一种miRNA及其在水稻杀虫改良中的应用

技术领域

本发明属于植物基因工程技术领域。具体涉及一种miRNA及其水稻杀虫改良中的应用。通过克隆得到一条二化螟miRNA序列，对该序列的功能验证，进而证明该miRNA序列可用于水稻杀虫改良中。

背景技术

植物介导的RNA沉默是一种转录后双链RNA(dsRNA)介导的基因沉默机制，被证明是一种有效的、环保的防控害虫的替代方法。microRNA(miRNA)是一类长约21～28nt的非编码RNA，它能触发相应的RNA干扰(RNAi)通路来参与生物的发育、生殖和凋亡等各种生理过程。利用天然的植物miRNA前体作为骨架，把人工设计的针对目标基因的21nt的序列替换相应的天然miRNA序列，依循天然miRNA的生物学形成机制可生成成熟的人工miRNA(artificial microRNA,amiRNA)。然后amiRNA可以和天然miRNA一样特异性地沉默目标基因的表达。

目前，在拟南芥、烟草、番茄、水稻、苔藓以及藻类等多种植物中均已成功应用amiRNA技术特异性地抑制内源或外源基因的表达(Niu et al.2006；Schwabet al.2006；Quet al.2007；Khraiwesh et al.2008；Warthmann et al.2008；Molnar et al.2009)。amiRNA干涉与dsRNA 干涉相比具有更高的特异性，不易引起“脱靶”的现象，被誉为“第二代”基因沉默技术(Tang et al.2007)。目前该技术广泛运用在功能基因组研究、品种改良和医疗领域。

现有技术CN 107663522 B涉及一种利用二化螟小RNA培育抗虫水稻的方法。对所获得的二化螟[Chilo suppressalis(Walker)内源小RNA序列进行了功能验证和应用研究，利用高通量小RNA测序和生物信息学分析，得到一条二化螟内源的小RNA csu-53的核苷酸序列，利用csu-53的序列构建人工microRNA(amiRNA)表达载体并转化水稻，离体茎秆接虫试验表明，转基因水稻能显著延长二化螟幼虫在稻株上的生长周期，降低虫重和蛹重。该发明分离的二化螟内源小RNA可应用于水稻抗虫改良中，特别是能应用于抑制水稻害虫二化螟生长中的应用。

现有技术CN 104673827 A本发明属于植物基因工程技术领域。具体涉及二化螟[Chilo suppressalis(Walker)]内源小RNA在水稻抗虫改良中的应用。该发明对所获得的二化螟内源小RNA序列进行了功能验证和应用研究。利用高通量小RNA测序和生物信息学分析的手段，得到一条二化螟内源的小RNA csu-15的DNA序列。

但以上两个专利是通过离体茎秆接虫试验表明，转基因水稻只能降低幼虫的体重，抑制二化螟幼虫的生长，具有一定的抗虫效果，但并不能杀虫。

发明内容

本发明目的之一在于提供一种miRNA，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示或为SEQID NO:1所示的核酸序列经修饰、取代、缺失或添加至少一个碱基获得核酸序列。

SEQ ID NO:1：CGUGGCGGGAAGCGGAUGCGGCC。

优选的，所述修饰包括在如SEQ ID NO:1所示的核苷酸的3’端进行胆固醇和/或四个硫代骨架修饰全链甲氧基修饰，5’端进行两个硫代骨架修饰。

本发明目的之二在于提供一种包括上述miRNA的试剂盒、重组载体或转基因细胞。

本发明目的之三在于提供所述的miRNA或所述试剂盒、重组载体或转基因细胞在昆虫防治中的应用，所述应用为杀灭昆虫虫体。

优选的，所述昆虫为水稻害虫。

进一步优选的，所述水稻害虫为二化螟。

本发明目的之四在于提供所述的miRNA或所述试剂盒、重组载体或转基因细胞在制备杀虫剂中的应用。

本发明目的之五在于提供一种杀虫剂，所述杀虫剂中含有所述的miRNA或所述试剂盒、重组载体或转基因细胞。

本发明目的之六在于提供一种昆虫防治方法，其包括如下步骤：使植物体表达所述的miRNA。

优选的，所述植物体为水稻。

优选的，所述昆虫防治方法，包括如下步骤：

S1、利用所述miRNA体外构建介导基因沉默的miRNA表达盒；将构建好的终表达载体通过农杆菌介导的转化将其转化到水稻中，获得转基因水稻植株。

S2、将上述所获得的转基因水稻植株的新鲜茎秆切成茎段，饲喂给刚孵出的1龄幼虫，置于培养皿中，直至死亡，记录死亡率及个体发育情况；

或者取数头1龄幼虫接到转基因水稻植株上，置于养虫笼中，直至死亡，记录死亡率及植株损伤情况。

优选的，数头为10-30头。

MiRNAs主要通过转录调控、转录抑制、翻译抑制三个方式在后转录水平参与生物的个体发育、细胞分化、细胞凋亡和增殖等生命过程。由于miRNA在昆虫发育中的重要作用，它们的表达抑制和过表达也许都会影响生物的正常发育。因miRNA大小的限制，miRNA的直接敲除并不能很好的实现。一般miRNA功能的研究主要通过增强或减弱目的miRNA的表达来鉴定。现在运用最多的就是利用特定的miRNAs序列，化学合成miRNA拮抗剂(miRNAantagomir)和miRNA激动剂(miRNA agomir)，与普通的miRNA抑制剂(miRNA inhibitor)和miRNA模拟物(miRNA minics)相比，具有更强的细胞亲和力、稳定性和抑制性。通过将miRNA导入生物体内，增强或减弱目的基因的在生物体内的表达，从而影响生物体正常的生长发育过程。尤其是那些防治害虫靶标基因针对性强，且沉默后对水稻害虫有致死性，这些基因可作为理想的候选基因资源，用于创制RNAi介导的新型杀虫作物。

本发明设计合成的miRNA，即miR-1579，具有调控二化螟生殖和发育的功能，对二化螟有致死性，为二化螟的防控提供了一种有效的产品；制备的RNAi介导的新型抗虫作物，绿色环保，能精确靶向靶基因来调控昆虫的生理过程，潜在的风险较小。为作物尤其是水稻害虫的防控提供了新的研究思路，具有很高的研究价值和广阔的应用前景。

附图说明

图1为Vg表达谱；

图2为体外和体内实验证实miR-1579直接靶向Kr-h1；

图3为过表达miR-1579造成二化螟幼虫高死亡率；

图4为转基因水稻的分子特征；

图5为二化螟在转基因水稻上的生物测定结果；

图6为转基因水稻对非靶标昆虫的安全性评价；

图7为转基因水稻的农艺性状评估。

具体实施方式

实施例1miR-1579的获得

1.生物信息学分析miR-1579靶向Kr-h1

由于Vg是一种主要卵黄蛋白前体(YPP)的编码基因，常用于监测卵黄发生的生理阶段。采用qPCR方法检测Vg的表达量，qPCR方法如下：

使用Vg的特异性引物(Cs-Vg-F:GGCTCGCTTGGAGAAGCCTA(SEQ ID NO:2)；Cs-Vg-R:GCCACCTTCTACGGCGATCT(SEQ ID NO:3))结合qPCR试剂盒(Takara)进行qPCR反应，体系为：

TB Green Premix Ex TaqII：5μL

Cs-Vg-F：0.4μL

Cs-Vg-R：0.4μL

DNA模板：2μL

灭菌水：2.2μL

反应条件为：95℃30s；95℃5s，60℃30s，40cycles；溶解曲线：95℃5s，60℃1min，95℃15s，1cycles。

结果表明，在1～7日龄的雌蛹脂肪体中，Vg的表达量呈上升趋势，且在第4天急剧升高(见图1)，这从侧面说明蛹期是二化螟卵黄发生的关键时期。

因此，选取雌蛹第4天的脂肪体送到华大基因(深圳)进行高通量测序以获得小RNA文库。前期实验发现转录因子Kr-h1能调控雌蛹的卵黄发生(Tang et al.,2020)，因此我们使用miRanda v3.3a、TargetScan v7.0和RNAhybrid 2.1.2三个软件预测上述小RNA库中可能靶向Kr-h1的miRNAs。总共预测到10个miRNAs能与Kr-h1结合，分别为：miR-6475-5p、miR-1902、miR-7044-5p、miR-3715、miR-453、miR-2965、novel-miR-77、novel-miR-41和miR-1579结合Kr-h1的CDS区域，novel-miR-23与Kr-h1的3'UTR结合。

2.体内体外实验验证miR-1579靶向Kr-h1

1)细胞内验证：将Kr-h1的CDS和3'UTR插入到psiCHECK-2质粒获得重组质粒，锐博生物公司(广州)合成预测得到的10个miRNAs的模拟物，将重组质粒分别与10个miRNAs共转染到HEK293T细胞中，分析其荧光素酶活性。

构建重组质粒的方法如下：

A.psiCHECK-2质粒线性化：用XhoI和MssI内切酶(Thermo Fisher)将环状的质粒线性化，体系为：10X FastDigest Green buffer：2μL

psiCHECK-2质粒：1μg

XhoI：1μL

MssI：1μL

补DEPC H

反应条件：37℃30min；80℃5min。反应结束后进行凝胶电泳，切胶回收获得纯化后的psiCHECK-2线性化质粒。

B.PCR产物双酶切：首先根据Kr-h1序列及酶切位点设计引物(Cs-Kr-h1-F:ACTCTTATACCCCACTCCCCC(SEQ ID NO:4)；Cs-Kr-h1-R:

GGGTTTTTAAGAGAAGTGCATGGAT(SEQ ID NO:5))

合成引物(生工)，结合高保真酶PrimeSTAR Max Premix(2X)(Takara)按照说明书进行PCR反应，PCR反应体系为：

PrimeSTAR Max Premix(2X):5μL

Cs-Kr-h1-F:1μL

Cs-Kr-h1-R:1μL

Template:1μL

灭菌水：补足至10μL

反应条件为：98℃5min；98℃10s，54-60℃15s，72℃1min 30s；2-4步反应30cycles；72℃10min。

凝胶电泳后切胶回收获得Kr-h1的PCR产物，随后对PCR产物进行双酶切，酶切体系为：PCR产物：0.2μg，其余与上述psiCHECK-2质粒线性化的体系和反应条件相同。反应结束后进行凝胶电泳，切胶回收获得纯化的Kr-h1双酶切产物。

C.连接：使用T4连接酶(NEB)连接PCR产物和psiCHECK-2质粒线性化产物，体系为：

T4 DNA Ligase：1μL

T4 DNA Ligase Buffer(10X):2μL

PCR产物和psiCHECK-2线性化质粒：根据摩尔数之比为3：1加入

Nuclease-free water:补足至10μL

16℃过夜连接，65℃15min。随后将其转化到感受态细胞Trans1-T1中，测序(生工)确定插入片段的正确性，获得psiCHECK-2+Kr-h1重组质粒。

D.HEK293T细胞培养：

不完全培养基：Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium(Gibco)

配制完全培养基：不完全培养基+10％胎牛血清(Gibco)+1％青链霉素混合液

T25培养瓶中加入4mL完全培养基在37℃含有5％ CO

E.细胞转染方法如下：

接种细胞于24孔细胞培养板，在细胞汇合度约为80％时进行细胞转染。

a.稀释miRNA模拟物，终浓度为50nM；

b.稀释转染试剂Lipofectamine

c.不完全培养基稀释psiCHECK-2+Kr-h1重组质粒，每孔质粒：转染试剂的比例为1：1.5，室温孵育5min；

d.混合a、b、c稀释液以制备混合液，室温孵育15min；

e.去掉培养板中旧的完全培养基，加入200μL无双抗的完全培养基(完全培养基中不加1％青链霉素混合液)，随后再加入混合液，37℃的CO

f.双荧光素酶报告系统试剂盒(Promega)检测萤光素酶活性，步骤如下：

将转染结束后的24孔板中的培养基全部丢弃，加入200μL PBS洗涤一遍，再加入100μL 1X Passive Lysis Buffer裂解细胞；置于摇床上室温摇晃15-20min；取10μL裂解液于酶标板中，加入50μL Luciferase Assay Reagent II，多功能酶标仪(Tecan)检测萤火虫萤光素酶活性，再加入50μL Stop&Glo Reagent，检测海肾萤光素酶活性，计算萤火虫萤光素酶/海肾萤光素酶的比值。

结果发现：转染后，miR-3715、miR-453、miR-1902、miR-2965、novel-miR-41、novel-miR-23或miR-6475-5p的萤光素酶活性没有变化，miR-7044-5p和novel-miR-77的萤光素酶活性分别上调1.63倍和1.7倍，而miR-1579的萤光素酶报告活性显著降低(见图2a)，表明miR-1579负调控Kr-h1。

随后，突变miR-1579与Kr-h1结合位点的“种子区”，突变结合位点的方法参考文献(Chiu et al.,2004)设计突变引物：

miR-1579-Rt：GGGGGAGTGGGGTATAAGAGT(SEQ ID NO:6)

miR-1579-Ft：GGGAAGCTTCACGCGGTACCAAGGATCCACACTGGCGAAAGAC(SEQ ID NO:7)

miR-1579-Rs：TCCTTGGTACCGCGTGAAGCTTCCCAGAGTGTTCAAAGGCCG(SEQ ID NO:8)

miR-1579-Fs：ATCCATGCACTTCTCTTAAAAACCC(SEQ ID NO:9)。

突变结合位点的详细步骤为：

首先使用psiCHECK-2+Kr-h1重组质粒作为模板，并将其稀释至100-300pg/μl，使用

5×Prime STAR HS Buffer/2×GCbuffer：10μl/25μL

dNTPs(2.5mM)：4μL

miR-1579-Ft/Fs/Rt/Rs(10μM)：各2μL

质粒模板：2μL

聚合酶：0.5μL

灭菌水：补足至50μL

反应程序：98℃10s，55℃15s，72℃7min，以上三步进行29cycles，72℃15min；琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，切胶回收获得质粒全长。再将获得的质粒全长用限制性内切酶DpnI(Thermo Fisher)消化，消化体系为：

1X FastDigest Buffer：2μL

质粒：500ng

DpnI：1μL

Nuclease-free water:补足至20μL

37℃孵育1h；随后进行变性，复性。按照如下程序99℃3min；65℃5min；30℃15min，最后两个步骤循环两次；将得到的产物直接转化挑取克隆进行测序，验证突变结果。突变位点正确则将突变质粒与miR-1579模拟物按照细胞转染的方法(与具体实施例1-2-1E除了将重组质粒更换为突变质粒外，其余步骤一致)转染到细胞中，双萤光素酶报告系统检测萤光素酶的活性。结果发现突变后显著消除了miR-1579对Kr-h1荧光素酶活性的抑制作用(见图2b)，说明该突变位点为miR-1579与Kr-h1的真正结合位点。

2)体内miR-1579与Kr-h1的表达量呈负相关：根据RNAiso Plus试剂说明书(Takara)提取1-7d的雌蛹和第4天雌蛹的头、卵巢和脂肪体的RNA，提取步骤如下：

研磨棒研磨样品，期间不断加入液氮，直至研磨成粉末状，加入1mL RNAiso Plus形成匀浆液，室温静置5min；12000×g 4℃离心5min；小心吸取上清液，移入新的离心管中；加入200μL氯仿，震荡混合至溶液乳化呈乳白色；室温静置5min；12000×g4℃离心15min；吸取无色上清液转移至另一新的离心管中；向上清中加入0.5-1倍RNAiso Plus体积的异丙醇，上下颠倒离心管充分混匀后，室温下静置10min；12000×g4℃离心10min；弃上清，加入1mL 75％乙醇，轻轻上下颠倒洗涤离心管管壁，7500×g4℃离心5min后小心弃去上清；再用1mL 75％乙醇洗涤一次；弃上清，打开离心管盖，室温干燥沉淀几分钟；加入20-50μLRNase-free水溶解沉淀以获得RNA。用获得的RNA分别检测miR-1579和Kr-h1的表达量，具体步骤如下：

A.检测Kr-h1的时空表达和组织表达：用PrimeScript

A1.去除基因组DNA 反应，体系为：

5×gDNA Eraser Buffer：2μL

gDNA Eraser：1μL

Total RNA：1μg

RNase Free dH2O：补充至10μL

42℃2min；立即放于冰上；

A2.随后进行反转录反应，反转录体系为：

去除基因组DNA反应后的反应液：10μL

PrimeScript RT Enzyme Mix I：1μL

RT Primer Mix：1μL

5×PrimeScript Buffer 2(for Real Time)：4μL

RNase Free dH

37℃15min，85℃5s，4℃短暂保存，-20℃长期保存cDNA。

A3.使用获得的cDNA进行qPCR分析Kr-h1的时空表达和组织表达，qPCR方法与实施例1-1中的方法一致，Kr-h1特异性引物为：Cs-Kr-h1-F：ATGGCGAACGTTGTTACCGC(SEQ IDNO:10)；Cs-Kr-h1-R：GAGTTTCCGCACCGTGTTCC(SEQ ID NO:11)；

B.检测miR-1579的时空表达和组织表达：在锐博生物(广州)设计合成miR-1579特异性qPCR引物，采用miRNA加尾法检测其表达量。根据miDETECT A Track

Poly(A)Tailing反应，体系为：

Total RNA：1μg

5×Poly(A)Polymerase Buffe：2μL

Poly(A)Polymerase：1μL

RNase-free water：up to 10μL

37℃1h，反应结束后置于冰上备用；

然后进行反转录反应，体系为：

RTase mix：4μL

5×RTase Buffer：4μL

miDETECT A TrackTM Uni-RT Primer：2μL

Poly(A)Tailing产物：10μL

42℃1h，72℃10min，所得的cDNA置于冰上备用或-20℃保存。

所得的cDNA进一步用于miRNA qPCR反应，体系为：

miDETECT A TrackTM miRNA Forward Primer 10μM：0.4μL

miDETECT A TrackTM Uni-Reverse Primer 10μM：0.4μL

2×SYBR Green Mix：5μL

cDNA：2μL

RNase-free water：2.2μL

反应条件为：95℃10min；95℃5s，60℃20s，70℃10s，40cycles；溶解曲线：95℃5s，70℃1min，95℃15s，1cycles。

结果表明：1-7d的雌蛹和各组织中miR-1579与Kr-h1的表达量均呈负相关(见图2c-d)，说明miR-1579与Kr-h1在二化螟体内相互作用。

3)RNA免疫共沉淀(RIP)评估miR-1579是否与Kr-h1在体内相互作用。在雌蛹体内分别注射750nL miR-1579激动剂(agomiR-1579，吉玛公司合成，200μM，agomiR在反义链进行修饰，3’端进行胆固醇修饰，5’端两个硫代骨架修饰，3’端四个硫代骨架修饰全链甲氧基修饰)和agomiR-NC(对照)后，使用Ago1抗体(金开瑞，武汉)进行RIP。RIP具体方法如下：使用Magna RIP试剂盒(Millipore)进行。

A.组织预处理：将收集的处理组和对照组的新鲜雌蛹脂肪体用预冷的PBS研磨，800-1500rcf 4℃离心5min，弃上清，收集沉淀；

B.裂解：往沉淀中加入200-300μL的完全RIP裂解缓冲液，吹打混匀，冰上裂解5min，4℃14000rcf离心15min，收集上清，-80℃过夜；

C.磁珠配制：多次颠倒微量离心管以均匀地重悬磁珠，置于1.5mL的离心管中，RIP洗涤液两次清洗磁珠，弃洗涤液后加入100μL RIP洗涤液，再加入5μg Ago-1抗体或正常小鼠IgG抗体，室温旋转培养30min，取出短暂离心，弃上清，随后洗涤磁珠两次，随后将磁珠置于磁力架上，加入900μL的RIP免疫沉淀缓冲液，形成磁珠-抗体复合物的RIP免疫沉淀缓冲液；

D.RNA结合蛋白-RNA复合物免疫共沉淀：快速解冻B步骤所获得的裂解产物，4℃14000rcf离心10min，取100μL上清液于磁珠-抗体复合物的RIP免疫沉淀缓冲液中，4℃共孵育过夜；

E.RNA纯化：取出免疫沉淀反应离心管，放于磁力架中，弃上清，洗涤，弃洗涤液，加入150μL蛋白酶K缓冲液，重悬，55℃孵育30min以消化蛋白，孵育后短暂离心，置于磁力架中，吸取上清液于新离心管中，往新离心管中加入250μL RIP洗涤液，再加入400μL苯酚：氯仿：异戊醇(125：24：1)，振荡，4℃14000rcf离心10min，取上层相于新离心管中，加入400μL氯仿，振荡，4℃14000rcf离心10min，再取上层相于新离心管中，加入50μL Salt SolutionI、15μL Salt Solution II、5μL precipitate Enhancer和850μL无水乙醇，混匀，-80℃过夜以沉淀RNA；取出离心管4℃14000rcf离心30min，弃上清，80％乙醇洗涤沉淀，4℃14000rcf离心10min，弃上清后风干沉淀，加入约20μL DEPC H

F.用PrimeScript

结果表明，相比于对照，agomiR-1579处理后Kr-h1被明显富集(见图2e)，证明了miR-1579与Kr-h1在体内相互作用。

综合上述实验说明：miR-1579直接靶向Kr-h1且抑制其表达。

实施例2miR-1579功能验证

对3龄2天的幼虫注射350nL miR-1579激动剂(agomiR-1579，吉玛公司合成，200μM)以过表达miR-1579，48h收集样品，分别检测miR-1579和Kr-h1的表达量，qPCR检测方法与实施例1-2-2A/2B的方法一致；同时，记录注射后24h、48h、72h、96h和144h幼虫的存活率。结果表明：注射miR-1579激动剂后，miR-1579的表达量显著上升了113.9倍(见图3a)，而Kr-h1的表达下调了83.2％(见图3b)，与对照的死亡率(25.9％)相比，处理组的幼虫死亡率为91.7％(见图3c)；另外，相比于对照，死亡幼虫有更小且更短的虫体(见图3d)，说明miR-1579可以作为一个潜力靶标来防控二化螟。

实施例3转miR-1579水稻的获得及筛选

1.转miR-1579水稻的获得

1)人工miR-1579表达载体的构建：根据Jiang等人(2017)报道的人工miRNA表达盒构建表达盒，本实施例的构建方式与其一致。

2)水稻遗传转化：将构建好的终表达载体pUbi-amiR-1579通过农杆菌介导的转化将其转化到中花11中。农杆菌介导的遗传转化主要包括以下步骤：水稻种子剥壳后消毒；胚愈伤组织诱导；用含卡那霉素培养基筛选阳性水稻转化子；体细胞胚胎发生；愈伤组织生根；完全再生的植株转移到温室继续培养获得T0代水稻(He et al.,2019)。

2.筛选转miR-1579水稻

1)首先采用CTAB法提取30株T0代转基因水稻叶片的基因组DNA，根据说明书用2XCTAB提取液提取(酷来搏，北京)，随后利用hpt基因序列(hpt-F:ACACTACATGGCGTGATTTCAT(SEQ ID NO:12)；hpt-R:TCCACTATCGGCGAGTACTTCT(SEQ ID NO:13))进行PCR分析，获得30株转基因水稻均为阳性转化株(见图4a)。

2)利用hpt互补序列的地高辛(DIG)标记探针(HPT-F：ACACTACATGGCGTGATTTCAT(SEQ ID NO:14)；HPT-R：TCCACTATCGGCGAGTACTTCT(SEQ ID NO:15))测定转基因水稻基因组的整合度和拷贝数，southern blot实验方法如下：

A.基因组DNA及质粒DNA酶切：样品用Hind III进行酶切，基因组DNA10μg，10×Mbuffer 3μL，Hind III 40U，补ddH

B.电泳：用TAE配制0.8％琼脂糖凝胶，酶切产物在30V电压下电泳16h；

C.毛细管法转膜：利用毛细管法将电泳后的酶切产物印迹到尼龙膜；

D.杂交及检测：利用非放射性检测法对样品中目的片段进行检测，结果表明：15个株系中有8个株系含有一个amiR-1579的拷贝，其他株系含有多个拷贝(见图4b)。

3)最后再通过qPCR确定各转基因植株株系中miR-1579的表达量，以此来选择单拷贝且高miR-1579表达的株系进行后续的生物测定实验。结果表明：5个株系miR-1579的表达量较高(C#4、C#5、C#10、C#17、C#22)(图4c)，因而，从中选取3个株系(C#10、C#17、C#22)进行生物测定。

实施例4转基因植株接虫生物测定

具体步骤如下：

生物测定包括室内生物测定和室外生物测定。

(1)室内生物测定：将上述所获得的3个高miR-1579表达水稻株系的新鲜茎秆切成茎段，饲喂给刚孵出的1龄幼虫，置于培养皿中。每3d更换新鲜茎秆，直至死亡，记录死亡率及相关参数。结果表明：与对照相比，以转基因amiR-1579水稻为食的幼虫存活率显著降低。3个转基因株系(C#10、C#17、C#22)在处理后30d的平均死亡率分别为44.4％、51.1％和56.7％。然而，对照组的平均死亡率为12.23％(见图5a)，显示出对二化螟相对较高的抑制作用。如图5b所示，饲喂转基因植物的幼虫表现出死亡和表皮发黑。与对照组相比，株系C#17和C#22的幼虫存活时间较短，但差异不显著(见图5c)。此外，存活二化螟的蛹重显著降低(见图5d，5e)。

(2)室外生物测定：由于株系C#22在室内生物测定中表现出更稳定和更高的抗性，因此分别使用了4株拔节孕穗期T1代转基因和野生型水稻对二化螟的抗性进行了评估。每株水稻接25头1龄幼虫，分别置于养虫笼中，观察植株的损伤程度。结果表明：接虫18d后，二化螟对转基因水稻的危害程度显著低于野生型水稻。具体来说，二化螟只对转基因水稻造成局部组织损伤，而对野生型水稻造成广泛损伤(见图5g，5h，5i，5j)。此外，3株野生型水稻死亡，1株存活，而4株转基因水稻中有3株存活，只局部组织受损。

实施例5转基因水稻对非靶标昆虫的安全性评估

为了确定所述转基因水稻对非靶标昆虫的安全性，使用同一生态位的水稻害虫白背飞虱Sogatella furcifera(WBPH)为代表昆虫，同样饲喂转基因水稻和野生型水稻，每株20头1龄若虫，观察植株损伤情况和飞虱死亡率，记录相关参数，直至死亡。结果表明：转基因miR-1579水稻的种群大小、若虫历期、累积羽化率和成虫寿命均不受影响(见图6a-e)。同时，饲喂转基因miR-1579水稻株系的长翅型飞虱的繁殖力也没有改变(见图6f)。综上，转miR-1579水稻没有影响白背飞虱的发育和生殖，具有较强的专一性。

实施例6转miR-1579水稻农艺性状评估

挑选一个转基因水稻株系(C#10)评估其农艺性状。田间种植转基因水稻和野生型水稻(图7a-c)。从孕穗期到成熟期，分别统计株高、单株分蘖数、穗长、500粒重和结实率5个性状。种子经过清洗和干燥后称重。结果表明：株系C#10与野生型水稻在株高(图7d)、单株分蘖数(图7e)、500粒重(图7f)、穗长(图7g)和结实率(图7h)上均无显著差异，说明转miR-1579没有影响水稻的产量。

参考文献

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