一种山药多糖及其制备方法与应用

技术领域

本发明属于制备植物多糖的技术领域，具体涉及一种山药多糖及其制备方法与应用。

背景技术

山药是一种药食两用的食物资源，中医上记载其具有益肾气，健脾胃，止泻痢，化痰涎等多种功效。山药多糖是山药中重要的活性成分，具有多种生物活性；然而由于其粘度大，且山药中含有较高的淀粉，所以对山药多糖的提取造成一定的困难。目前提取山药多糖的方法主要有水提醇沉法、酶提取法、超声提取法、微波提取法、超高压提取法、膜分离法等，但上述的提取方法存在山药多糖提取率低的问题。

发明内容

本发明的目的是提供一种山药多糖的制备方法，提高山药多糖的提取率及其活性。

本发明的又一目的是提供一种由上述方法制得的山药多糖。

本发明的另一目的是提供上述山药多糖在增强免疫力的药物或保健食品中的应用。

为实现上述目的，本发明采用以下方案：

一种山药多糖的制备方法，包括以下步骤：

(1)预处理：山药清洗干净，切片、护色后，烘干、粉碎，得到山药粉；

(2)挤压膨化：向山药粉加入含有α-淀粉酶的溶液，并进行挤压膨化；

(3)酶解超声提取：将经过挤压膨化的山药粉加水打浆，然后进行复合酶解，并进行超声提取，最后用Sevag法除蛋白和醇沉之后，得到山药粗多糖；

(4)多糖纯化：山药粗多糖过DEAE-Sepharose Fast Flow阴离子交换柱，纯化得到山药多糖。

优选地，在步骤(1)中，山药切片成2～4mm的厚度，并迅速放入护色液中；所述护色液，以质量比计，包括0.1～0.3％抗坏血酸，0.1～0.5％柠檬酸；所述烘干的条件为45～55℃，时间为6～8h。

优选地，在步骤(1)中，山药放入护色液后在500～600Mpa、60℃的超高压条件下处理10min。

优选地，在步骤(2)中，向山药粉加入含有α-淀粉酶的溶液，调节水分含量至12～15％；所述α-淀粉酶为高温淀粉酶，其干物质添加量为山药粉质量的0.4～0.9％。

优选地，在步骤(2)中，挤压膨化采用双螺杆挤压膨化机，末端温区温度160～185℃，螺杆转速为190～200rpm。在本发明方法，挤压膨化的工艺条件是关键，发明人经过大量的实验才确定上述工艺条件，有效对山药多糖进行改性，从而提高其活性。

具体地，在步骤(2)中，向山药粉加入含有α-淀粉酶的溶液，搅拌均匀后静置20～30min，然后进行挤压膨化。

优选地，在步骤(3)中，所述复合酶解采用纤维素酶和蛋白酶，其中纤维素酶和蛋白酶的质量比为2:1，两者的总添加量为山药粉质量的0.05～0.2％。

优选地，在步骤(3)中，所述复合酶解的温度为60℃。

优选地，在步骤(3)中，超声的时间为50min，超声温度为60℃、超声功率230～250W。

优选地，基于挤压膨化对山药多糖进行了改性，在步骤(4)的纯化中，DEAE-Sepharose Fast Flow阴离子交换柱分别用蒸馏水和0.1mol/L、0.2mol/L的NaCl溶液进行洗脱，然后将洗脱液采用5000kDa透析袋透析36～60h，收集不同洗脱组分。

优选地，在步骤(4)中，收集0.1mol/L NaCl溶液洗脱组分作为纯化后的山药多糖产品。

本发明提供一种由上述方法制得的山药多糖。

本发明提供上述山药多糖在增强免疫力的药物或保健食品中的应用。与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

(1)本发明采用高温淀粉酶解+挤压膨化工艺能够使山药中的多糖充分释放，并通过进一步的纤维素酶和蛋白酶的复合酶解+超声提取，显著提高多糖的提取率；

而且，本发明利用酶解复合挤压膨化的工艺有效对山药多糖进行改性，降低多糖的分子量，提高山药多糖增强免疫力的活性，并本发明进一步通过柱层析分离纯化得到具有更高免疫活性的山药多糖组分，具有增强免疫力的作用，能用于增强免疫力的药物或保健食品中。

(2)本发明利用挤压膨化-生物酶解耦合增效制备的技术，提高山药多糖的提取率和活性，对拓宽山药的加工利用、提升其附加值都有重要的作用。

附图说明

图1为不同山药粗多糖对巨噬细胞分泌细胞因子的影响；

图2为不同纯化的山药多糖组分对巨噬细胞分泌细胞因子的影响。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步的详细阐述，所述实施例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。

实施例1山药多糖的制备

(1)预处理：新鲜山药清洗干净之后，切片成2～4mm的厚度，放入含有0.3％抗坏血酸和0.2％柠檬酸的护色液中，并在600Mpa、60℃的超高压条件下处理10min，然后将山药片平铺至于烘箱中，50℃烘干7.5小时，打粉，得到山药粉。

(2)挤压膨化：称取山药粉50kg，喷洒高温α-淀粉酶溶液，调节全粉的水分含量为14％，其中淀粉酶的干物质添加量为0.3kg；搅拌均匀后，静置20min，进行挤压膨化，温度为165℃，螺杆转速为190rpm。

(3)酶解超声提取：向经过挤压膨化的山药粉加入其6倍质量的水进行打浆，然后加入总质量为50g的纤维素酶和蛋白酶(两者质量比为2:1)，进行复合酶解，酶解温度为60℃；酶解100min后，进行超声提取，超声50min，超声温度60℃、超声功率230W；然后离心取上清液，用Sevag法除蛋白后减压浓缩至一定体积，并加入乙醇(终浓度为75％)4℃醇沉过夜，95％乙醇洗涤沉淀5次，冷冻干燥得山药粗多糖；采用苯酚-硫酸法测定多糖含量，多糖得率为15.8％。

(4)多糖纯化：山药粗多糖过DEAE-Sepharose Fast Flow阴离子交换柱，分别用蒸馏水和0.1mol/L、0.2mol/L的NaCl溶液进行洗脱，洗脱体积分别对应为3、5、4倍柱体积，用自动收集器分别收集洗脱液，每管收集10mL，苯酚-硫酸法逐管测定多糖含量；并且根据洗脱曲线合并各多糖级分的洗脱液，置于蒸馏水中透析48h，减压浓缩冷冻干燥得到山药多糖组分1、组分2和组分3，用0.1mol/L NaCl溶液洗脱得到的组分2即为纯化后的山药多糖。

实施例2山药多糖的制备

(1)预处理：新鲜山药清洗干净之后，切片成2～4mm的厚度，放入含有0.1％抗坏血酸和0.4％柠檬酸的护色液中，并在500Mpa、60℃的超高压条件下处理10min，然后将山药片平铺至于烘箱中，55℃烘干6小时，打粉，得到山药粉。

(2)挤压膨化：称取山药粉50kg，喷洒高温α-淀粉酶溶液，调节全粉的水分含量为12％，其中淀粉酶的干物质添加量为0.45kg；搅拌均匀后，静置30min，进行挤压膨化，温度为185℃，螺杆转速为200rpm。

(3)酶解超声提取：向经过挤压膨化的山药粉加入其6倍质量的水进行打浆，然后加入总质量为100g的纤维素酶和蛋白酶(两者质量比为2:1)，进行复合酶解，酶解温度为60℃；酶解100min后，进行超声提取，超声50min，超声温度60℃、超声功率250W；然后离心取上清液，用Sevag法除蛋白后减压浓缩至一定体积，并加入乙醇(终浓度为75％)4℃醇沉过夜，95％乙醇洗涤沉淀5次，冷冻干燥得山药粗多糖。

(4)多糖纯化：山药粗多糖过DEAE-Sepharose Fast Flow阴离子交换柱，分别用蒸馏水和0.1mol/L、0.2mol/L的NaCl溶液进行洗脱，洗脱体积分别对应为3、5、4倍柱体积，用自动收集器分别收集洗脱液，每管收集10mL，苯酚-硫酸法逐管测定多糖含量；并且根据洗脱曲线合并各多糖级分的洗脱液，置于蒸馏水中透析48h，减压浓缩冷冻干燥得到山药多糖组分1、组分2和组分3，用0.1mol/L NaCl溶液洗脱得到的组分2即为纯化后的山药多糖。

对比例1

对比例1和实施例1的不同之处在于省去步骤(2)，其他步骤同实施例1。

采用苯酚-硫酸法测定多糖含量，该方法制备的山药粗多糖得率仅为实施例1制备的山药粗多糖得率的66.5％。

对比例2

对比例2和实施例1不同之处在于步骤(2)中喷洒高温α-淀粉酶酶液改为喷洒水，其他步骤同实施例1。

采用苯酚-硫酸法测定多糖含量，该方法制备的山药粗多糖得率仅为实施例1制备的山药粗多糖得率的73.2％。

实施例3山药多糖对细胞的毒性试验

试验对象为：①实施例1、对比例1、对比例2得到的山药粗多糖，以及热水粗提的山药多糖；(其中热水粗提的山药多糖的方法为：90℃浸提2h，离心取上清液，Sevag法除蛋白后减压浓缩至一定体积，加入95％乙醇使其终体积为80％，4℃过夜，无水乙醇洗涤沉淀5次，冷冻干燥得热水提取粗多糖；)

②实施例1得到的山药多糖组分1、组分2和组分3。

针对上述试验对象，具体细胞毒性试验步骤为：

将RAW 264.7巨噬细胞经DMEM完全培养液(含10％胎牛血清、1％双抗)调整浓度为5×10

细胞存活率(％)＝实验孔OD/对照孔OD×100％

结果显示在0～200μg/mL浓度范围内，不同山药粗多糖和山药多糖组分1、组分2和组分3对RAW264.7细胞均无毒性，细胞存活率均在95％以上。

实施例4山药多糖的活性实验

根据实施例3已知，不同山药粗多糖和山药多糖组分1、组分2和组分3对RAW264.7细胞均无毒性，因此在上述浓度范围进行活性实验；具体步骤为：

①将4×10

②将4×10

由图1的结果可知，实施例1得到的粗多糖促使巨噬细胞分泌细胞因子的效果最好。

由图2的结果可知，本发明制得纯化后的山药多糖能够促使巨噬细胞分泌细胞因子，其中山药多糖组分2(即0.1mol/L NaCl溶液洗脱得到山药多糖)相较于其他多糖组分，其效果最好，接近LPS所达到的效果，即山药多糖组分2(即0.1mol/L NaCl溶液洗脱得到山药多糖)相较于其他多糖组分，其具有更好免疫活性和增强免疫力的作用。

本发明可用其他的不违背本发明的精神或主要特征的具体形式来概述。本发明的上述实施例都只能认为是对本发明的说明而不是限制。因此凡是依据本发明的实质技术对以上实施例所作的任何细微修改、等同变化与修饰，均属于本发明技术方案的范围内。