一种检测变异链球菌的非酶复合电极及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及微生物检测技术领域，具体是一种检测变异链球菌的非酶复合电极及其制备方法和应用。

背景技术

龋病是一种多因素细菌感染性疾病，作为龋病的主要致病菌，变异链球菌(Streptococcus mutans，S.mutans)的定量监测对于早期龋病的预防和诊断具有重要意义。

目前，现有的预测龋病发生危险因素的传统方法包括Dentocult SM、DentoculeLB、刃天青纸片法以及定量聚合酶链反应(PCR)技术。这些方法存在操作耗时长、定量困难、成本高等问题；且涉及昂贵的大型仪器，无法实现人群自行检测。此外，现有技术已开发的一系列以抗体、抗菌肽、凝集素、万古霉素和适配体为识别元件的电化学传感器，在真实唾液样本中的变异链球菌检测中存在灵敏度低、选择性差和长期稳定性差等问题，还需要添加外部氧化还原信号探针，无法实现细菌的即时原位检测。

发明内容

本发明的目的在于提供一种检测变异链球菌的非酶复合电极的制备方法，以解决上述背景技术中提出的问题。

为实现上述目的，本发明实施例提供如下技术方案：

一种检测变异链球菌的非酶复合电极的制备方法，其包括以下步骤：

在工作电极上电沉积羧基化碳纳米管，制得c-MWCNTs电极；

将c-MWCNTs电极置于活化溶液中进行活化，再进行冲洗、干燥，接着在活化后的c-MWCNTs电极表面滴涂变异链球菌特异性适配体进行固定处理，得到Ap t/c-MWCNTs电极；

将亚甲基蓝、吡咯、变异链球菌模板置于Apt/c-MWCNTs电极上进行电聚合，以制备分子印迹聚合物薄膜，然后去除变异链球菌模板，得到所述非酶复合电极。

优选地，在工作电极上电沉积羧基化碳纳米管，制得c-MWCNTs电极的步骤，具体包括：

将羧基化碳纳米管和十二烷基硫酸钠添加至超纯水中，并进行超声分散，得到分散液；

通过施加恒定电位在工作电极上电沉积分散液，然后，用蒸馏水洗涤，除去残留的十二烷基硫酸钠，得到c-MWCNTs电极。

优选地，所述工作电极为丝网印刷电极。

优选地，所述活化溶液包括200-300mM的1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺以及50-80mM的N-羟基丁二酰亚胺。

优选地，所述变异链球菌特异性适配体为氨基修饰的适配体，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:1所示。

优选地，电聚合的方法为：在含有0.1-0.3M的KCl、0.02-0.04M的亚甲基蓝、0.4-0.5M的吡咯和10

优选地，电聚合的电位范围为-0.8V至+0.9V，扫描速率为40-60mV/s，聚合圈数为15-25。

本发明实施例的另一目的在于提供一种采用上述制备方法制得的非酶复合电极。

本发明实施例的另一目的在于提供一种上述非酶复合电极在制备用于检测变异链球菌的传感器中的应用。

本发明提供的检测变异链球菌的非酶复合电极的制备方法，通过采用变异链球菌特异性适配体(Aptamer，Apt)联合分子印迹聚合物(Molecularly imprinte d polymers，MIP)构建以变异链球菌为检测对象的高特异性传感器材料(即非酶复合电极)。其中，Apt是一段具有识别和结合特定菌株能力的寡核苷酸序列，MIP是一种具有识别特性的分子聚合材料，能够形成与细菌互补的印迹空腔，具有成本低、高稳定性和高靶点结合率等优点，为变异链球菌的检测提供了一个实时、无创、精确、稳定和低成本的解决方案。

附图说明

图1为本发明实施例提供的非酶复合电极的制备流程和传感原理示意图。

图2为本发明实施例制备的Apt/MIP传感器性能评估及唾液变异链球菌检测流程图。

图3为本发明实施例制备的Apt/MIP电极的SEM形貌表征图。

图4为本发明实施例制备的不同电极的循环伏安法(CV)表征结果图。

图5为本发明实施例制备的不同电极的电化学阻抗谱(EIS)表征结果图。

图6为本发明实施例制备的S.mutans/PPy/MB/Apt电极的EDS元素分析结果图。

图7为本发明实施例制备的Apt/MIP电极的EDS元素分析结果图。

图8为本发明实施例制备的Apt/MIP传感器的变异链球菌浓度与MB电流的线性关系。

图9为本发明实施例制备的Apt/MIP传感器用计时电流法表征传感器重现性。

图10为本发明实施例制备的Apt/MIP传感器用计时电流法表征传感器长期稳定性。

图11为本发明实施例制备的Apt/MIP传感器在人工唾液中变异链球菌浓度与MB电流的线性关系。

图12为本发明实施例制备的Apt/MIP传感器在真实唾液中变异链球菌浓度与MB电流的线性关系。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

在本发明实施例中，解决了人体唾液中约1000种微生物的高特异性识别问题，其中致龋菌的特异性识别对传感器的高效工作至关重要。为了实现这一目标，本发明实施例设计了一种导电聚合物三维网络传感材料，该材料在原位嵌入氧化还原探针，能够提供直接的电信号，从而实现灵敏且无需标记的检测。此外，本发明实施例通过设计适配体和分子印迹技术进行双重分子识别，以在传感电极界面高特异性富集变异链球菌。

本发明聚焦于唾液疾病监测的热点问题，目的是研发一种唾液龋病预测电化学传感器材料(即非酶复合电极)，以实现实时、无创、精确地检测唾液中的变异链球菌数量，从而弥补现有检测方法在龋病预测、易感人群筛查和龋病风险评估方面的不足。该技术具有重大的实际应用价值。通过本发明的应用，医生可以避免进行口腔操作，有效降低患者在牙科治疗过程中的焦虑情绪，实现无创筛查。同时，该非酶复合电极具备实时、在线检测唾液中变异链球菌数量的能力，实现即时龋病预测，提高预测的准确性，进而早期干预治疗，从而降低龋病的发生率。

本发明实施例还优化了制备传感器材料的工艺参数。电极的厚度对于器件信号的稳定性起着决定性作用，而电极与基底的粘结性则决定了传感器的使用寿命。此外，识别元件与电极的固定和结合方式以及界面电子传递的增强和界面电阻的降低，可以进一步提高传感器的灵敏度。因此，本发明实施例需要进一步优化和完善这些参数。

具体的，在本发明实施例中，通过采用羧基化多壁碳纳米管(c-MWCNTs)作为电极基底材料，利用吡咯单体进行电聚合形成导电聚吡咯(Polypyrrole，PP y)，制备了一种三维网络结构，并将亚甲基蓝(Methylene Blue，MB)作为嵌入式氧化还原探针。通过在MIP印迹空腔内选择性结合变异链球菌，阻断MB电子转移途径，从而降低MB的氧化或还原电流。这种电流的减少程度反映了唾液中变异链球菌的浓度，可作为分析信号。本发明实施例制得的非酶复合电极具有较宽的检测范围；通过实时唾液分析，本发明实施例建立了唾液中变异链球菌浓度与人体口腔健康状况和龋病预测之间的精确关联，突出了其在临床预防和诊断口腔疾病方面的潜力。具体的技术方案如下：

在本发明的一个实施例中，如附图1所示，提供了一种检测变异链球菌的非酶复合电极的制备方法，其包括以下步骤：

S1、采用计时电流法(CA)在工作电极上电沉积羧基化碳纳米管(c-MWC NTs)，制得c-MWCNTs电极；具体的，将20-30mg的羧基化碳纳米管和15-25mg的十二烷基硫酸钠添加至10-15mL的超纯水中，并进行超声分散15-30min，得到分散液；接着，通过施加-2.0V的恒定电位在工作电极上电沉积分散液2000s，然后，用蒸馏水洗涤，除去残留的十二烷基硫酸钠，得到c-MWCNTs电极。

需要说明的是，工作电极可以采用丝网印刷电极(SPE)，利用丝网印刷电极制得的电极可以记为c-MWCNTs/SPE电极，下同。

S2、将c-MWCNTs/SPE电极置于活化溶液中进行活化30min，再用水进行冲洗并在氮气流下干燥，接着在活化后的c-MWCNTs/SPE电极表面滴涂4-15μM的变异链球菌特异性适配体(Apt)进行固定处理，置于1-5mM乙醇胺(pH＝8)中，保持40min，以去除未反应的羧酸基团；然后，用PBS溶液洗涤电极，保持40min，以去除非特异性吸附的适配体，得到Apt/c-MWCNTs/SPE电极。

其中，活化溶液包括200-300mM的1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺(EDC)以及50-80mM的N-羟基丁二酰亚胺(NHS)；变异链球菌特异性适配体为氨基修饰的适配体，是一种寡核苷酸序列，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:1所示，具体为：5'-NH

S3、将亚甲基蓝(MB)、吡咯(PPy)、变异链球菌(S.mutans)模板(细菌模板)置于Apt/c-MWCNTs/SPE电极上进行电聚合，以制备分子印迹聚合物(MIP)薄膜，得到的电极可命名为S.mutans/PPy/MB/Apt电极，然后将该电极在静态条件下用溶菌酶处理2-3h，用10％的Triton X-100裂解液处理80min，以去除细菌模板，即可得到非酶复合电极，命名为Apt/MIP电极；具体的，在含有0.1-0.3M的KCl、0.02-0.04M的亚甲基蓝、0.3-0.5M的吡咯和10

在本发明的另一个实施例中，还提供了一种上述非酶复合电极在制备用于检测变异链球菌的传感器中的应用。具体的，该传感器可以命名为Apt/MIP电极，包含上述制得的非酶复合电极，其可用于检测唾液样品中的变异链球菌。

下述实施例为本发明在实际应用中的部分具体实施案例，但不局限于此。

实施例1：该实施例提供了一种检测变异链球菌的非酶复合电极的制备方法，其包括以下步骤：

S1、采用计时电流法在工作电极上电沉积羧基化碳纳米管，制得c-MWCNTs电极；具体的，将20mg的羧基化碳纳米管和15mg的十二烷基硫酸钠添加至10mL的超纯水中，并进行超声分散15min，得到分散液；接着，通过施加-2.0V的恒定电位在丝网印刷电极上电沉积分散液2000s，然后，用蒸馏水洗涤，除去残留的十二烷基硫酸钠，得到c-MWCNTs/SPE电极。

S2、将c-MWCNTs/SPE电极置于含有200mM的EDC以及50mM的NHS的活化溶液中进行活化30min，再用水进行冲洗并在氮气流下干燥，接着在活化后的c-MWCNTs/SPE电极表面滴涂4μM的变异链球菌特异性适配体进行固定处理，置于1mM乙醇胺(pH＝8)中，保持40min，以去除未反应的羧酸基团；然后，用PBS溶液洗涤电极，保持40min，以去除非特异性吸附的适配体，得到Apt/c-MWCNT s/SPE电极。其中，变异链球菌特异性适配体为氨基修饰的适配体购自生工生物工程股份有限公司(上海)，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:1所示，具体为：5'-NH

S3、将亚甲基蓝、吡咯、变异链球菌模板置于Apt/c-MWCNTs/SPE电极上进行电聚合，以制备分子印迹聚合物薄膜，得到的电极可命名为S.mutans/PPy/MB/Apt电极，然后将该电极在静态条件下用溶菌酶处理2h，用10％的Triton X-100裂解液处理80min，以去除细菌模板，即可得到非酶复合电极，命名为Apt/MI P电极；具体的，在含有0.1M的KCl、0.02M的亚甲基蓝、0.3M的吡咯和10

此外，作为阴性对照，采用相同的制备方法制备NIP电极(命名为PPy/MB/Apt电极)，其与上述Apt/MIP电极的制备方法的区别只是在电聚合过程中未加入变异链球菌模板。

实施例2：该实施例提供了一种检测变异链球菌的非酶复合电极的制备方法，其包括以下步骤：

S1、采用计时电流法在工作电极上电沉积羧基化碳纳米管，制得c-MWCNTs电极；具体的，将25mg的羧基化碳纳米管和20mg的十二烷基硫酸钠添加至12mL的超纯水中，并进行超声分散20min，得到分散液；接着，通过施加-2.0V的恒定电位在丝网印刷电极上电沉积分散液2000s，然后，用蒸馏水洗涤，除去残留的十二烷基硫酸钠，得到c-MWCNTs/SPE电极。

S2、将c-MWCNTs/SPE电极置于含有250mM的EDC以及70mM的NHS的活化溶液中进行活化30min，再用水进行冲洗并在氮气流下干燥，接着在活化后的c-MWCNTs/SPE电极表面滴涂10μM的变异链球菌特异性适配体(Apt)进行固定处理，置于2mM乙醇胺(pH＝8)中，保持40min，以去除未反应的羧酸基团；然后，用PBS溶液洗涤电极，保持40min，以去除非特异性吸附的适配体，得到Apt/c-MWCNTs/SPE电极。其中，变异链球菌特异性适配体为氨基修饰的适配体购自生工生物工程股份有限公司(上海)，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:1所示，具体为：5'-NH

S3、将亚甲基蓝、吡咯、变异链球菌模板置于Apt/c-MWCNTs/SPE电极上进行电聚合，以制备分子印迹聚合物薄膜，得到的电极可命名为S.mutans/PPy/MB/Apt电极，然后将该电极在静态条件下用溶菌酶处理2.5h，用10％的Triton X-100裂解液处理80min，以去除细菌模板，即可得到非酶复合电极，命名为Apt/MIP电极；具体的，在含有0.2M的KCl、0.03M的亚甲基蓝、0.4M的吡咯和10

实施例3：该实施例提供了一种检测变异链球菌的非酶复合电极的制备方法，其包括以下步骤：

S1、采用计时电流法在工作电极上电沉积羧基化碳纳米管，制得c-MWCNTs电极；具体的，将30mg的羧基化碳纳米管和25mg的十二烷基硫酸钠添加至15mL的超纯水中，并进行超声分散30min，得到分散液；接着，通过施加-2.0V的恒定电位在丝网印刷电极上电沉积分散液2000s，然后，用蒸馏水洗涤，除去残留的十二烷基硫酸钠，得到c-MWCNTs/SPE电极。

S2、将c-MWCNTs/SPE电极置于含有300mM的EDC以及80mM的NHS的活化溶液中进行活化30min，再用水进行冲洗并在氮气流下干燥，接着在活化后的c-MWCNTs/SPE电极表面滴涂15μM的变异链球菌特异性适配体(Apt)进行固定处理，置于5mM乙醇胺(pH＝8)中，保持40min，以去除未反应的羧酸基团；然后，用PBS溶液洗涤电极，保持40min，以去除非特异性吸附的适配体，得到Apt/c-MWCNTs/SPE电极。其中，变异链球菌特异性适配体为氨基修饰的适配体购自生工生物工程股份有限公司(上海)，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:1所示，具体为：5'-NH

S3、将亚甲基蓝、吡咯、变异链球菌模板置于Apt/c-MWCNTs/SPE电极上进行电聚合，以制备分子印迹聚合物薄膜，得到的电极可命名为S.mutans/PPy/MB/Apt电极，然后将该电极在静态条件下用溶菌酶处理3h，用10％的Triton X-100裂解液处理80min，以去除细菌模板，即可得到非酶复合电极，命名为Apt/MI P电极；具体的，在含有0.3M的KCl、0.04M的亚甲基蓝、0.5M的吡咯和10

实施例4：如图2所示，该实施例提供了一种包含上述实施例1制得的Apt/MIP电极的传感器(命名为Apt/MIP传感器)的性能评估方法以及唾液变异链球菌的检测方法，具体如下：

1、对Apt/MIP电极的形貌和电化学性能进行表征。首先，使用扫描电子显微镜(SEM)对Apt/MIP电极的形貌进行观察和分析，其结果如图3所示。然后，利用循环伏安法(CV)和电化学阻抗谱(EIS)对空电极、S.mutans/PPy/MB/Apt电极、PPy/MB/Apt电极、Apt/MIP电极的电化学性能进行测试，结果分别如图4和图5所示。最后，通过X射线能谱(EDS)对S.mutans/PPy/MB/Apt电极和Apt/MIP电极进行元素分析，以进一步验证细菌是否成功聚合在电极上，结果分别如图6和图7所示。

2、在-0.45V的还原电位下，通过计时电流法对变异链球菌进行100秒的电流检测。通过测量在PBS溶液中变异链球菌的浓度范围(10

3、对上述Apt/MIP传感器的选择性、可重复性、长期稳定性和信号稳定性进行评估。通过检测对其他口腔细菌(如金黄色葡萄球菌、粪肠球菌和牙龈卟啉单胞菌)的电流响应，评估该Apt/MIP传感器的选择性。并进一步检测在所有干扰物存在的情况下，添加不同浓度(10

3、为了制备人工唾液样本，使用人工唾液代替传统的PBS溶液，并将一系列已知浓度的变异链球菌重悬于无菌人工唾液中，浓度范围为10

4、根据以下步骤制备真实唾液样本：(1)避免进食、饮水、刷牙或漱口的1小时；(2)上午9点到上午11点之间进行唾液收集；(3)将唾液样本保存在4℃；(4)每个唾液样本一式三份，并直接使用以避免唾液中蛋白质降解和性质变化。在分析之前，真实唾液样品经过离心和过滤两步预处理。首先，样品以1500rpm离心15min以去除固体颗粒，然后通过无菌过滤器(0.22μm)过滤以去除细菌干扰。接下来，通过将不同浓度的变异链球菌重悬于真实唾液中(10

综上所述，本发明的关键点之一是Apt和MIP双重分子识别特性。变异链球菌特异性适配体联合分子印迹聚合物构建以变异链球菌为检测对象的传感器具有卓越的灵敏度和选择性，本发明能够实现对变异链球菌的准确检测。实验结果表明，该传感器具有更宽的变异链球菌检测范围和更低的检测限。

另一个关键点是非酶复合电极的构建。该电极采用耐用材料构建，能够适应连续的长期传感应用。相比于传统的酶复合电极，该非酶复合电极具有更长的使用寿命和更好的稳定性，从而提高了传感器的可靠性和持久性。

此外，本发明还采用了电极原位聚合嵌入式氧化还原探针MB。该探针在电极表面进行原位聚合，并能够提供直接的电信号。通过无需标记的实时电流检测，本发明实现了对变异链球菌的快速和准确检测。这种无标记的检测方法不仅简化了操作流程，还降低了成本和时间，提高了检测的效率。

因此，本发明的创新之处在于将Apt和MIP双重分子识别特性应用于变异链球菌检测中，并构建了耐用的非酶复合电极平台。此外，本发明还引入了电极原位聚合嵌入式氧化还原探针MB，实现了无标记的实时电流检测。这些创新点使得本发明具有广阔的应用前景和商业价值。

以上述依据本发明的理想实施例为启示，通过上述的说明内容，相关工作人员完全可以在不偏离本项发明技术思想的范围内，进行多样的变更以及修改。本项发明的技术性范围并不局限于说明书上的内容。