检测慢性肝炎转化为肝硬化的风险预测位点的引物和方法

技术领域

本发明属生命科学和生物技术领域，特别涉及检测慢性肝炎转化为肝硬化的风险预测位点rs72613567突变的引物，采用普通PCR结合Sanger测序技术，可用于快速检测慢性肝炎患者体内HSD17B13基因的rs72613567位点的突变情况。

背景技术

慢性肝炎是世界范围内的主要疾病之一，导致较高的死亡率。慢性肝炎常见的病因有肝炎病毒(乙肝病毒，丙肝病毒)感染、长期饮酒、非酒精性脂肪肝(NAFLD)、自身免疫性肝炎等。病程呈波动性或持续进行性，如不进行适当的治疗，部分患者可进展为肝硬化。然而，这种疾病的病程在个体之间有差异，这种差异至少在一定程度上归因于遗传风险因素。近年来，基因因素在慢性肝病进展中的作用已成为肝病学界的主要研究领域之一。

最近有研究发现17β-羟基甾体脱氢酶13(HSD17B13)单碱基突变和慢性肝损伤之间的关联。17β-羟基类固醇脱氢酶(17β-HSDs)是一类NAD(P)H/NAD(P)依赖的氧化还原酶，因其可以氧化类固醇的第17位碳而得名。在辅助因子NAD(P)H/NAD(P)

一项大规模研究使用外显子序列方法在四个独立的队列中识别HSD17B13变体和慢性肝损伤之间的关联。结果显示，HSD17B13 rs72613567与降低酒精性和非酒精性肝病的风险相关，包括慢性肝炎进展为肝硬化和脂肪变性进展为脂肪性肝炎。最近丹麦的一项人口研究也表明，携带HSD17B13 rs72613567变异与降低丙氨酸转氨酶(ALT)水平有关，并发现这种降低ALT的效果被脂肪肝和饮酒的遗传风险所放大，提示HSD17B13 rs72613567对酒精性肝病和NAFLD有保护作用。

有功能研究表明，rs72613567由位于编码基因区域(chr4:87310241,GRCh38.p7)附近的一个腺嘌呤插入(A-ins)组成，该插入位点位于内含子6的供体剪接位点附近，导致HSD17B13蛋白发生帧移位和过早截断，造成酶活性的降低。也有报道HSD17B13基因的rs72613567:TA变异影响肝脏脂质稳态。虽然目前作用机制尚不明确，但HSD17B13蛋白在携带rs72613567A-ins等位基因的患者肝脏中表达明显降低，同时降低了慢性肝病进展为肝硬化的风险。这种有益的效应在减少肝损伤甚至在遗传易感性方面可能成为一个潜在的药物靶标。

据文献报道rs72613567:TA在西班牙裔美国人和非洲人(分别为9％和1～8％)中发病率较低，但在东亚人和欧洲人(分别为27～40％和22～31％)中发病率较高。开发检测rs72613567:TA的方法，即可为预防慢性肝炎转化为肝硬化提供风险评估和遗传学指导，也可进一步推动其致病机理的研究和靶向药物的研发。

Sanger测序法是基因检测的主要手段之一，也是基因检测的金标准。通过测序法对HSD17B13 rs72613567:TA突变进行检测，可为慢性肝炎患者的提供风险评估和遗传学指导。本发明中发现HSD17B13基因的rs72613567位点的突变在中国人群中存在较普遍，发生率为44.12％。

发明内容

本发明的目的是提供一种检测慢性肝炎转化为肝硬化的风险预测位点rs72613567突变的引物，采用PCR技术，可用于快速检测慢性肝炎患者体内HSD17B13基因的rs72613567位点的突变情况。所述检测慢性肝炎转化为肝硬化的风险预测位点rs72613567突变情况的引物，包括：

扩增HSD17B13基因的rs72613567位点的引物，其碱基序列为：

HSD17B13-F：TGTAAAACGACGGCCAGTATGGGATGTGGAGGAAGTG

HSD17B13-R：AACAGCTATGACCATGCTATTGGTGTTTTAGTATTTGGGT。进一步地，还包括测序引物，其碱基序列为：

M13 F：TGTAAAACGACGGCCAGT

M13 R：AACAGCTATGACCATG。

引物序列HSD17B13-F和HSD17B13-R是扩增慢性肝炎转化为肝硬化的风险预测位点rs72613567碱基的引物。

本发明还提供了检测慢性肝炎转化为肝硬化的风险预测位点rs72613567突变情况的方法，包括以下步骤：

1.抽提外周血或肌肉组织中的基因组DNA；

2.用PCR扩增步骤1中提取的DNA；

3.对步骤2中的扩增产物进行测序；

4.对测序结果进行判断，确定HSD17B13基因的rs72613567位点是否发生突变；

其中PCR扩增引物为：

扩增HSD17B13基因的rs72613567位点的引物，其碱基序列为：

HSD17B13-F：TGTAAAACGACGGCCAGTATGGGATGTGGAGGAAGTG

HSD17B13-R：AACAGCTATGACCATGCTATTGGTGTTTTAGTATTTGGGT。

进一步地，测序引物碱基序列为：

M13 F：TGTAAAACGACGGCCAGT

M13 R：AACAGCTATGACCATG。

本发明还提供了一种检测慢性肝炎转化为肝硬化的风险预测位点rs72613567突变的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：

(i)血液/组织DNA抽提试剂；

(ii)检测体系PCR扩增反应液：包括扩增HSD17B13基因的rs72613567位点的引物，其碱基序列为：

HSD17B13-F：TGTAAAACGACGGCCAGTATGGGATGTGGAGGAAGTG

HSD17B13-R：AACAGCTATGACCATGCTATTGGTGTTTTAGTATTTGGGT；

(iii)测序体系试剂：包括测序引物，其碱基序列为：

M13 F：TGTAAAACGACGGCCAGT

M13 R：AACAGCTATGACCATG；

(iv)阳性对照品和阴性对照品。

有益效果：一、我国现有肝脏病患者总数约为4亿，其中慢性乙肝感染者约9300万人，丙肝约1300万人，慢性肝炎在我国的发病率较高，每年会有大量慢性肝炎患者发展为肝硬化等疾病。rs72613567：TA作为一种有益突变，可减少慢性肝炎发展为肝硬化的风险。本发明通过对慢性肝炎转化为肝硬化的风险预测位点rs72613567的突变情况进行检测，可为慢性肝炎患者提供风险评估和遗传学建议，具有很好的经济和社会效益。

二、本发明采用PCR技术，通过调整引物浓度、退火温度等反应条件，可使扩增效率达到最佳，构建了稳定的扩增体系。本发明利用测序技术检测患者慢性肝炎转化为肝硬化的风险预测位点rs72613567突变的方法，不仅方法成熟简便、检测敏感性高、特异性好，而且相对荧光定量PCR法降低了检测的成本和难度。

附图说明

图1为扩增引物的琼脂糖凝胶电泳图，M为Marker DL 2000，1～24为血液样品1～24，用本发明引物扩增出目的条带，且目的条带清晰，产物大小正确。

图2为样品检测HSD17B13 rs72613567位点无突变的测序截图。

图3为样品检测HSD17B13 rs72613567位点有杂合突变A/T的测序截图。

图4为样品检测HSD17B13 rs72613567位点有纯合突变A/A的测序截图。

具体实施方式

下面结合具体实施例和附图，进一步阐述本发明。应当注意的是，实施例中未说明的常规条件和方法，通常按照所属领域实验人员常规采用方法：譬如，奥斯柏和金斯顿主编的《精编分子生物学实验指南》第四版，或者按照制造厂商所建议的步骤和条件。

实施例1

一种检测慢性肝炎转化为肝硬化的风险预测位点rs72613567突变的引物，该引物是针对HSD17B13基因的rs72613567突变位点所设计的特异性扩增引物，其碱基序列为：

HSD17B13-F：TGTAAAACGACGGCCAGTATGGGATGTGGAGGAAGTG

HSD17B13-R：AACAGCTATGACCATGCTATTGGTGTTTTAGTATTTGGGT；

一种检测慢性肝炎转化为肝硬化的风险预测位点rs72613567突变的试剂盒，包括

(i)血液/组织DNA抽提试剂；

(ii)检测体系PCR反应液；

(iii)测序体系试剂；

(iv)阳性对照品和阴性对照品。

其中，血液/组织DNA抽提试剂可购自天根DNA抽提试剂盒等商品化试剂。

检测体系PCR扩增反应液包括：2×PCR Buffer；2mM dNTPs；KOD FX DNAPolymerase(1U/μl)；HSD17B13 rs72613567：TA位点上、下游引物(5μM)。

测序体系试剂包括：测序纯化液(ExoI:0.6U，CIP:1.2U)、EDTA(125mmol)、无水乙醇、75％乙醇、HIDI(高度去离子甲酰胺)、测序引物：检测HSD17B13基因的rs72613567的上、下游引物(3.2μm)。

实施例2

血液/细胞/组织基因组DNA抽提试剂盒(天根生物)的操作流程：

(1)抽提血液中的组织DNA：1)抽取300μl血液加入900μl红细胞裂解液，颠倒混匀，室温放置5分钟，期间再颠倒混匀几次。12，000rpm离心1min，吸去上清，留下白细胞沉淀，加200μl缓冲液GA，振荡至彻底混匀。2)加入20μl蛋白酶K溶液，混匀。3)加入200μl缓冲液GB，充分颠倒混匀，70℃放置10分钟，溶液应变清亮，简短离心以去除管盖内壁的水珠。4)加入200μl无水乙醇，充分振荡混匀15秒，此时可能会出现絮状沉淀，简短离心以去除管盖内壁的水珠。5)将上一步所得溶液和絮状沉淀都加入一个吸附柱CB3中(吸附柱放入收集管中)，12，000rpm离心30秒，倒掉废液，将吸附柱CB3放回收集管中。6)向吸附柱CB3中加入500μl缓冲液GD(使用前请先检查是否已加入无水乙醇)，12，000rpm离心30秒，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中。7)向吸附柱CB3中加入700μl漂洗液PW(使用前请先检查是否已加入无水乙醇)，12，000rpm离心30秒，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中。8)向吸附柱CB3中加入500μl漂洗液PW，12，000rpm离心30秒，倒掉废液。9)将吸附柱CB3放回收集管中，12，000rpm离心2分钟，倒掉废液。将吸附柱CB3置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。10)将吸附柱CB3转入一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加100μl洗脱缓冲液TE，室温放置2-5分钟，12，000rpm离心2分钟，将溶液收集到离心管中。

(2)试剂配置：按检测人份数配置检测体系PCR反应液各Xμl，每人份18μl分装：

X＝18μl反应液×(n份标本+1份阳性对照+1份阴性对照+1份空白对照)

n为检测标本数。

(3)加样：加入检测体系PCR反应液中2μl DNA；阳性对照和阴性对照直接加2μl阳性对照品和阴性对照品；空白对照加2μl生理盐水或不加任何物质。

(4)扩增：检测在常规PCR仪上进行，可用仪器包括ABI veriti(美国AppliedBiosystems公司)等。反应条件如下：

PCR扩增体系试剂配制方法如下：

其中，引物序列为：

注：F为上游引物，R为下游引物

(5)电泳：1.5％琼脂糖凝胶电泳，120V，30min，凝胶成像系统观察。

如图1所示，即为24例血液样品以本引物扩增后所得产物的电泳图谱。电泳图的表明本发明所述扩增有效，且条带清晰。

(6)Sanger测序：

取9μl PCR产物与2μl纯化体系。按照以下程序进行纯化：

将1μl纯化产物分别与上、下测序引物按照如下体系进行混合：

测序反应程序：

沉淀环节：

向完成测序反应的产物中加入2μl 125mmol的EDTA，静置5min；加入15μl无水乙醇，漩涡混匀；3700rpm离心30min；倒置离心15sec，加入50ml70％乙醇，漩涡混匀；3700rpm离心15min；倒置离心15sec，置于95℃金属浴上；加入10μl CBL后进行变性5min，最后-20℃2min上测序仪(ABI3730)测序。

(7)结果判断：分别将测序结果与HSD17B13(NC_000004.12)参考序列进行比对，根据实际突变情况对结果进行报告。

实施例3

取34例临床外周血样品，按实施例2所述方法提取基因组、配制试剂并检测。每份样品加入检测体系PCR反应液中2μl。同时做阳性，阴性，空白对照各一份。测序后发现有rs72613567突变的样品15个，突变率为44.12％，与文献报道相符。其中14个样品杂合突变，1个样品纯合突变。34个样品的突变情况见下表，正常样品和阳性样品测序结果如图2～4所示。

序列表

<110> 杭州艾迪康医学检验中心有限公司

<120> 检测慢性肝炎转化为肝硬化的风险预测位点的引物和方法

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

tgtaaaacga cggccagtat gggatgtgga ggaagtg 37

<210> 2

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

aacagctatg accatgctat tggtgtttta gtatttgggt 40

<210> 3

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

tgtaaaacga cggccagt 18

<210> 4

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

aacagctatg accatg 16