一种用于定量FRET成像的激发光强度自动校准装置及方法

技术领域

本发明属于荧光共振能量转移检测的技术领域，具体涉及一种用于定量FRET成像的激发光强度自动校准装置及方法。

背景技术

荧光共振能量转移(FRET)显微成像技术可以实时原位检测活细胞内蛋白质的相互作用，已经成为在活细胞中研究生化分子动态过程的重要工具。基于受体敏化发射的FRET方法(E-FRET)由于高灵敏性、低损伤和快速的特性被认为是最适合活细胞动态监测的FRET定量检测技术。在E-FRET的实验系统中，多色激发光源的强度波动会导致光谱串扰系数的变化，而光谱串扰系数偏差对应的会导致E

发明内容

本发明的主要目的在于提供一种用于定量FRET成像的激发光强度自动校准装置及方法来克服或至少减轻上述现有技术缺陷。

为了达到上述目的，本发明采用以下技术方案：

本发明的一个方面，提供了一种用于定量FRET成像的激发光强度自动校准装置，包括FRET多波长合束光源、光束分束装置、光强探测器、下位机以及上位机；

所述FRET多波长合束光源用于产生FRET显微成像过程中供体通道和受体通道的激发光；

所述光束分束装置用于接收FRET多波长合束光源产生的激发光并按照预设比例进行分光；

所述光强探测器用于探测分光光路中供体激发光和受体激发光的部分光强；

所述上位机分别与下位机、光强探测器连接，用于接收光强探测器发送的通道的激发光强信息并计算D/A通道光强比值偏差，将光强补偿指令发送至下位机；

所述下位机与FRET多波长合束光源相连，用于根据上位机的指令进行光强控制。

作为优选的技术方案，所述FRET多波长合束光源包括至少两种不同激发波长的光源：供体激发光源，以及受体激发光源；所述FRET多波长合束光源还利用下位机进行通道切换。

作为优选的技术方案，所述光束分束装置设置于FRET多波长合束光源的出射光路前，其分光光路的一路导入到光强探测器中，另一路作为FRET光源输出光。

作为优选的技术方案，所述下位机分别通过串口通信与光强探测器、上位机连接；所述下位机在接收到上位机的控制指令后，通过数模转换以模拟电压调制外触发的方式对FRET多波长合束光源进行通道选择和光强控制。

本发明的另一个方面，还提供了一种用于定量FRET成像的激发光强度自动校准方法，包括以下步骤：

获取D/A通道光源基线值、染料及通道光强比配置；

根据D/A通道光源基线值拟合得到D/A通道光源基线线性区间；

根据光强比配置得到D/A通道光强线性区间的映射关系并获得当前配置下FRET激发光强度调整函数；

根据FRET激发光强度调整函数遍历调制量程范围，得到所有点的D/A通道光强理论值，并利用光强探测器测量D/A通道光强实际值；

根据D/A通道光强理论值和实际值，计算D/A通道光强比值偏差；

判断D/A通道光强比偏差是否小于设定阈值：

当偏差大于阈值时，通过闭环控制补偿D/A通道光强线性区间FRET激发光强度调整函数参数并重新测量、计算D/A通道光强比值偏差；

当偏差小于阈值时，根据上述步骤中定量荧光共振能量转移成像的激发光强度自动校准结果判断串扰系数是否已知；当串扰系数未知时重新测量该通道染料及光强比配置对应的串扰系数，当串扰系数已知时保存当前配置下FRET激发光强度调整函数以及串扰系数结果。

作为优选的技术方案，所述拟合得到D/A通道光源基线线性区间，具体为：

采用Sigmoid函数通过最小二乘拟合D/A通道光源基线，选取所得Sigmoid函数拟合结果的二阶导数的拐点作为线性范围区间的端点得到光源基线线性区间。

作为优选的技术方案，所述当前配置下FRET激发光强度调整函数，具体为：

以上位机的强度调制指令作为自变量，以FRET激发光根据D/A通道光强线性区间的映射关系得到的D/A通道激发光强作为因变量构建函数映射关系，即为当前配置下FRET激发光强度调整函数。

作为优选的技术方案，所述计算D/A通道光强比值偏差，具体为：

所述D/A通道光强比值偏差为FRET激发光强度调整函数映射的D/A通道光强理论值和光强探测器所测得的D/A通道光强实际值的差值。

作为优选的技术方案，所述串扰系数通过单转供体的样本和单转受体的样本测定，具体为：

a＝I

b＝I

c＝I

d＝I

其中，串扰系数a和b是对I

本发明与现有技术相比，具有如下优点和有益效果：

(1)本发明为独立模块设计，可以方便的放置于任意多波长合束光源的输出光路，将多种类型的多波长合束光源校准作为FRET实验系统激发光源。光源类型包括具有对应光谱的LED或激光器以及通过滤光轮或滤光载波片从宽带光谱中滤出期望激发波长的宽带光源。

(2)本发明不仅可以校正补偿多波长合束光源激发光强波动，还可以根据FRET实验要求灵活控制供受体激发光输出强度及供受体强度比，并自动加载当前配置下FRET系统的校正因子，解决了在实验中需要重复对光谱串扰系数和系统参数进行校正的问题，进而为定量FRET检测带来方便。

附图说明

图1是本发明实施例所述一种用于定量FRET成像的激发光强度自动校准装置的原理图；

图2是本发明实施例所述一种用于定量FRET成像的激发光强度自动校准方法的流程示意图；

图3是FRET多色合束光源在经过本发明自动校准后光源稳定性对比结果图；

图4是FRET多色合束光源在经过本发明自动校准后不同通道光强比配置的效果示意图。

附图标号说明：

1、FRET多波长合束光源；1A、供体激发光源；1B、受体激发光源；2、光束分束装置；3、光强探测器；4、下位机；5、上位机。

具体实施方式

为了使本技术领域的人员更好地理解本申请方案，下面将结合本申请实施例中的附图，对本申请实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例仅仅是本申请一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本申请中的实施例，本领域技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本申请保护的范围。

实施例1

如图1所示，本实施例提供了一种用于定量FRET成像的激发光强度自动校准装置，包括FRET多波长合束光源1、光束分束装置2、光强探测器3、下位机4以及上位机5，其中：

所述FRET多波长合束光源1用于产生FRET显微成像过程中供体通道和受体通道的激发光，FRET多波长合束光源1包括至少两种不同激发波长的光源：供体激发光源1A，受体激发光源1B。此光源可以利用下位机4进行快速通道切换并进行光强调制。有利地，此光源具有对应光谱的LED或激光器，在一个实施例中，供体激发光源1A为可产生波长为488nm的固体激光器，受体激发光源1B为可产生波长为561nm的固体激光器。

所述光束分束装置2放置在FRET多波长合束光源1的出射光路前，用于接收FRET多波长合束光源1产生的合束光，并按照一定的比例进行分光，将一部分光导入到光强探测器3中，另一部分光作为FRET光源输出光。在一个实施例中，光束分束装置2为非偏振分束立方，分离透射光和反射光的分光比为90：10。由FRET多波长合束光源1产生的光入射到光束分束装置2后，产生的反射光进入到光强探测器3中，透射光作为FRET光源输出光。

所述光强探测器3放置在光束分束装置2的一个分光光路上，用于探测该分光光路供体激发光和受体激发光的部分光强，光强探测器3和上位机5通过电缆连接，并将收集到的供体/受体(D/A)通道的激发光强信息并发送至上位机5。在一个实施例中，光强探测器3采用的是光电二极管功率计，通过串口通信将光强信息发送至上位机5。

所述下位机4与FRET多波长合束光源1和上位机5通过电缆连接，用于接收上位机5发送的控制指令，对FRET多波长合束光源1进行D/A通道的选通和光强控制。在一个实施例中，下位机采用arduino控制板，通过串口通信的方式与上位机5进行通信，在接收到上位机5的控制指令后，通过数模转换以模拟电压调制外触发的方式对波长为488nm的固体激光器和波长为561nm的固体激光器进行的选通和光强控制。

所述上位机5作为控制器，用于收集光强探测器3发送的D/A通道的激发光强信息，计算D/A通道光强比值偏差后将光强补偿指令发送给下位机4。在一个实施例中，上位机为基于NI公司的labview控制系统。

实施例2

如图2所示，在本申请的另一个实施例中，提供了用于定量FRET成像的激发光强度自动校准方法，包括以下步骤：

(1)S1，获取供体/受体(D/A)通道光源基线值、染料及通道光强比配置。

(1.1)所述D/A通道光源基线值为FRET多波长合束光源供体激发光和受体激发光在调制量程范围内上位机5不同强度调制指令和光强探测器3相应测量值的映射关系。针对不同的FRET多波长合束光源，D/A通道光源基线值也有所不同。

更进一步的，在本实施例中选用荧波长为488nm的固体激光器和波长为561nm的固体激光器不少于m次(m≥3)独立重复测量上位机5强度调制指令和光强探测器3光强测量值的映射关系均值作为D/A通道光源基线值；

(1.2)所述染料为FRET显微成像作为供受体对的荧光标记基团。

更进一步的，在本实施例中选用荧光蛋白对GFP-mCherry作为FRET供受体对，其中供体激发通道采用488nm的激光作为供体的激发光，供体发射通道采用525±15nm的通道做为供体的发射荧光探测通道，受体激发通道采用561nm的激光作为受体的激发光，受体发射通道采用600±15nm的通道做为受体的发射荧光探测通道。

(1.3)所述通道光强比为FRET多波长合束光源供体激发光强和受体激发光强的比值，用于配置出不同实验条件下FRET显微成像最合适的供受体光强，满足检测器中检测到FRET三通道图像在保持合适强度时不会使某个通道照明光强过大产生光漂白。

更进一步的，在本实施例中优选的通道光强比为：

a)1：2；

b)1：1；

c)2：1；

d)3：1；

e)4：1。

(2)S2，根据D/A通道光源基线值拟合得到D/A通道光源基线线性区间。

所述D/A通道光源基线线性区间为FRET多波长合束光源1在接收上位机5强度调制指令后输出光强度为可接受的线性范围区间。在本实施例中，采用Sigmoid函数通过最小二乘拟合D/A通道光源基线，选取所得Sigmoid函数拟合结果的二阶导数的拐点作为线性范围区间的端点得到光源基线线性区间，为一种优选的技术方案。

(3)S3，根据光强比配置得到D/A通道光强线性区间的映射关系并获得当前配置下FRET激发光强度调整函数。

以上位机5强度调制指令作为自变量，以FRET激发光根据D/A通道光强线性区间的映射关系得到的供受体通道激发光强作为因变量，构建函数映射关系，即得FRET激发光强度调整函数。

更进一步的，在本实施例中，上位机5的强度调制指令经过下位机4的数模转换以及电压调制后转化为电压值，该FERT激发光强度调整函数由测量得到的v-mw曲线计算获得。通过D/A通道光源基线线性区间按照已知D/A通道光强比r作为斜率进行线性映射。

(4)S4，根据FRET激发光强度调整函数遍历调制量程范围，得到所有点的D/A通道光强理论值；并利用光强探测器3测量D/A通道光强实际值。

(5)S5，计算D/A通道光强比值偏差。

所述D/A通道光强比值偏差为FRET激发光强度调整函数映射的D/A通道光强理论值和光强探测器3所测得的D/A通道光强实际值的差值。

(6)S6，判断D/A通道光强比偏差是否小于设定阈值，当偏差大于阈值时，通过闭环控制补偿D/A通道光强线性区间FRET激发光强度调整函数参数并重新执行步骤S4-S5；当偏差小于阈值时，执行步骤S7。

(7)S7，根据步骤1-6中定量荧光共振能量转移成像的激发光强度自动校准结果判断串扰系数a、b、c、d是否已知。当串扰系数未知时重新测量该通道染料及光强比配置对应的串扰系数，当串扰系数已知时执行步骤S8。

所述串扰系数通过单转供体的样本和单转受体的样本测定，具体为：

a＝I

b＝I

c＝I

d＝I

其中，串扰系数a和b是对I

测量串扰系数的方法在图2中仅示意性地示出，因为它们在现有技术中已经充分地熟知。

(8)S8，保存当前配置下FRET激发光强度调整函数以及串扰系数结果。

如图3所示是本发明的自动校准前后光源稳定性结果对比，以波长为561nm的受体激发光通道为例，将已获得的光源基线线性区间的自变量调制后作为上位机的指令发送到下位机，通过光源探测器3进行测量，反馈到上位机可得到实际测量的v-mw曲线分布。在稳定的实验环境下进行60次独立重复测量结果显示，经过自动校准后光源稳定性显著提升，达到了定量FRET成像的需要。

本实施例中优选的通道光强比为1：2，1：1，2：1，3：1，4：1。以波长为561nm的通道为例，在稳定的实验环境下进行30次独立重复测量后，本发明自动校准后不同通道光强比配置的效果如图4所示，经过激光器校准后实际的比值非常接近预设的1:2,1:1等比值，误差非常小。

应当理解，本申请的各部分可以用硬件、软件、固件或它们的组合来实现。在上述实施方式中，多个步骤或方法可以用存储在存储器中且由合适的指令执行系统执行的软件或固件来实现。例如，如果用硬件来实现，和在另一实施方式中一样，可用本领域公知的下列技术中的任一项或他们的组合来实现：具有用于对数据信号实现逻辑功能的逻辑门电路的离散逻辑电路，具有合适的组合逻辑门电路的专用集成电路，可编程门阵列(PGA)，现场可编程门阵列(FPGA)等。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。