一种抗流感、呼吸道合胞病毒的甘草总皂苷颗粒的制备方法和应用

技术领域

本发明属于本发明属于制药工程领域，具体涉及一种甘草总皂苷的提取方法。

背景技术

呼吸道病毒可经呼吸道感染具备易传播、易感染、易流行、易变异的特点。目前用于临床的治疗呼吸道病毒感染的药物有磷酸奥司他韦、利巴韦林、金刚烷胺类等药物，但此类药物大多存在不良反应大、易产生耐药的缺点；中药具有多成分多靶点的协同作用，不易产生耐药性，不良反应小的优点在治疗呼吸道病毒感染的疾病中具有广阔的应用前景。

甘草被历代名医尊为众药之王，是豆科植物甘草G l ycyrrhi za ura l ens i sFi sch.、胀果甘草G lycyrrhi za i nf l ata Bat.或光果甘草G lycyrrhi za g l abraL.的干燥根和根茎，性味甘,平。归心、肺、脾、胃经。具有补脾益气，清热解毒，祛痰止咳，缓急止痛，调和诸药的功效。甘草的主要化学成分以三萜皂苷类和黄酮类为主；药理活性广泛，具有免疫调节、抗炎、抗病毒、抗溃疡、抗菌、解痉、抗心律失常、抗肿瘤等作用。其成分较为复杂不利于阐明其物质基础及作用机制。

有效部位是指从单味药材或复方中提取到的相近化学性质的一类化合物。有效部位制剂符合中医药传统理论，有利于阐释中药物质基础及作用机制，疗效确切、服用安全可靠、毒副作用低，质量更为稳定可控。甘草可归肺经，具有祛痰止咳的功效；甘草总皂苷是甘草中含量较高的成分群，且具备较强的抗呼吸道病毒、抗炎、免疫调节作用，具备有效部位制剂的条件，目前尚无上市的甘草总皂苷制剂。因此本发明对甘草总皂苷进行提取、纯化、制剂研究提供一种可靠的甘草总皂苷颗粒的制备工艺及抗流感、呼吸道合胞病毒的应用。有利于阐明甘草的物质基础及作用机制，不易产生耐药，不良反应小。

发明内容

本发明提供了一种甘草总皂苷颗粒的加工工艺，包括以下步骤：

(1)甘草总皂苷颗粒的提取：以12倍量50％乙醇提2次，每次1.5h；(2)甘草总皂苷颗粒的纯化：以HPD300型大孔树脂纯化甘草总皂苷，上样液浓度为2～4mg/mL，上样量为3BV，流速为2BV/h，上样完成后，先以超纯水2BV，3BV/h的流速洗脱除杂，再用60％乙醇以2BV/h的流速洗脱4BV；

(3)甘草总皂苷颗粒的制粒：甘草总皂苷颗粒的制粒工艺优化：辅料为糊精:乳糖＝1:5，药辅比为1:1，润湿剂为80％乙醇，制软材，制粒，60℃干燥一小时，整粒。

本发明有益效果为：该甘草总皂苷颗粒的制备工艺富集纯化了甘草总皂苷，该甘草总皂苷颗粒符合中医药传统理论，有利于阐释甘草物质基础及作用机制，疗效确切、服用安全可靠、毒副作用低，质量更为稳定可控。最终该甘草总皂苷颗粒中甘草总皂苷的含量为344.05±5.48mg/g，甘草酸的含量为112.04±4.84mg/g，甘草苷的含量为49.62±2.69mg/g，甘草皂苷G2的含量为15.89±0.57mg/g。该甘草总皂苷颗粒可以多成分多靶点抑制流感、呼吸道合胞病毒。该甘草总皂苷颗粒可改善H1N1所引起的小鼠体重下降、肺组织病理变化情况，降低小鼠肺指数、肺部病毒载量；抑制RSV复制周期的入侵阶段及复制阶段，降低RSV感染小鼠肺指数，降低小鼠肺中病毒载量，改善小鼠肺部病变情况，降低RSV感染小鼠血清中NF-κB、TNF-α水平减轻其炎症反应，提高小鼠血清中I FN-β水平。

附图说明

图1H1N1感染小鼠每日体重变化率与空白组比较，##P<0.01；与模型组比较，**P<0.01，*P<0.05

图2H1N1感染小鼠肺指数情况注：与空白组比较，##P<0.01；与模型组比较，**P<0.01，*P<0.05

图3H1N1感染小鼠肺组织病理变化情况(×200)A空白对照组；B模型对照组；C甘草总皂苷颗粒低剂量组；D甘草总皂苷颗粒高剂量组；E磷酸奥司他韦组

图4H1N1感染小鼠肺组织病毒载量注：与空白组比较，##P<0.01；与模型组比较，**P<0.01，*P<0.05

图5甘草总皂苷颗粒体外抗RSV作用

图6利巴韦林体外抗RSV作用

图7甘草总皂苷颗粒体外抗RSV作用机制注：红色箭头代表药物持续存在的时间，与之相对应的条形图代表在该段时间内病毒的复制能力强弱，l og

图8利巴韦林体外抗RSV作用机制红色箭头代表药物持续存在的时间，与之相对应的条形图代表在该段时间内病毒的复制能力强弱，l og

图9RSV感染小鼠肺指数的变化与空白组比较，##P<0.01；与模型对照组比较，**P<0.01

图10RSV感染小鼠肺组织病理变化情况(×200)A空白对照组；B模型对照组；C甘草总皂苷颗粒低剂量组；D甘草总皂苷颗粒高剂量组；E利巴韦林组

图11RSV感染小鼠肺组织病毒载量与空白组比较，##P<0.01；与模型组比较，**P<0.01、*P<0.05

图12RSV感染小鼠血清中NF-κB水平与空白组比较，##P<0.01；与模型组比较，*P<0.05

图13RSV感染小鼠血清中TNF-α水平与空白组比较，##P<0.01；与模型组比较，**P<0.01、*P<0.05

图14RSV感染小鼠血清中I FN-β水平与空白组比较，#P<0.05；与模型组比较，**P<0.01、*P<0.05

具体实施例

实施例1

本实施例进行体内抗H1 N1实验，用于验证甘草总皂苷颗粒的抗流感功效。将6周龄的BALB/c雌性小鼠分为5组，每组6只，分别为空白对照组、模型对照组、磷酸奥司他韦组(阳性药，每天25.6mg/kg)组、甘草总皂苷颗粒低剂量(每天60mg/kg)组、甘草总皂苷颗粒高剂量(每天300mg/kg)组。小鼠适应性饲养3天后，每天灌胃给药0.2mL/只，空白对照组与模型对照组灌胃等体积生理盐水。在给药的第一天进行H1N1滴鼻造模实验，乙醚麻醉，滴鼻给病毒20 2L/只(给予病毒量为4LD

实施例2

本实施例进行体外抗呼吸道合胞病毒实验，用于验证甘草总皂苷颗粒的抗呼吸道合胞病毒的功效。

在96孔板中接种细胞并在细胞培养箱中培养12h。将甘草总皂苷颗粒配置成的供试品溶液2倍比稀释8个浓度加入到细胞中，每个浓度复孔数为3，并设细胞对照组、空白对照组，在培养箱中培养48h，CPE法观察记录，MTT法检测细胞活性，于酶标仪490nm处检测OD值，通过GraphPad Pr i sm 5软件拟合甘草总皂苷颗粒对Hep2细胞的CC

在96孔板中接种细胞并在细胞培养箱中培养12h。将甘草总皂苷颗粒配置成的供试品溶液2倍比稀释8个浓度加入到细胞中，每个浓度复孔数为3，以100TCI D

实验前24h，将Hep2细胞以8×104个细胞/孔浓度铺入24孔板，以moi＝1感染RSV，设置空白对照组、药物干预组，每种药物[甘草总皂苷颗粒(300μg/mL)利巴韦林(100μM)]分为7组，分别在-4、-2、0、2、4、6、8h时加入，每个时间点重复3孔，-2h时在4℃感染病毒1小时，-1h时将板转移到细胞培养箱培养1小时，0h时PBS洗3遍；加入新培养液，于细胞培养箱中培养，于12h时收集上清液测定病毒毒力。

实施例3

本实施例进行体内抗呼吸道合胞病毒实验，用于验证甘草总皂苷颗粒的抗呼吸道合胞病毒的功效。

将4周龄的BALB/c雌性小鼠分为5组，每组6只，分别为空白对照组、模型对照组、利巴韦林(阳性药，每天36mg/kg)组、甘草总皂苷颗粒低剂量(每天60mg/kg)组、甘草总皂苷颗粒高剂量(每天300mg/kg)组。小鼠适应性饲养3天后，每天灌胃给药0.1mL/只，空白对照组与模型对照组灌胃等体积生理盐水。在给药的第一天进行RSV滴鼻造模实验，乙醚麻醉，滴鼻给病毒100 2L/只(RSV病毒滴度为3.4×10

实施例4

在实施例1实验中每天9:00AM与19:00PM检测小鼠体重并求其平均值作为当天小鼠的体重，连续检测7天，记录小鼠的体重变化率。从感染后第3天开始模型组小鼠体重出现明显下降(P<0.01)，并呈现出一直下降的趋势至感染后的第7天，体重下降了约15％；甘草总皂苷颗粒低剂量组小鼠从第3天开始体重明显下降，第3天甘草总皂苷颗粒低剂量组小鼠体重与模型组相比无显著性差异，从感染后第5天开始，甘草总皂苷颗粒低剂量组小鼠体重下降速度变缓，与模型组小鼠体重相比具有显著性差异(P<0.05)。从第3天至第7天，甘草总皂苷颗粒高剂量组与磷酸奥司他韦组小鼠体重显著高于模型组小鼠(P<0.01)，且在感染后的第7天，体重呈现回升的状态。表明甘草总皂苷颗粒，磷酸奥司他韦可以改善H1N1感染小鼠所造成的体重下降。

实施例5

在实施例1中，在造模的第8天，小鼠称重，处死小鼠后，取肺组织称重，计算肺指数(肺指数＝肺重/体重×100％)。相比于正常对照组，模型对照组肺指数显著上升(P<0.01)，表明RSV感染小鼠模型造模成功，给药后，甘草总皂苷颗粒低剂量组、高剂量组、利巴韦林组小鼠肺指数显著下降(P<0.01)。

实施例6

在实施例1中，小鼠解剖后取小鼠肺组织经多聚甲醛固定，乙醇脱水，二甲苯透化，石蜡包埋，制片，烘干后HE染色，在显微镜下观察肺组织病变情况。空白对照组小鼠肺泡结构清晰，肺泡腔内未见渗出物；模型对照组小鼠肺泡壁增厚，多数肺泡腔变小或几乎看不见，肺泡腔内及肺间质有明显出血；甘草总皂苷颗粒高剂量、低剂量组，磷酸奥司他韦组小鼠肺泡壁增生情况得到改善，肺泡形态趋于正常，肺泡腔出血情况及渗出物情况减轻。

实施例7

在实施例1中，取肺组织，经T IANamp Vi rus DNA/RNA Kit提取肺组织中总RNA，通过Thermo Sc ient if ic Nano Drop One微量分光光度计测定所提RNA的纯度与浓度，通过BeyoFastTMSYBR Green One-Step qRT-PCR Kit对所得样品进行RT-PCR。反应条件为50℃、20mi n cDNA合成，95℃、2mi n初始变性以及40个扩增循环(95℃、15s，和60℃、20s)。各样本的CT值经内参基因GAPDH均一化处理，以模型对照组的H1N1 mRNA CT值为对照，通过2-ΔΔCT法计算各实验组H1N1相对于模型对照组的表达量。H1N1引物序列：For:5′-GTATGGACCTGCCGTAGC-3′，Rev:

5′-GCTTCCACGAGGGTTCTC-3′GAPDH引物序列：For：

5'-GACGATGCAACGGCTGGTCTG-3'，Rev:5′-TTTCCTCAACCTTGTTACGA3'。与模型对照组相比，甘草总皂苷颗粒高剂量组、低剂量组，磷酸奥司他韦组小鼠肺组织中病毒载量显著降低(P<0.01，P<0.05)。

实施例8

在实施例2中检测甘草总皂苷颗粒体外抗呼吸道合胞病毒活性。甘草总皂苷颗粒具有一定的体外抗RSV作用，甘草总皂苷颗粒对RSV的最高抑制率为70％，CC

甘草总皂苷主要作用在-2～0h与4～8h，作用在RSV整个复制周期的入侵阶段及复制阶段。阳性药利巴韦林主要作用在2～8h，作用在RSV整个复制周期的复制阶段。

实施例9

在实施例3中在第五天给药1h后，小鼠称重，乙醚麻醉小鼠后眼球取血，处死小鼠后，取小鼠肺组织计算肺指数(肺指数＝肺重/体重×100％)。相比于正常对照组，模型对照组肺指数显著上升(P<0.01)。给药后，甘草总皂苷颗粒低剂量组、高剂量组、利巴韦林组小鼠肺指数显著下降(P<0.01)。

实施例10

在实施例3中小鼠解剖后取小鼠肺组织经多聚甲醛固定，乙醇脱水，二甲苯透化，石蜡包埋，制片，烘干后HE染色，在显微镜下观察肺组织病变情况。空白对照组小鼠肺泡结构清晰，肺泡腔内未见渗出物；模型对照组小鼠肺泡壁增厚，多数肺泡腔变小或几乎看不见，肺泡腔内及肺间质有明显出血，伴有炎性细胞浸润；甘草总皂苷颗粒高剂量、低剂量组小鼠与利巴韦林组小鼠肺泡壁增生情况得到改善，肺泡形态趋于正常肺泡腔出血情况减轻，炎性细胞浸润情况减轻。

实施例11

在实施例3中取小鼠肺组织，经T IANamp Vi rus DNA/RNA Kit提取肺组织中总RNA，通过Drop One微量分光光度计测定所提RNA的纯度与浓度，通过BeyoFastTMSYBRGreen One-Step qRT-PCR Kit对所得样品进行RT-PCR。反应条件为50℃、20mi n cDNA合成，95℃、2mi n初始变性以及40个扩增循环(95℃、15s，和60℃、20s)。各样本的CT值经内参基因GAPDH均一化处理，以模型对照组的RSV mRNA CT值为对照，通过2-ΔΔCT法计算各实验组RSV相对于模型对照组的表达量。RSV引物序列：For:5′-GCGATGTCTAGGTTAGGA-3′，Rev:5′-GCTATGTCCTTGGGTAGT-3′；GAPDH引物序列：For：

5'-GACGATGCAACGGCTGGTCTG-3'，Rev:5′-TTTCCTCAACCTTGTTACGA3'。与模型对照组相比，甘草总皂苷高剂量组、低剂量组，利巴韦林组小鼠肺组织中病毒载量显著降低(P<0.01，P<0.05)。

实施例12

在实施例3中将小鼠摘眼球取出的血置于EP管中，4℃过夜后在4℃、3000r/mi n条件下离心20mi n，取上清ELI SA法检测血清中TNF-α、I FN-β、NF-κB水平。与空白对照组相比，模型对照组小鼠血清中NF-κB、TNF-α水平显著上升(P<0.01)，表明模型组小鼠感染RSV后可以引起炎症因子水平的升高；甘草总皂苷高剂量组、利巴韦林组可显著降低(P<0.01，P<0.05)小鼠血清中NF-κB、TNF-α表达水平，表明甘草总皂苷颗粒、利巴韦林可显著降低RSV感染小鼠的炎症水平；甘草总皂苷低剂量组虽然可以降低小鼠血清中NF-κB水平，但与模型对照组相比无显著性差异。与空白对照组相比，模型对照组小鼠血清中I FN-β含量显著升高(P<0.01)，表明在感染RSV后模型组小鼠可通过自身免疫调节作用提高I FN-β水平，发挥抗病毒作用。与模型对照组相比，利巴韦林组、甘草总皂苷颗粒高剂量组、低剂量组可显著提高I FN-β表达水平(P<0.01，P<0.05)，表明甘草总皂苷颗粒可提高RSV感染小鼠的免疫调节作用，升高I FN-β水平，清除病毒。