一种高效强化天然菌群纤维素转化能力的假黄单胞菌及其应用

技术领域

本发明涉及微生物技术领域，特别涉及一种高效强化天然菌群纤维素转化能力的假黄单胞菌及其应用。

背景技术

氢能和生物燃料被视为21世纪最具发展潜力的清洁能源，是当前化石燃料能源的唯一替代产品，有望在实现“碳中和”目标过程中发挥重要作用。以农业废弃物形式存在的木质纤维素是自然界产量和储量最高的多糖，以其为原料生物生产氢气和乙酸、丁酸等生物燃料物质，被认为是一种可持续且低成本地实现碳中和的方法。木质纤维素结构极其复杂，采用单一微生物进行处理难以实现高效的降解和产氢。多种菌株的混合体系有助于通过菌间协同关系，优化纤维素酶系，大幅度提升纤维素降解速率。

但是复合微生物转化木质纤维素产氢产生物燃料目前仍面临较多的问题。一方面，由于纤维素降解相对困难，如何获得高效的纤维素降解体系、为产氢提供更丰富的底物和能量仍是最核心的问题之一。同时，由于复合菌群是通过多菌协同来提升降解效率、解除产物抑制，而在实际发酵过程中，由于培养基的稀释和纤维素底物的吸附，菌体间往往有较大的物理距离，降低了协同作用的效率。此外，木质纤维素前处理有害产物多、复合菌群转化效果较弱、操作复杂性较高等，限制了其进一步应用。

发明内容

有鉴于此，本发明提供了一种高效强化天然菌群纤维素转化能力的假黄单胞菌及其应用，该菌株具有木质纤维素降解能力和吸附周边微生物形成絮凝菌团能力，能够协同其他菌株提高对木质纤维素的降解率，显著提高产氢和产醇量。

假黄单胞菌在制备产氢产醇工程菌群中的应用；包括：在产氢产醇的天然菌群中添加假黄单胞菌，进行菌群的驯化强化，获得产氢产醇工程菌群；

所述产氢产醇的天然菌群以田间堆肥、麦秸垛底层腐殖土或腐烂的农作物秸秆为原料发酵制得。

一些具体实施方案中，所述假黄单胞菌为保藏编号为CGMCC NO:25617的假黄单胞菌(Pseudoxanthomonas suwonensis)。

本发明经研究发现，在产氢产醇的天然菌群中添加假黄单胞菌，能够调控菌群的生长，实现菌群中微生物在底物上的局部富集，显著提升菌间协同效应，从而获得具有显著转化纤维素产氢能力的稳定功能菌群。

本发明中，所述假黄单胞菌优选为保藏编号为CGMCC NO:25617的菌株。

本发明中，所述产氢产醇的天然菌群由如下方法制得：

取田间堆肥、麦秸垛底层腐殖土或腐烂的农作物秸秆，加入秸秆的碱处理浸提液后发酵培养，获得产氢产醇的菌群。

本发明中，秸秆的碱处理浸提液按照本领域常规的碱处理制备即可；对于碱的具体种类和浓度没有特殊要求，本领域常见的种类即可。对秸秆的种类没有特殊要求，本领域常见的均可，如小麦秸秆、玉米秸秆等。本发明的一些具体实施例中，采用浓度为1％(m/v)的NaOH水溶液对秸秆进行碱处理制备秸秆的碱处理浸提液。具体地，参照申请号为201811600068.8的专利“一种人工菌群的纤维素生物转化方法”中碱蒸馏法对小麦秸秆预处理的方法，对秸秆进行处理，收集步骤(3)中水洗流出的液体，获得碱处理浸提液。具体步骤如下：

(1)取粉碎的小麦秸秆1kg，加入浓度为1％(m/v)的NaOH水溶液(含5gNaOH)，混匀。

(2)完成步骤(1)后，将所述小麦秸秆置于蒸馏釜内，通入120℃饱和蒸汽处理30min。

(3)完成步骤(2)后，向所述小麦秸秆中加入盐酸调节pH值至6-8之间，然后水洗至无黑液流出，烘干，得到预处理的小麦秸秆。

本发明中，发酵培养的体系参见申请号为201811600068.8的专利“一种人工菌群的纤维素生物转化方法”中含有纤维素的体系，所述发酵培养的体系除田间堆肥、麦秸垛底层腐殖土或腐烂的农作物秸秆外，还包括如下组分：

KH

一些具体实施例中，本发明所述发酵培养的体系包括如下组分：

1.5gKH

本发明从山东省济宁市采集的小麦田土壤中分离获得菌株AGIS-SC-Cluster-1，经鉴定为假黄单胞菌(Pseudoxanthomonas suwonensis)，其保藏编号为CGMCC NO:25617。

本发明还提供一种产氢产醇工程菌群，包括假黄单孢菌以及如下至少一种菌：

嗜热厌氧杆菌(Thermoanaerobacterium)、巴氏梭菌(Clostridium)、根瘤菌(Rhizobium)、互营温热菌(Tepidanaerobacter)、芽孢杆菌(Bacillus)、热石杆菌(Symbiobacterium)和甲烷袋状菌(Methanoculleus)。

一些具体实施例中，所述假黄单胞菌为保藏编号为CGMCC NO:25617的菌株。

本发明中，所述产氢产醇工程菌群由嗜热厌氧杆菌、巴氏梭菌和本发明所述的假黄单胞菌组成；所述嗜热厌氧杆菌、巴氏梭菌和假黄单胞菌的有效菌数量比为30-50：20-40：10-30；一些具体实施例中，所述有效菌数量比具体为40：30：20。；

本发明中，所述产氢产醇工程菌群由根瘤菌、互营温热菌、巴氏梭菌、芽孢杆菌和所述的假黄单胞菌组成；所述根瘤菌、互营温热菌、巴氏梭菌、芽孢杆菌和假黄单胞菌的有效菌数量比为5-15：10-25：15-35：10-30：5-25；一些具体实施例中，所述有效菌数量比具体为10：15：25：25：15。

本发明中，所述产氢产醇工程菌群由热石杆菌、甲烷袋状菌、巴氏梭菌、嗜热厌氧杆菌和假黄单胞菌组成；所述热石杆菌、甲烷袋状菌、巴氏梭菌、嗜热厌氧杆菌和假黄单胞菌的有效菌数量比为5-15：10-20：15-25：25-35：10-20；一些具体实施例中，所述有效菌数量比具体为10：16：20：30：14。

本发明研究发现，菌株AGIS-SC-Cluster-1具有木质纤维素降解能力和吸附周边微生物形成絮凝菌团能力，大大缩短在底物上的局部微生物间距离，菌间协同效应明显增强，进而提高了对木质纤维素的降解效率，产氢量明显增加。

因此，本发明还提供了所述的假黄单胞菌或所述的复合菌在发酵产氢产醇，或在制备发酵产氢产醇的微生物菌剂中的应用。

本发明中，所述发酵的底物为木质纤维素或含木质纤维素的物料。

其中，所述含木质纤维素的物料包括水稻秸秆、小麦秸秆、玉米秸秆、大豆秸秆、灌木枯枝、废弃纸张等中至少一种。

本发明还提供一种发酵产氢产醇的微生物菌剂，包括本发明所述的假黄单胞菌或本发明所述的复合菌，以及可接受的助剂。

本发明中，对可接受的助剂的具体种类不作特殊限定，本领域常见的均可。

本发明还提供一种发酵产氢的方法，以木质纤维素或含木质纤维素的物料为底物，采用本发明所述的复合菌进行发酵。

一些实施方案中，所述发酵具体为转鼓瓶发酵；所述发酵的温度为30-60℃，时间为3天-30天。

本发明提供的菌株AGIS-SC-Cluster-1具有木质纤维素降解能力和吸附周边微生物形成絮凝菌团能力，大大缩短了在底物上的局部微生物间距离，菌间协同效应明显增强，进而提高了对木质纤维素的降解效率，产氢和产醇量明显增加。

生物保藏说明

Pseudoxanthomonas suwonensis，于2022年08月31日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为:北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC No.25617。

附图说明

图1为转鼓发酵瓶示意图；A为转鼓瓶示意图；B为转鼓瓶发酵过程中转动正视图示意图；C为转鼓瓶发酵过程中俯视图示意图；

图2为实施例1菌群发酵过程中氢气与乙醇、乙酸和丁酸最高产量(*：p＜0.05)；

图3为菌群B和菌群BP发酵过程中氢气与乙醇、乙酸和丁酸最高产量(*：p＜0.05)；

图4为实施例3菌群发酵过程中氢气与乙醇、乙酸和丁酸最高产量(*：p＜0.05)；

图5为菌群A与菌群APT发酵过程中氢气与乙醇、乙酸和丁酸最高产量；

图6为菌群B与菌群BPT发酵过程中氢气与乙醇、乙酸和丁酸最高产量；

图7为对比实施例3菌群发酵过程中氢气与乙醇、乙酸和丁酸最高产量。

具体实施方式

本发明公开了一种高效强化天然菌群纤维素转化能力的假黄单胞菌及其应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

下面结合实施例，进一步阐述本发明：

实施例1

1.天然微生物菌群的筛选

从田间堆肥5-10cm深度，取混合物5g，以“一种人工菌群的纤维素生物转化方法”(201811600068.8)中具体实施方式所述限制性培养基1(参见说明书第0075段)，加入2mL过滤除菌的碱处理浸提液培养后进行培养，筛选获得一个稳定的微生物菌群A；所述菌群A包括Thermoanaerobacterium、Clostridium、Bacillus、Ureibacillus属的菌株。

2.菌群的驯化强化

进一步在培养基中加入5g/L的磷酸氢钙，0.1g/L的2-溴乙烷磺酸(BES)，0.1mL/L二氯甲烷，向菌群A中以菌体湿重5:1的比例加入P.suwonensis(中国微生物保藏中心CGMCCNO:25617)，用上述培养基进行连续10次传代培养后，获得稳定的微生物菌群AP。

3.结果：得到天然菌群A和强化菌群AP

经测序分析，新菌群AP中主要组成菌株包括Thermoanaerobacterium、Clostridium、Pseudomonas，其中Thermoanaerobacterium、Clostridium、Pseudomonas比例约为40：30：20。

实施例2

1.天然微生物菌群的筛选

从麦秸垛底层腐殖土中，取混合物5g，加入“一种人工菌群的纤维素生物转化方法”(201811600068.8)中具体实施方式所述限制性培养基1(0075行)，加入2mL过滤除菌的碱处理浸提液后进行培养，筛选获得一个稳定的微生物菌群B；经鉴定菌群B包括包括Rhizobium、Tepidanaerobacter、Clostridium、Bacillus、Pseudomonas、Ureibacillus属的菌株。

2.菌群的驯化强化

进一步在培养基中加入5g/L的磷酸氢钙，0.1g/L的2-溴乙烷磺酸(BES)，0.1mL/L二氯甲烷，向菌群B中以菌体湿重5:1的比例加入P.suwonensis(中国微生物保藏中心CGMCCNO:25617)，用上述培养基进行连续10次传代培养后，获得稳定的微生物菌群BP。

3.结果：

得到天然菌群B和强化菌群BP

经测序分析，新菌群BP中主要组成菌株包括Rhizobium、Tepidanaerobacter、Clostridium、Bacillus、Pseudomonas比例约为10：15：25：25：15。

实施例3

1.天然微生物菌群的筛选

从农村秸秆堆下取严重腐烂的秸秆5g，以“一种人工菌群的纤维素生物转化方法”(201811600068.8)所述培养基，加入2mL过滤除菌的碱处理浸提液后进行培养，筛选获得一个稳定的微生物菌群C；经鉴定菌群C包括Symbiobacterium、Methanoculleus、Clostridium、Thermoanaerobacterium、Pseudomonas、Bacillus属的菌株。

2.菌群的驯化强化

进一步在培养基中加入5g/L的磷酸氢钙，0.1g/L的2-溴乙烷磺酸(BES)，0.1mL/L二氯甲烷，向菌群C中以菌体湿重5:1的比例加入P.suwonensis(中国微生物保藏中心CGMCC:25617)，用上述培养基进行连续10次传代培养后，获得稳定的微生物菌群CP。

3.结果：

得到天然菌群C和强化菌群CP。经测序分析，新菌群CP中主要组成菌株包括Symbiobacterium、Methanoculleus、Clostridium、Thermoanaerobacterium、Pseudomonas比例约为10：16：20：30：14。

应用效果测试例1强化菌群与天然菌群产氢能力的对比

1、菌群的制备：

取制备实施例中获得的菌群A与对应的驯化菌群AP，菌群B与对应的驯化菌群BP，菌群C与对应的驯化菌群CP，以添加了加入2mL过滤除菌的碱处理后浸提液5g/L的磷酸氢钙，0.1g/L的2-溴乙烷磺酸(BES)，0.1mL/L二氯甲烷的“一种人工菌群的纤维素生物转化方法”(201811600068.8)中所述培养基，培养各个菌群，获得发酵种子液。

2、发酵培养：

在转鼓式反应器(图1所示)中采用木质纤维素作为底物，底物浓度为绝干底物30g/L改良培养基，121℃灭菌后待用；以菌群A、AP、B、BP、C和CP为发酵菌种，接种量按湿菌体20g/L培养基；在50℃进行发酵实验。采用气袋收集产生的气体，并在发酵过程中进行连续取样，检测发酵末期氢气、乙醇、乙酸和丁酸含量。

气相色谱检测氢气含量：用气相色谱进样针取0.2mL收集的气体进行气相色谱(赛默飞1310)检测。检测条件：色谱柱，13X分子筛填充柱；检测器TCD，温度250℃；进样口温度80℃；柱箱温度80℃；载气，氮气；流速，10mL/min。采用氢气标准气体进行定量计算。

液相色谱检测乙醇、乙酸和丁酸含量：取0.1mL菌液加入0.9mL的pH2.0的饱和NaCl溶液，混匀后10000rpm离心5min，取上清0.22μm滤膜过滤，液相色谱(安捷伦1260)检测。检测条件：色谱柱，Aminex HPX-87H，300×7.8mm，柱温60℃；检测器，示差检测器(RID)，温度55℃；流动相为5mmol/L硫酸，流速为0.5mL/min。采用标准品制备标准曲线进行定量计算。

3、结果：

发酵结果如图2、图3、图4所示。

4、讨论

结果显示，相较于以不同来源的材料筛选出的原始菌群A、菌群B和菌群C，P.suwonensis(中国微生物保藏中心CGMCC NO:25617)驯化后的菌群在产氢能力上均出现了显著的提升，P＜0.05；同时，菌群AP和CP在产乙醇能力上分别比原始菌群A和C有了显著的提升，P＜0.05；菌群BP在产乙酸能力上比原始菌群B有了显著的提升，P＜0.05。以上结果说明，经P.suwonensis(中国微生物保藏中心CGMCC NO:25617)驯化后的菌群相较原菌群，其产氢能力取得了预料不到的显著提升效果，采用本发明的菌株能够显著提升不同菌群的产氢能力，同时也能一定程度上提升其他副产物的产量。

应用效果测试例2不同菌种强化菌群产氢能力的对比

1、菌群的制备：

以菌群A、B、C为初始菌群，在培养基中加入5g/L的磷酸氢钙，0.1g/L的2-溴乙烷磺酸(BES)，0.1mL/L二氯甲烷后，向菌群中以菌体湿重5:1的比例加入P.taiwanensis(中国微生物保藏中心CGMCC1.10867)，用上述培养基进行连续10次传代培养后，获得稳定的微生物菌群APT、BPT和CPT。

2、发酵培养：

在转鼓式反应器(如图1)中采用木质纤维素作为底物，底物浓度为绝干底物30g/L改良培养基，121℃灭菌后待用；以菌群A、APT、B、BPT、C和CPT为发酵菌种，接种量按湿菌体20g/L培养基；在50℃进行发酵实验。采用气袋收集产生的气体，并在发酵过程中进行连续取样，检测发酵末期氢气、乙醇、乙酸和丁酸含量。

气相色谱检测氢气含量：用气相色谱进样针取0.2mL收集的气体进行气相色谱(赛默飞1310)检测。检测条件：色谱柱，13X分子筛填充柱；检测器TCD，温度250℃；进样口温度80℃；柱箱温度80℃；载气，氮气；流速，10mL/min。采用氢气标准气体进行定量计算。

液相色谱检测乙醇、乙酸和丁酸含量：取0.1mL菌液加入0.9mL的pH2.0的饱和NaCl溶液，混匀后10000rpm离心5min，取上清0.22μm滤膜过滤，液相色谱(安捷伦1260)检测。检测条件：色谱柱，Aminex HPX-87H，300×7.8mm，柱温60℃；检测器，示差检测器(RID)，温度55℃；流动相为5mmol/L硫酸，流速为0.5mL/min。采用标准品制备标准曲线进行定量计算。

3、结果：

发酵结果如图2、图3、图4和表1所示。

表1

↑和↓分别表示含量上升和下降；-表示含量基本无差别；↑↑和↓↓表示含量有显著的上升和下降(p<0.05)。

4、讨论

结果显示，与原始菌群A、B、C相比，以P.taiwanensis驯化的新菌群APT、BPT和CPT，只有CPT菌群在产氢、产醇等方面有一定的提升，菌群APT和BPT发酵性能甚至还出现下降。而与本发明采用P.suwonensis(中国微生物保藏中心CGMCC NO:25617)获得的驯化菌群AP、BP和CP相比(见表1)，采用P.taiwanensis(中国微生物保藏中心CGMCC1.10867)驯化的新菌群APT、BPT和CPT，在产氢和产醇性能上均明显下降，说明基于P.suwonensis(中国微生物保藏中心CGMCC)进行菌群驯化获得的产氢产醇菌群性能得到显著提升，是无法被同属的其他菌株(如P.taiwanensis)复制的。

应用效果测试例3不同亚种菌株强化菌群产氢能力的对比

1、菌群的制备：

以菌群A、B、C为初始菌群，在培养基中加入5g/L的磷酸氢钙，0.1g/L的2-溴乙烷磺酸(BES)，0.1mL/L二氯甲烷后，向菌群中以菌体湿重5:1的比例加入P.suwonensis(德国微生物与细胞保藏中心DSM 17175)，用上述培养基进行连续10次传代培养后，获得稳定的微生物菌群AP2、BP2和CP2。

2、发酵培养：

在转鼓式反应器(如图1)中采用木质纤维素作为底物，底物浓度为绝干底物30g/L改良培养基，121℃灭菌后待用；以菌群A、AP2、B、BP2、C和CP2为发酵菌种，接种量按湿菌体20g/L培养基；在50℃进行发酵实验。采用气袋收集产生的气体，并在发酵过程中进行连续取样，检测发酵末期氢气、乙醇、乙酸和丁酸含量。

气相色谱检测氢气含量：用气相色谱进样针取0.2mL收集的气体进行气相色谱(赛默飞1310)检测。检测条件：色谱柱，13X分子筛填充柱；检测器TCD，温度250℃；进样口温度80℃；柱箱温度80℃；载气，氮气；流速，10mL/min。采用氢气标准气体进行定量计算。

液相色谱检测乙醇、乙酸和丁酸含量：取0.1mL菌液加入0.9mL的pH2.0的饱和NaCl溶液，混匀后10000rpm离心5min，取上清0.22μm滤膜过滤，液相色谱(安捷伦1260)检测。检测条件：色谱柱，Aminex HPX-87H，300×7.8mm，柱温60℃；检测器，示差检测器(RID)，温度55℃；流动相为5mmol/L硫酸，流速为0.5mL/min。采用标准品制备标准曲线进行定量计算。

3、结果：

发酵结果如图5、图6和图7所示。

以上结果显示，与原始菌群A、B、C相比，以P.suwonensis(德国微生物与细胞保藏中心DSM 17175)驯化的新菌群AP2、BP2和CP2，只有CP2菌群在产氢上有一定的提升，菌群AP2和BP2整体发酵性能相较于原始菌群出现下降，说明基于P.suwonensis(中国微生物保藏中心CGMCC NO:25617)进行菌群驯化获得的产氢产醇菌群性能得到显著提升，是无法被同种的其他菌株(P.suwonensis(德国微生物与细胞保藏中心DSM 17175))复制的。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。