在纸张或其他有形媒介上的报告)提供。报告的任何形式都可以提供，例如，如技术领域中所知道的或如下所述的形式。

应用

获得的KD生物标志物水平表征有许多用途。例如，可以利用生物标志物水平表征诊断KD，即确定受试者是否受KD影响、KD的类型(完全性KD和不完全性KD)、KD的严重程度(正常心脏表型、扩张或动脉瘤等)。在某些情况下，受试者可能出现KD的临床症状，例如发热、皮疹、手脚肿胀、眼白部位的刺激和红肿、颈部淋巴结肿大以及口腔、唇部和喉部的刺激和炎症。

另一个例子是，当患者出现不完全性KD时，可以利用KD生物标志物水平表征评估KD风险，即将KD临床表征作为风险指标。例如，可以利用KD生物标志物水平表征代替额外的临床表征作为受试者的KD诊断。通过“如果个体有KD则添加生物标志物表征”，意味着即使根据AHA指南，少于四个临床表征存在时也能确定个体是否患有KD的可能性。KD生物标志物水平表征和KD得分可用作疾病进展和/或疾病结局的临床表征，例如，预期确认KD的诊断、预期的KD持续时间、KD是否会发展心脏表型等。KD生物标志物水平表征可用于预测受试者对KD治疗的反应，例如，阳性反应、阴性反应或无反应。

另一个例子是，可以利用KD生物标志物水平表征来监测KD。通过“监测”KD，一般指监测受试者的状况，例如通知KD诊断、通知KD预后、提供关于KD治疗效果或功效的信息等。

另一个例子是，可以利用KD生物标志物水平表征来确定受试者的治疗方案。在本文中，“治疗”和类似的术语通常指获得所需的药理和/或生理效应。效应可以作为预防措施，完全或部分地预防疾病或其症状，也可以作为治疗措施，部分或完全治愈疾病和/或与疾病有关的不良反应。在本文中，“治疗”涵盖对哺乳动物患病的任何治疗，包括：(a)预防患病，即防止患病的个体尚未被诊断为患有该疾病；(b)抑制疾病，即阻止其发展；或(c)缓解疾病，即导致疾病退化。治疗剂可在疾病或损伤发作前、期间或后进行给药。特别的是治疗正在进行中的疾病，其中治疗稳定或减轻了患者不良的临床症状。主题治疗可在疾病症状阶段之前和在某些情况下在疾病症状阶段之后进行。在本文中，术语“个体”、“受试者”、“宿主”和“患者”互换使用，并指任何需要诊断、治疗或治疗的哺乳动物对象，尤其是人类。KD治疗已广为人知，可以包括卧床休息、喝更多的水、低盐饮食、控制血压的药物、皮质类固醇、诱导妊娠等。

在某些实施方式中，提供KD风险评估的主体方法，例如诊断KD、KD风险评估、监测KD治疗等，可以包括将获得的KD生物标志物水平表示与KD表型确定元素进行比较，以识别与表型确定元素的相似性或差异性，然后利用所识别的相似性或差异性来提供KD评估，例如诊断KD、KD风险评估、监测KD治疗和确定KD治疗必要性等。所谓“表型确定元素”，是指代表表型(在这种情况下是KD表型)的元素，例如组织样品、生物标志物剖面、值(例如得分)、值范围等，可以用于确定受试者的表型，例如受试者是否健康或是否患有KD，受试者是否有不完全KD可能进展为完全/确认的KD，受试者是否有对疗法有反应的KD等。

例如，KD表型鉴定元素可以是一个样品，来自具有或不具有KD的个体，可以用作给定个体的生物标志物水平表示的实验性确定的参考/对照。另一个例子是，KD表型鉴定元素可以是代表KD状态的生物标志物水平表示，例如生物标志物谱或分数，可用作解释给定个体的生物标志物水平表示的参考/对照。表型鉴定元素可以是阳性参考/对照，例如来自患有KD的儿童或从不完全的KD发展到完全的KD或已知治疗方法可控制的患有KD的儿童的样品或其生物标志物水平表示，或已确定对IVIG有反应的KD的样品或其生物标志物水平表示。或者，表型鉴定元素可以是阴性参考/对照，例如来自未患有KD或患有其他发热疾病的儿童的样品或其生物标志物水平表示。最好，表型鉴定元素是相同类型的样品或者如果从正在监测的个体生成生物标志物水平表示的样品中获得生物标志物水平表示，则它们应是相同类型的样品。例如，如果评估个体的血清，则表型鉴定元素最好是血浆。

在某些实施例中，所得的生物标志物水平表示将与单个表型测定元素进行比较，以获得有关测试是否患有KD的个体的信息。在其他实施例中，所得的生物标志物水平表示将与两个或两个以上的表型测定元素进行比较。例如，所得的生物标志物水平表示可以与负参考和正参考进行比较，以获得关于个体是否会发展成KD的确认信息。作为另一个例子，所得的生物标志物水平表示可以与代表对治疗有反应的KD和代表对治疗无反应的KD的参考进行比较，以获得关于患者是否对治疗有反应的信息。

在某些实施例中，所获得的生物标志物水平表征与单个表型测定元素进行比较，以获取有关被测试的是否患有KD的个体的信息。在其他实施例中，所获得的生物标志物水平表征将与两个或更多表型测定元素进行比较。例如，所获得的生物标志物水平表征可以与负参考和阳性参考进行比较，以获得有关个体是否会发展成KD的确认信息。作为另一个例子，所获得的生物标志物水平表征可以与代表对治疗敏感的KD的参考和代表对治疗不敏感的KD的参考进行比较，以获取有关患者是否对治疗有反应的信息。将所获得的生物标志物水平表征与一个或多个表型测定元素进行比较，可以使用任何方便的方法，其中对于技术人员而言，各种方法已知。例如，对于qPCR领域的技术人员而言，他们将知道可以通过，例如，将已知量的RNA的循环阈值C(t)归一化，比较归一化值等来比较qPCR数据。比较步骤结果表明获得的生物标志物水平剖面与控制/参考剖面有多么相似或不相似，这种相似性/不相似性信息可用于例如预测KD的发作，诊断KD，监测KD患者等。同样，对于阵列领域的技术人员而言，他们将知道可以通过，例如，比较表达剖面的数字图像，比较表达数据的数据库等来比较阵列剖面。描述比较表达剖面方法的专利包括但不限于美国专利号6,308,170和6,228,575，其内容在此引用并纳入本文。上面还描述了比较生物标志物水平剖面的方法。相似性可以基于相对生物标志物水平、绝对生物标志物水平或两者的组合。在某些实施例中，使用存储有用于接收来自被监测个体的生物标志物水平表征的输入的程序的计算机来进行相似性确定，例如从用户处，确定与一个或多个参考剖面或参考分数的相似性，并返回KD临床表征预测，例如返回给用户(例如实验室技术员，医生，孕妇等)。进一步关于计算机实现方面的描述在下文中进行。在某些实施例中，相似性确定可以基于生物标志物水平的视觉比较，例如，将KD得分与一系列表型测定元素(例如，一系列KD得分)进行比较，以确定与受试者最相似的参考KD得分。根据将获得的生物标志物水平分布与进行比较的表型测定元素的类型和性质，上述比较步骤产生关于检测到的细胞/体液的各种不同类型的信息。因此，上述比较步骤可以产生KD发作的阳性/阴性预测，KD的阳性/阴性诊断，KD的表征，KD对治疗的响应信息等。

在其他实施例中，生物标志物水平表示直接用于进行KD诊断、KD风险评估或监测KD治疗，而无需与表型确定元素进行比较。

该方法可以应用于不同类型的被测对象。在许多实施例中，被测对象属于哺乳动物类，包括食肉目(例如，狗和猫)、啮齿目(例如，小鼠、豚鼠和大鼠)、兔形目(例如，兔子)和灵长目(例如，人类、黑猩猩和猴子)。在某些实施例中，动物或宿主，即被测对象(也在此称为患者)，是人类。

在某些实施例中，提供KD评估的方法包括提供诊断、预后或监测结果。在某些实施例中，本公开的KD评估是通过提供本领域技术人员的评估来实现的，例如本领域技术人员的判断患者当前是否患有KD、患者的KD类型、阶段或严重程度等(“KD诊断”)；本领域技术人员对患者患病风险、疾病进展情况、对治疗的反应等进行的预测(即本领域技术人员的“KD预后”)；或者本领域技术人员对KD的监测结果。因此，该方法还可以包括生成或输出提供本领域技术人员评估结果的报告的步骤，该报告可以采用电子媒介的形式(例如，计算机显示屏上的电子显示)，或采用有形媒介的形式(例如，打印在纸张或其他有形媒介上的报告)。可以采用任何形式的报告，例如，如现有技术所知道的或如下文更详细地描述的那样。

报告

如本文所述，“报告”是一种电子或有形文件，其中包括报告元素，提供与受试者评估及其结果相关的感兴趣信息。在一些实施方案中，受试者报告至少包括KD生物标志物表示，例如KD概况或KD得分，如上文更详细地讨论的。在一些实施例中，受试者报告至少包括技术人员的KD评估，例如KD诊断，KD预后作为KD临床体征、KD监测分析、治疗建议等。受试者报告可以完全或部分电子生成。受试者报告可以进一步包括以下中的一个或多个：1)关于测试设施的信息；2)服务提供商信息；3)患者数据；4)样品数据；5)评估报告，其可以包括各种信息，包括a)所采用的参考值和b)测试数据，其中测试数据可以包括例如蛋白质水平测定；6)其他功能。

报告可能包括有关检测设施的信息，以及哪些信息与医院、诊所或实验室有关，在这些医院、诊所和实验室中采集样品和/或数据进行了生成。样品采集可以包括获得流体样品，如血液、唾液、尿液等。来自受试者的组织样品，如组织活检等。数据生成可以包括测量KD患者与健康个体的生物标志物浓度，即没有和/或没有发展成KD的个体。该信息可以包括一个或多个细节，例如与测试设施的名称和位置、进行分析和/或输入输入数据的实验室技术人员的身份、日期和时间有关进行和/或分析化验，存储样品和/或所得数据的位置，化验中使用的试剂(例如试剂盒等)的批号，等等。通常可以使用用户提供的信息来填充包含此信息的报告字段。

报告可以包括关于服务提供商的信息，该服务提供商可以位于用户所在的医疗机构之外或医疗机构内。这样的信息的示例可以包括服务提供商的名称和位置，审查人员的姓名，以及在必要或需要时，进行样品收集和/或数据生成的个人的姓名。具有该信息的报告字段通常可以使用用户输入的数据来填充，该数据可以从规定的选择中选择(例如，使用下拉菜单)。报告中的其他服务提供商信息可以包括用于关于结果和/或关于解释性报告的技术信息的联系信息。

报告可包括患者数据部分，包括患者病史(例如年龄、种族、血清型、既往KD发作和患者的任何其他特征)，以及管理患者数据，如识别患者的信息(例如姓名、患者出生日期(DOB)、性别、邮寄和/或居住地址、医疗记录号(MRN)、医疗机构的房间和/或床位号、保险信息等)、患者的医生或其他要求进行监测评估的卫生专业人员的姓名，如果与要求医生不同，负责患者护理的医生(如初级保健医生)的姓名。

报告可包括样品数据部分，该部分可提供有关监测评估中分析的生物样品的信息，如从患者身上获得的生物样品来源(如血液、唾液或组织类型等)、样品处理方式(如储存温度、准备方案)以及收集的日期和时间。具有此信息的报告字段通常可以使用用户输入的数据来填充，其中一些数据可以作为预先编写脚本的选择(例如，使用下拉菜单)来提供。该报告可能包括一个结果部分。

该报告可包括评估报告部分，该部分可包括处理本文所述数据后生成的信息。解释性报告可以包括对受试者发展为KD的可能性的预测。解释性报告包括KD的诊断。解释性报告可以包括KD的特征。报告的评估部分也可以选择性地包括建议。例如，在结果表明可能发生KD的情况下，该建议可以包括改变饮食、服用降压药等的建议，如本领域所推荐的。

还可以很容易地理解，报告可以包括额外的元素或修改的元素。例如，在电子版的情况下，报告可以包含指向内部或外部数据库的超链接，这些数据库提供有关所选数据库的更详细信息报告的要素。例如，报告的患者数据元素可以包括到电子患者记录的超链接或用于访问这种患者记录的站点，该患者记录保存在机密数据库中。后一个实施例可以是对住院系统或诊所环境的兴趣。当采用电子格式时，报告被记录在适当的物理介质上，例如计算机可读介质，例如计算机存储器、闪存驱动器、CD、DVD等。

很容易理解，报告可以包括上述所有或部分内容，但前提是报告通常至少包括这些内容足以提供用户要求的分析(例如计算的KD生物标志物水平表示；KD的预测、诊断或表征)。

试剂、系统和试剂盒

本发明还提供了用于实践一种或多种上述方法的试剂、系统及其试剂盒。所涉及的试剂、系统及其试剂盒可以有很大的变化。试剂包括专门设计用于生产来自样品的KD生物标志物的上述生物标志物水平表示，例如一个或多个检测元件，用于检测核酸的寡核苷酸、用于检测蛋白质的抗体或肽等。在一些情况下，检测元件包括用于检测单个KD生物标志物的丰度的试剂；例如，检测元件可以是包括一个或多个检测元件的量尺、板、阵列或混合物，一个或更多个寡核苷酸、一组或多组PCR引物、可以用于同时检测一种或多种KD生物标志物的丰度的抗体等。

另一种类型的此类试剂是探针核酸阵列，特别地，其中代表了基因(生物标志物)。本领域已知各种不同的阵列形式，具有各种不同的探针结构、衬底组成和连接技术(例如点印迹阵列、微阵列等)。特别地，代表性阵列结构包括美国专利5143854中描述的：5,288,644；5,324,633；5,432,049；5,470,710；5,492,806；5,503,980；5,510,270；5,525,464；5,547,839；5,580,732；5,661,028；5,800,992；其公开内容通过引用合并于此，以及WO 95/21265；WO 96/31622；WO 97/10365；WO 97/27317；EP373 203；以及EP 785 280。

另一种专门为产生基因(如KD基因)的生物标志物水平表达而定制的试剂是设计用于选择性扩增此类基因的基因特异性引物的集合(例如使用基于PCR的技术，实时RT-PCR)。基因特异性引物及其使用方法描述于美国专利5994076中，其公开内容通过引用并入本文。

一种专门为产生生物标志物水平表征(例如KD生物标志物级别表征)而定制的试剂是特异性结合蛋白质生物标志物的抗体的集合，例如以ELISA形式，以xMAP

特别地，探针阵列、引物集合或抗体集合，其包括对选自IFI27、C19ORF59、CACNA1E、CASP5、CR1、CLIC3、CRTAM、FKBP5、HGF、IL1RL1、KLHL2、MAPK14、NKTR、SLC11A1、S100A12、S100A9、TLR7和ZHF185，或与它们相关的特异性生物化学底物。受试者探针、引物或抗体集合或试剂可包括以下试剂仅对上面列出的基因/蛋白质/脂质/辅因子具有特异性，或者它们可以包括对上面没有列出的其他基因/蛋白质/脂质/辅因子具有特异性的试剂，例如对其表达的基因/蛋白/脂质/辅因子特异性的探针、引物或抗体，在本领域中已知与KD相关，例如IFI27和C19ORF59。

在某些情况下，可以提供这样的qPCR仪器，例如AB QuantStudio 6。如本文所用，术语“系统”是指试剂的集合，然而，通过从相同或不同的来源购买试剂的集合来编译。在某些情况下，可以提供套件。如本文所用，术语“试剂盒”是指提供的试剂集合，例如一起出售的试剂。例如，基于核酸或抗体的样品核酸或蛋白质的检测可以分别与电化学生物传感器平台耦合，该平台将允许对这些生物标志物进行多重测定个性化KD护理。

本发明的系统和试剂盒可以包括上述阵列、基因特异性引物集合或蛋白质特异性抗体集合。系统和试剂盒可以进一步包括在各种方法中使用的一种或多种附加试剂，例如用于产生靶核酸、dNTP和/或rNTP的引物，其可以是预混的或分离的，一种或多种独特标记的dNTP和/或rNTP，例如生物素化的或Cy3或Cy5标记的dNTPs，具有不同散射光谱的金或银颗粒，或其他合成后标记试剂，如荧光染料的化学活性衍生物，酶，如逆转录酶、DNA聚合酶、RNA聚合酶等，各种缓冲介质，如杂交和洗涤缓冲液，预制探针阵列，标记探针纯化试剂和成分，如旋转柱等，信号产生和检测试剂，例如标记的第二抗体、链亲和素碱性磷酸酶偶联物、化学荧光或化学发光基质等。

受试者系统和试剂盒还可以包括一个或多个KD表型测定元件，在许多实施方案中，该元件是参考或对照样品或生物标志物表示，其可以例如通过合适的实验或计算手段来使用，以基于“输入”生物标志物水平分布做出KD预后，例如，其已经用上述生物标志物确定元件确定。代表性的KD表型测定元件包括来自已知具有或不具有KD的个体的样品、生物标志物水平表示的数据库，例如参考或对照概况或分数，等等，如上所述。

除上述组成部分外，受试者试剂盒还将包括练习受试者方法的说明。这些说明可能出现在主题中多种形式的试剂盒，其中一种或多种可能存在于试剂盒中。这些说明可以以印刷信息的形式存在于合适的介质或基底上，例如在试剂盒的包装中，在其上印刷信息的一张或多张纸上包装插页等。另一种方式是计算机可读介质，例如软盘、CD等，其上已经记录了信息。可能存在的另一种手段是网站地址，该网站地址可以通过互联网访问被删除网站的信息。试剂盒中可以有任何方便的方法。

以下实例是通过举例说明而非限制的方式提供的。

实施例

提出以下实例是为了提供本领域的普通技术人员对如何制造和使用本发明进行描述，而不是旨在限制发明人认为是他们的发明的范围，也不打算代表下面的实验是所进行的全部或唯一的实验。已作出努力确保所用数字的准确性(例如数量、温度等)，但有些应考虑实验误差和偏差。除非另有说明，否则零件是重量份，分子量是重均分子量，温度为摄氏度，并且压力等于或接近大气压。

材料和方法

KD患者验证队列、人口统计信息和临床标准。血液样品取自确诊的KD，发热对照样品取自同一队列，但后来确定不是KD。KD患者符合美国心脏协会完全和不完全KD临床标准，并在首次发烧后10天内接受IVIG治疗。在给予IVIG或药物治疗之前，在基线时采集并分析患者血液样品。

血管炎的Meta分析和已鉴定的KD微量病例。从PBMC微阵列实验的七个数据集中提取差异表达基因。这七个数据集包括PBMC微阵列实验，用于分析原发性血管炎，包括KD，来自NCBI基因表达综合(GEO)20:4KD数据集的受试者，GSE15297(KD与FC)，GSE18606(KD与正常对照)，GSE9864(KD与普通对照)；GSE9863(KD与正常对照)；3个其他血管炎数据集，GSE33910(大动脉炎与正常对照组)、GSE17114(贝切特病与正常对照对照组)和GSE16945(大动动脉炎vs正常控制)。在每个数据集中发现DEG后，进行创新途径分析(IPA)，以确定七个数据集中每个数据集中与DEG相关的途径。基因生物标志物，存在于至少一个数据集的DEG列表中，并参与至少一个到七个数据集共享的共同富集途径构成了血管炎的集合元特征。为了识别潜在的生物标志物候选者，用人类生物流体蛋白质组数据库进一步过滤基因标志物，该数据库具有已知的血清和尿液可检测蛋白质，其中包含HUPO血浆蛋白质组项目的数据，血浆蛋白质组研究所，MAPU蛋白质组数据库和尿外泌体数据库。

对于文献检索，Génie用于挖掘pubmed数据库中的文献摘要。目前，我们共有20396个基因和1183931个基因摘要链接(551555个独特的PMID)用于挖掘分析。使用Génie，根据不同的主题对基因进行排名使用机器学习对其pubMed引文进行分类，并对主题关键词如“川崎病”、“心肌功能障碍”、“血管炎症”、“脉管渗漏”、“冠状动脉瘤”、“局部缺血”和“多系统炎症综合征”进行了测试。对于每个主题关键字搜索，摘要的显著截止值设置为p<0.05，基因的错误发现率设置为<0.05。所有显著富集的基因都使用Fisher统计进行排序。为了比较不同主题关键词下基因的排名差异，对7个主题的基因排名进行了归一化。排名第一的基因的相对排名为1，有效基因列表中最后一个基因的相对排序为0。结果，根据它们在每个关键词中的排名，选择了12个候选基因进行进一步测试。心脏发现小组的九个抗原阶段。共检测了61个基因在KD和其他发热性流散患者中的差异表达。

通过qPCR平台进行生物标志物检测。采集KD和发热对照组的血液。血液很快储存并进行制备，可以是新鲜的，也可以在-80摄氏度下冷冻，以备日后制备。用RNA提取试剂盒直接从血液中提取RNA。qPCR测定在QuantStudio 6IVD平台上进行，使用市售的一步或两步qPCR试剂盒提取61个蛋白质靶标的RNA。根据试剂制造商推荐的程序和稀释度进行测定，以及测定每个引物的线性、LOQ/LOD和最小C(t)值。

统计分析。整个研究人群包括200名患者，包括100名确诊的KD和100名发热对照病例。针对每个目标基因测量靶向基因的RNA拷贝数。在KD患者和发热对照组之间，使用性别的fisher精确检验和年龄的秩和检验来检验患者特征。对KD患者的单个分析物与发热对照组的分析物进行单变量分析。进行受试者操作特征(ROC)分析，并确定每种分析物的特异性、灵敏性、阳性预测值(PPV)、阴性预测值(NPV)和曲线下面积(AUC)值。Wilcoxon秩和检验和倍数变化分析也用于将所有KD患者的分析物浓度值与发热对照进行比较。使用相似的秩和检验比较确诊的KD诊断与发热对照的年龄差异。为了帮助统计分析，将低于定量限的任何测定值外推为定量限值的一半，将高于定量上限(ULQ)的任何分析物值外推为ULQ值的两倍。这确保了对于低于LOQ或高于ULQ的值的数据更具包容性。将值设置为LOQ和ULQ都不会影响分析。使用标准秩和检验p值小于0.05、倍数变化大于1.5或小于0.67以及AUC大于0.6，选择19个显著基因用于差异分析。

通过对所有十种分析物组合的迭代搜索，通过线性显著不同的分析物分析分析物浓度，以找到最大ROC AUC值。计算分析物的每个不同组合的几何平均值，并进行对数变换应用于几何平均值，然后缩放到0和10的范围，并进行ROC分析。对于第一次迭代，根据单变量分析，一次选择AUC>0.5最高的最佳分析物。在下一次迭代中将分析物添加到先前的最佳AUC组合组中。如果一种新的分析物通过最大化AUC来提高模型的性能，则它会保留在组合中，反之亦然。重复该过程，直到达到最大AUC，并且剩余的特征构成最终的组合。

KD生物标志物组和诊断得分。使用样品内验证对模型进行测试，以评估接收器工作特性曲线下面积的性能。使用来自最终组的几何平均值生成KD分数。在二元模型中，使用具有单个截断值的最优尤登指数来确定最优截断值。其他操作特征，如灵敏性、特异性、阳性预测值(PPV)和阴性预测值(NPV)，根据最佳截止值进行计算所有指标的置信区间为95％。所有统计数据均通过R软件4.1版(R统计计算基础)进行。计算了双侧p值，p＜0.05被认为是显著的。

结果

患者人口统计和特征。这项研究的重点是患有持续高烧的儿科人群，共有100例后来确诊的KD病例和100名发热儿童(表1a)。30名患者有5种临床症状，52名KD患者有四种临床症状，符合AHA指南在采血时的完整KD诊断标准(表1b)，而其余18例在采血时被诊断为不完整。确诊KD的年龄(1.4岁，0.8-2.4)比发热对照组(3.0岁，1.7-4.0)年轻，p<0.001。IRB的批准限制了对照组的临床信息，但没有一名发热对照患者符合KD诊断条件。

表1a.患者人口统计信息：KD患者略年轻于发热对照组。

表1b.研究队列中KD症状的总结。

荟萃分析确定了KD的qPCR发现小组。通过对7种血管炎和KD微阵列数据的荟萃分析，13种途径重叠。A.共鉴定了82个基因，并用人类生物流体蛋白质组数据库进行了筛选。这导致了潜在的40种血管炎特异性基因标志物(元标志)的鉴定，这些标志物可能在血液中差异表达(图1)。VEGF、MMP8和HGF属于我们的血管炎元特征，据报道，在KD和FC之间(p值＜0.0001)以及在KD和正常对照(p值p＜0.001)受试者之间的血清中差异表达。这一观察结果提供了直接证据，支持我们整体生物标志物发现方法的有效性，以及我们的假设，即血管炎PBMC微阵列数据集的荟萃分析可以导致特定的KD诊断生物标志物。这一观察结果也符合我们在应用相同方法鉴定新的先兆子痫生物标志物方面的成功经验。此外，在Gé nie等人的方法的基础上使用了文献思维方法。目前，我们共有20396个基因和1183931个基因摘要链接(551555个独特的PMID)用于挖掘分析。使用Gé nie的方法，使用机器学习对基因的pubMed引用进行分类，并使用主题关键字(如“kawasaki疾病”、“心肌功能障碍”、“血管炎症”、“脉管渗漏”、“冠状动脉”、动脉瘤”、“局部缺血”和“多系统炎症综合征”。在我们的研究中测试了每个主题关键词搜索，截断值设置为p＜0.05，基因的错误发现率设置为＜0.05。所有显著富集的基因都使用Fisher统计进行排序。为了比较不同主题关键词下基因的排名差异，对7个主题的基因排名进行了归一化。排名第一的基因的相对排名为1，有效基因列表中最后一个基因的相对排序为0。结果，根据它们在每个关键词中的排名，选择了12个候选基因进行进一步测试。此外，还包括基于Luminex的心脏发现小组中与KD症状相关的9个抗原靶点。

进行了两步发现和验证过程，以缩小验证研究的最终基因表达范围。从最初的5x5队列中选择19个基因，然后使用额外的15x15队列来确定KD得分小组的最佳小组。两个基因，C19ORF59和IFI27，以及它们的δC(t)被进一步确定为KD鉴别的最佳组合。最终验证队列。

二进制和风险分类模型性能。通过单变量分析对探索性发现小组中每个基因生物标志物的KD和发热对照队列的qPCR结果进行了单独分析(表2)。

表2.利用QuanStudio 6qPCR仪器进行qPCR检测的19个基因生物标志物。生物标志物根据单变量分析下接收者操作特征曲线下面积(AUC)排序，从上到下排列。

随后，使用线性方法构建具有最大AUC的最佳组合。前两对δC(t)值，C19ORF59和IFI27，在最初的发现和验证队列研究后，通过两种基因表达之间的δC(t)值的差异产生了一个小组(图1)。两个基因组进一步在80KD的验证队列和80发热对照队列中验证。两个基因组在4.558的最佳截断值下实现了0.930的总体ROC ACU。

诊断模型具有0.930的稳健AUC，用于诊断KD(图2中b)。AUC(ROC曲线下面积)量化了诊断测试区分患有和不患疾病的个体的能力。没有假阳性或假阴性的完美测试的AUC为1.00；在识别真阳性方面并不比随机机会好的测试具有0.5的AUC。基于使用Youden指数确定的川崎病得分(KD得分)的最佳截断值4.558，确定了诊断截断值，以优化有效KD诊断的灵敏性和特异性。总人群的总体二进制分类模型性能灵敏性为84％(77％-91％)，特异性为91％(85％-96％)，阳性预测值(PPV)为90.3％，阴性预测值(NPV)为85％(图2中c)。

此外，还创建了一个基于两阈值的量表，将患者分为三级风险得分系统，用于有效的KD风险分层，以帮助KD的临床诊断：低风险(KD得分<3.558)、中风险(3.558-4.958)和高风险(KD分>4.958)。如图3中a所示。对于高风险KD组，PPV为91.8％，低风险KD(发热性疾病)组的NPV为89.5％(图3中b)。这一结果表明，高风险组中超过90％的患者和低风险组中少于1/10的患者KD呈阳性(图3中c)。诊断测试的KD得分旨在作为一种体外诊断测试，以帮助医生做出决定，尤其是对于不完整的KD。

我们还在诊断为KD的研究队列中检查了冠状动脉异常与KD得分系统的相关性。计算单个KD患者的Z得分，并将其分为三类：无冠状动脉受累(Z得分<2)，仅扩张(z得分2至<2.5)和动脉瘤(z得分>2.5)。我们的测试捕捉到了高危组中大多数患有动脉瘤的KD患者，26例中有24例(92.3％)，可以识别出冠状动脉正常的KD患者(图4)。数据还表明，我们的研究小组不需要明显的心脏应激信号或表型就可以被阳性鉴定为KD。

我们开发了一种诊断标志物组，以帮助诊断ROC AUC为0.930的川崎病。血清学检测可以准确地识别KD患者，并将他们与其他发热病例区分开来。使用AUC为0.930的基于线性几何平均数的统计模型构建C19ORF59和IFI27的delta C(t)模型。基于组合生物标志物的线性几何平均值的简单模型避免了训练偏差，从而导致验证集中的过度拟合和较差的预测结果。该模型也更有可能从其他地区转移不同的患者群体。

此前，几项研究旨在通过基于LC-MS的技术或基因微阵列方法，发现一种特定的生物标志物或含有血清学蛋白质分析物、细胞因子或基因表达谱的多生物标志物组，以识别潜在的KD生物标志物。最近针对三种血清学生物标志物，髓系相关蛋白8/14(MRP8/14)、人中性粒细胞弹性蛋白酶(HNE)和C反应蛋白作为前瞻性生物标志物组的研究，ROC AUC值高达0.82，但阴性预测值相对较差。另一项研究使用随机森林模型使用分析物浓度的几何平均值和最佳尤登指数来确定截断值，以实现与我们的简单四分析物组相似的AUC值。像随机森林这样复杂的统计模型更难解释实现比简单的等权重线性模型。随机森林模型也很难将模型从原始队列转移到来自不同地区的另一个队列，这可能会限制其作为实际临床分析的实用性。

Wright等人使用微阵列数据还开发了一个13个转录物的血液基因表达特征组，能够区分KD病例和发热患者。该研究使用平行正则化回归模型搜索来区分KD病例。该小组在最终验证集中获得了0.946的AUC。然而，训练和验证队列都只使用了研究产生的微阵列数据，并对基因表达进行了进一步验证具有更定量测定的数据，例如13个基因的qPCR。该小组需要在单独的队列中使用聚焦基因小组的定量qPCR分析进行重新检查和验证。基因表达特征分析最近表明，在新型冠状病毒感染引起的儿童多系统炎症综合征中，KD具有相似的COVID-19感染，但没有常见的相关心脏表型。这表明基因特征主要捕获宿主对KD的免疫反应，而不是心脏事件。通过定量PCR分析，从全血基因表达分析中观察我们血清生物标志物的基因表达是否也上调，这将是一件有趣的事情。

在这项研究中，我们使用定量PCR检测和IVD-qPCR仪(QuantStudio 6)与可用的临床检测相结合，以快速适应临床对KD的诊断。该组合模型也基于两个分子靶标的简单差异(RNA拷贝数)，显著提高了模型在队列之间的可转移性，而不会对数据进行过度拟合。如果通过复杂的统计模型或人工智能机器学习算法处理数据，通常会出现数据的过度拟合。这项研究的局限性在于没有额外的更大的验证队列来确定该小组是否可以很容易地转移到不同的患者群体。美国食品和药物政府认为KD是一种罕见的孤儿病。因此，及时登记可能很困难。KD最重要的医疗需求是患有不完全性KD并且经常被误诊为其他发热性疾病的患者。在发烧后十天内不接受IVIG治疗，以后发生心脏事件的可能性要高得多。可以与当前可用的临床测试和标准统计算法一起部署的KD诊断测试组可以大大提高KD诊断的速度和准确性。

本发明包括，但不限于以下技术方案：

一种确定受试者川崎病生物标志物水平呈现的方法，该方法包括：

a.评估来自受试者的样品，例如血液、血清或血浆中的一组川崎病生物标志物，以确定样品中每个川崎病生物标志物的表达水平；

b.基于组中每个川崎病生物标志物的水平来获得川崎病生物标志物的水平表示；

c.其中所述川崎病生物标志物的组包括选自IFI27、C19ORF59、CACNA1E、CASP5、CR1、CLIC3、CRTAM、FKBP5、HGF、IL1RL1、KLHL2、MAPK14、NKTR、SLC11A1、S100A12、S100A9、TLR7和ZHF185的一种或多种生物标志物。

进一步地，其中测量每个川崎病生物标志物的寡核苷酸的全长或其核苷酸序列、RNA或DNA水平。

进一步地，其中所述生物标志物表达水平以循环阈值C(t)表示。

进一步地，其中所述组包括C19ORF59和IFI27。

进一步地，其中所述组包括C19ORF59、IFI27、S100A12和S100A9。

进一步地，其中所述组包括C19ORF59、IFI27、S100A12、S100A9、CLIC3和SLC11A1。

进一步地，其中所述组包括C19ORF59、IFI27、S100A12、S100A9、CLIC3、SLC11A1、CACNA1E和LGALS2。

进一步地，其中所述组包括C19ORF59、IFI27、S100A12、S100A9、CLIC3、SLC11A1、CACNA1E、LGALS2、ABCC1和CAMK4。

进一步地，还包括提供川崎病生物标志物水平表示的报告，例如绝对浓度或循环阈值C(t)的介质倍数(MoM)。

进一步地，其中所述川崎病生物标志物水平呈现导出川崎病得分，其中所述川崎病得分：

a.可以从两个不同基因如C19ORF59和IFI27之间的循环阈值C(t)差异导出；

b.可以通过几何均值、多元线性判别分析(LDA)或分布式梯度增强决策树(GBDT)机器学习(如XGBoost)，从所测量的血液生物标志物的值导出；或

c.可以是每个生物标志物水平的倍数，如C(t)，浓度或C(t)的MoM，归一化以适应0-10的等级，例如可由以下公式导出：[C(t)

一种用于对受试者进行川崎病诊断的方法，包括获得来自受试者的样品的川崎病生物标志物的水平表示，当川崎病得分大于4.558时，受试者被诊断为川崎病。

进一步地，其中测量每个川崎病生物标志物的寡核苷酸的全长或其核苷酸序列、RNA或DNA水平。

进一步地，其中所述生物标志物表达水平以循环阈值C(t)表示。

进一步地，其中所述组包括C19ORF59和IFI27。

进一步地，其中所述组包括C19ORF59、IFI27、S100A12和S100A9。

进一步地，其中所述组包括C19ORF59、IFI27、S100A12、S100A9、CLIC3和SLC11A1。

进一步地，其中所述组包括C19ORF59、IFI27、S100A12、S100A9、CLIC3、SLC11A1、CACNA1E和LGALS2。

进一步地，其中所述组包括C19ORF59、IFI27、S100A12、S100A9、CLIC3、SLC11A1、CACNA1E、LGALS2、ABCC1和CAMK4。

进一步地，还包括提供川崎病生物标志物水平表示的报告，例如绝对浓度或循环阈值C(t)的介质倍数(MoM)。

进一步地，其中所述川崎病生物标志物水平呈现导出川崎病得分，其中所述川崎病得分：

a.可以从基因#1和基因#2，例如C19ORF59和IFI27之间的循环阈值差异导出；

b.可以通过几何均值、多元线性判别分析(LDA)或分布式梯度增强决策树(GBDT)机器学习(如XGBoost)，从所测量的血液生物标志物的值导出；或

c.可以是每个生物标志物水平的倍数，如浓度或MoM，归一化以适应0-10的等级，例如可由以下公式导出：[C(t)

一种用于受试者川崎病风险评估的方法，包括获得来自受试者的样品的川崎病生物标志物的水平表示：

a.对于川崎病风险评估，川崎病得分在三个不同的范围内评估患川崎病的风险，以确定患川崎病的风险；

b.以低于3.558的低分截断值的低川崎病风险(根据人群调整)为例，表明患者患川崎病的风险较低；

c.以高于4.958的高分截断值的高川崎病风险(根据人群调整)为例，表明患者患川崎病的风险较高；

d.低分截断值和高分截断值之间的分数表明患者患川崎病的风险中等。

进一步地，其中测量每个川崎病生物标志物的寡核苷酸的全长或其核苷酸序列、RNA或DNA水平。

进一步地，其中所述生物标志物表达水平以循环阈值C(t)表示。

进一步地，其中所述组包括C19ORF59和IFI27。

进一步地，其中所述组包括C19ORF59、IFI27、S100A12和S100A9。

进一步地，其中所述组包括C19ORF59、IFI27、S100A12、S100A9、CLIC3和SLC11A1。

进一步地，其中所述组包括C19ORF59、IFI27、S100A12、S100A9、CLIC3、SLC11A1、CACNA1E和LGALS2。

进一步地，其中所述组包括C19ORF59、IFI27、S100A12、S100A9、CLIC3、SLC11A1、CACNA1E、LGALS2、ABCC1和CAMK4。

进一步地，还包括提供川崎病生物标志物水平表示的报告，例如绝对浓度或循环阈值的介质倍数(MoM)。

进一步地，其中所述川崎病生物标志物呈现导出川崎病得分，其中所述川崎病得分：

a.可以从基因#1和基因#2，例如C19ORF59和IFI27之间的循环阈值差异导出；

b.可以通过几何均值、多元线性判别分析(LDA)或分布式梯度增强决策树(GBDT)机器学习(如XGBoost)，从所测量的血液生物标志物的值导出；或

c.可以是每个生物标志物水平的倍数，如浓度或MoM，归一化以适应0-10的等级，例如可以由以下公式导出：[C(t)

一种用于为受试者提供川崎病治疗监测的方法，包括获得来自受试者的样品的川崎病生物标志物水平表示；对于川崎病治疗监测，川崎病得分最初应大于例如4.558，但在治疗前需要对川崎病进行群体调整；治疗后川崎病得分应显著降低，低于3.558的川崎病得分。

进一步地，其中测量每个川崎病生物标志物的寡核苷酸的全长或其核苷酸序列、RNA或DNA水平。

进一步地，其中所述生物标志物表达水平以循环阈值C(t)表示。

进一步地，其中所述组包括C19ORF59和IFI27。

进一步地，其中所述组包括S100A12和S100A9。

进一步地，其中所述组包括S100A12、S100A9、CLIC3和SLC11A1。

进一步地，其中所述组包括S100A12、S100A9、CLIC3、SLC11A1、CACNA1E和LGALS2。

进一步地，其中所述组包括S100A12、S100A9、CLIC3、SLC11A1、CACNA1E、LGALS2、ABCC1和CAMK4。

进一步地，还包括提供川崎病生物标志物水平表示的报告，例如绝对浓度或介质倍数(MoM)。

进一步地，其中所述川崎病生物标志物呈现导出川崎病得分，其中所述川崎病得分：

a.可以从基因#1和基因#2，例如C19ORF59和IFI27之间的循环阈值差异导出；

b.可通过几何均值、多元线性判别分析(LDA)得出，或分布式梯度增强决策树(GBDT)机器学习(如XGBoost)，从所测量的血液生物标志物的值导出；或

c.可以是每个生物标志物水平的倍数，如浓度或MoM，归一化以适应0-10的等级，例如可以由以下公式导出：[C(t)

一种诊断系统，包括试剂盒、试剂和从来自受试者的样品例如血液、血清或血浆中产生川崎病得分的仪器，包括：用于测量选自以下生物标志物组的一种或多种川崎病生物标志物的量的检测试剂，所述川崎病生物标志物组包括IFI27、C19ORF59、CACNA1E、CASP5、CR1、CLIC3、CRTAM、FKBP5、HGF、IL1RL1、KLHL2、MAPK14、NKTR、SLC11A1、S100A12、S100A9、TLR7和ZHF185。

所述的诊断系统进一步包括：

a.用于测量川崎病生物标志物的平台系统，例如QuantStudio 6系统；

b.计算川崎病得分的计算表，以及

c.确定患者是否患有川崎病的指示。

进一步地，其中所述组包括C19ORF59和IFI27。

进一步地，其中所述组包括C19ORF59、IFI27、S100A12和S100A9。

进一步地，其中所述组包括C19ORF59、IFI27、S100A12、S100A9、CLIC3和SLC11A1。

进一步地，其中所述组包括C19ORF59、IFI27、S100A12、S100A9、CLIC3、SLC11A1、CACNA1E和LGALS2。

进一步地，其中所述组包括C19ORF59、IFI27、S100A12、S100A9、CLIC3、SLC11A1、CACNA1E、LGALS2、ABCC1和CAMK4。

进一步地，包括选择疑似患有川崎病的患者用于静脉注射免疫球蛋白(IVIG)治疗，所述方法包括：

a.确定患者的川崎病得分；

b.根据所述的方法诊断患者，并且如果患者确诊川崎病，则选择患者进行IVIG给药；

c.如果患者的川崎病得分在高风险范围和中等风险范围内，则选择患者进行IVIG给药。

进一步地，还包括监测对患有川崎病的患者的川崎病治疗效果，包括：

a.确定患者的川崎病得分；

b.根据所述的方法诊断患者，并且如果患者确诊川崎病，则选择患者进行IVIG给药；

c.如果患者的川崎病得分在高风险范围和中等风险范围内，则选择患者进行IVIG给药；以及

d.有效的治疗将导致川崎病得分下降。

一种方法，包括川崎病样品测定的处理程序，以保留必要的数据，包括：

a.测量从疑似患有川崎病的患者采集的血液、血浆或血清样品中的生物标志物组的每个生物标志物浓度，所述川崎病生物标志物组包括IFI27、C19ORF59、CACNA1E、CASP5、CR1、CLIC3、CRTAM、FKBP5、HGF、IL1RL1、KLHL2、MAPK14、NKTR、SLC11A1、S100A12、S100A9、TLR7和ZHF185；以及

b.将每个生物标志物的测量值与对照受试者的每个生物标志物的参考值进行比较，其中差异表达表明患者患有川崎病；该测定进一步包括根据患者的这些生物标志物浓度确定川崎病得分。

一种通过靶向生物标志物的寡核苷酸引物测量生物标志物组的至少一对川崎病生物标志物以计算川崎病得分的方法，其中所述生物标志物组包括IFI27、C19ORF59、CACNA1E、CASP5、CR1、CLIC3、CRTAM、FKBP5、HGF、IL1RL1、KLHL2、MAPK14、NKTR、SLC11A1、S100A12、S100A9、TLR7和ZHF185，所述引物特异性结合包含所述生物标志物的RNA/DNA序列决定簇的所述生物标志物或其片段：

a.引物选自由生物标志物靶标的互补DNA序列的一部分组成的序列；

b.报告染料或染料/猝灭剂报告标签，其可以准确地计量靶向生物标志物，例如样品中的RNA或DNA量的循环阈值；

c.qPCR仪器，如QuantStudio 6，用于基于生物标志物模板的扩增准确确定报告基因/染料信号。

川崎病生物标志物组，包括选自IFI27、C19ORF59、CACNA1E、CASP5、CR1、CLIC3、CRTAM、FKBP5、HGF、IL1RL1、KLHL2、MAPK14、NKTR、SLC11A1、S100A12、S100A9、TLR7和ZHF185的一种或多种生物标志物。

进一步地，包括C19ORF59和IFI27。

进一步地，所述的川崎病生物标志物组包括C19ORF59、IFI27、S100A12和S100A9。

进一步地，所述生物标志物组包括C19ORF59、IFI27、S100A12、S100A9、CLIC3和SLC11A1。

进一步地，所述的川崎病生物标志物组包括C19ORF59、IFI27、S100A12、S100A9、CLIC3、SLC11A1、CACNA1E和LGALS2。

进一步地，所述的川崎病生物标志物组包括C19ORF59、IFI27、S100A12、S100A9、CLIC3、SLC11A1、CACNA1E、LGALS2、ABCC1和CAMK4。