一种多肽、促进骨髓间充质干细胞增殖的活性及制备相关培养基的用途

技术领域

本发明属于生物化学领域，涉及多肽及干细胞培养，具体涉及一种多肽、促进骨髓间充质干细胞增殖的活性及制备相关培养基的用途。

背景技术

骨髓间充质干细胞(BMSCs)是一种具有良好的多向分化和自我更新能力的多能干细胞。由于其具有取材方便且易于分离培养、扩增等特点，使其在骨与软组织治疗方面起到了日益广泛的作用。近年来，有关BMSCs的研究得到了扩展，特别在治疗骨科疾病方面中的应用越来越广泛，由于其发挥的临床效果显著，目前已用于多种骨科疾病的替代疗法。

将BMSCs作为骨科工程种子细胞被认为是一种治疗骨病的有效办法。为了减少自体获取BMSCs的量，尽可能降低对机体的影响，取少量BMSCs再进行体外扩增成为提高BMSCs种子细胞获取量的可行办法。

多肽是氨基酸连结成的化合物，由肽键相连，通常指的是由三个或三个以上氨基酸组成的化合物。多肽可包括活性多肽和人工合成多肽，活性多肽作为蛋白质水解产物，具有一定生理作用。人工合成多肽可以根据需要自由控制氨基酸连接顺序，为构建多肽库提供了可能，成为活性筛选的重要来源。

发明内容

本发明目的是克服现有技术的不足，提供一种多肽、促进骨髓间充质干细胞增殖的活性及制备相关培养基的用途。

本发明目的通过下述技术方案得以实现：

一种多肽，其氨基酸序列为SKFIEGIL。

以上序列的多肽用于体外促进骨髓间充质干细胞增殖的用途。MTT实验发现，以上序列的多肽组hBMSCs的增殖活性明显强于对照组，且多肽浓度越高hBMSCs增殖活性越强。这证明，该多肽具有促进hBMSCs增殖的活性，且具有浓度效应。

以上序列的多肽用于制备促进骨髓间充质干细胞增殖的培养基的用途。

有益效果：

本发明提供了一种氨基酸序列为SKFIEGIL的多肽，该多肽在体外可以有效提高BMSCs的增殖活性进而促进其增殖，可以用于制备促进BMSCs增殖的培养基，以取少量BMSCs再进行体外高效扩增进而提高BMSCs种子细胞获取量。

附图说明

图1为多肽的液相检测图；保留时间17.575min，HPLC纯度99.906％。

图2中A为hBMSCs的生长形态，为较均一的长梭形，成鱼群样、漩涡样排列，有方向性，符合hBMSCs生长形态特点；B为茜素红染色结果，诱导组成骨分化明显。

图3为各组吸光度值，多肽Ⅰ组和多肽Ⅱ组吸光度明显高于对照组(P<0.05)，且多肽Ⅱ组吸光度明显高于多肽Ⅰ组(P<0.05)。

图4为流式检测结果，CD44、CD73、CD90阳性率＞95％，CD34、CD45阳性率＜2％。

图5为western blot检测结果，多肽组hBMSCs的干细胞特性蛋白SOX2、OCT4的表达水平与对照组无明显差异，基本一致。

具体实施方式

以下实施例仅用于具体介绍本发明的实质内容，但不以此限定本发明的保护范围。

一、实验材料

序列为SKFIEGIL(Sequence NO.1)的多肽M由南京肽谷生物科技有限公司采用常规固相合成法合成。多肽M的分子式为C

人骨髓间充质干细胞hBMSCs购自上海雅吉生物科技有限公司。收到细胞后，先对细胞培养瓶表面消毒，然后置于37℃、5％CO

DMEM、DMEM/F12培养基和胎牛血清，GIBCO公司。MTT试剂和单抗，碧云天。

人骨髓间充质干细胞成骨诱导分化培养基，上海富雨生物科技有限公司。

二、实验方法

1、hBMSCs培养、传代和成骨诱导鉴定

将hBMSCs用含10％胎牛血清和1％青链霉素的DMEM/F12培养基置于37℃、5％CO

倒置显微镜下观察hBMSCs的生长形态，并采用成骨诱导法鉴定，诱导方法如下：

将生长状态良好的hBMSCs消化重悬后按4×10

2、MTT法检测hBMSCs的体外增殖活性

将生长状态良好的hBMSCs消化重悬后按5×10

3、流式细胞术检测hBMSCs表面标志物表达率

将生长状态良好的hBMSCs消化重悬后按3×10

4、Western blot检测hBMSCs的干细胞特性蛋白表达

将生长状态良好的hBMSCs消化重悬后按4×10

5、统计学分析

应用SPSS19.0统计软件进行统计学分析，多组均数比较用单因素方差分析(ANOVA)，两两组间比较用独立样本t检验，P<0.05为差异有显著性意义。

三、实验结果

1、hBMSCs培养和诱导鉴定

hBMSCs的生长形态如图2中A，为较均一的长梭形，成鱼群样、漩涡样排列，有方向性，符合hBMSCs生长形态特点。茜素红染色结果如图2中B，诱导组成骨分化明显，这符合hBMSCs的特点。

2、hBMSCs体外增殖活性

各组吸光度值如表1和图3，多肽Ⅰ组和多肽Ⅱ组hBMSCs的增殖活性明显强于对照组(与对照组比差异有统计学意义，*P<0.05)，且多肽M浓度越高hBMSCs增殖活性越强(与多肽Ⅰ组比差异有统计学意义，#P<0.05)。

表1各组吸光度值

3、hBMSCs表面标志物表达和干细胞特性蛋白表达

流式检测结果如图4，CD44、CD73、CD90表面标志物表达阳性率均维持在95％以上，CD34、CD45表达阴性。Western blot检测结果如图5，多肽组hBMSCs的干细胞特性蛋白SOX2、OCT4的表达水平与对照组无明显降低。图4和图5结果均表明，多肽M在促进hBMSCs增殖的同时并不会明显降低hBMSCs的干细胞特性。

序列表

<110> 陈飞

<120> 一种多肽、促进骨髓间充质干细胞增殖的活性及制备相关培养基的用途

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Ser Lys Phe Ile Glu Gly Ile Leu

1 5