他克林-司来吉兰衍生物及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及他克林-司来吉兰衍生物及其制备方法和应用，属于医药技术领域。

背景技术

阿尔茨海默病(AD)是痴呆的主要原因，是人类晚年精神衰竭的主要形式之一，临床表现为渐进性记忆力和认知功能障碍以及日常行为异常等，给人类健康、经济、家庭和社会造成巨大负担。随着人口老龄化加剧，全球AD病例数量在1990年至2016年之间增加了117％，2019年的全球痴呆症患者数量超过5000万，预计到2050年将达到1.52亿人。目前，AD的治疗药物主要依赖乙酰胆碱酯酶(AChE)抑制剂(多奈哌齐、加兰他敏、卡巴拉汀)和N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)受体拮抗剂(美金刚)。然而，这些可用药物仅能改善认知和记忆障碍等症状，却不能延缓或阻止AD的进展。痴呆患病率增长及有限的药物治疗效果突显了开发有可能改变疾病发展的药物以有效管理AD的必要性。

AD的发病机制复杂，至今仍未完全破译，但有几种因素在AD的发病机制中起着重要作用，包括乙酰胆碱缺乏、淀粉样蛋白(Aβ)沉积、tau蛋白过度磷酸化形成老年斑(SP)和神经原纤维缠结(NFT)、氧化应激和生物金属失衡以及炎症和细胞周期调控失败。乙酰胆碱酯酶(AChE)主要存在于血液和神经突触中，是水解乙酰胆碱的主要酶(～90)，且已被证明是改善AD症状的最可行的治疗靶点。除AChE外，肝脏中还含有丁酰胆碱酯酶(BuChE或BChE)。这两种酶有将近65％的同源氨基酸序列。在AD进展中，BChE作为一种补偿酶起着重要的作用。AD患者的神经元受到严重损伤时，脑内AChE值下降至正常值的90％，而BChE水平可以提高到生理状态的120％。此外，有研究表明，BChE在老年斑中的沉积与Aβ的渐进性聚集密切相关。因此，BChE也可作为治疗AD的药物靶点。他克林(Tacrine)是第一个被FDA批准用于治疗AD的胆碱酯酶抑制剂，但其临床应用受限于肝毒性。尽管如此，由于其具有良好血脑屏障通透性、可合成性、低分子量和易修饰的结构，在药物化学中已被广泛用作开发无毒副作用的新多功能药物的支架。最近几年，对他克林结构的修饰主要集中在苯环被杂环取代以及基于他克林的分子杂交。

单胺氧化酶(MAO)是一种黄素蛋白，可催化单胺类物质(内源性或外源性)发生氧化脱氨反应，以二聚体的形式存在于线粒体膜上。根据作用底物和选择性抑制剂的不同，MAOs分为MAO-A和MAO-B两种亚型。临床上，MAO-A抑制剂主要用于治疗神经衰弱、抑郁症和焦虑症，MAO-B抑制剂则被认为具有抗AD和帕金森病(PD)的潜力。脑内MAO-B的表达水平随着年龄的增长而增加4倍，导致自由基大量生成，而氧化应激作用也是AD发病机制之一。此外，AD患者常表现出抑郁症状，甚至被认为是AD发生的危险因素。而且，MAO-A也能够影响大脑中神经递质的调节。因此双重抑制MAO-A和MAO-B，通过减缓单胺类神经递质的代谢以及发挥间接抗氧化作用等，可能对AD的治疗有价值。MAO抑制类药物已作为AD治疗的候选者。例如，司来吉兰是一种不可逆的选择性MAO-B抑制剂，在AD的体内外模型中可作为神经保护剂，其中，炔丙胺是司来吉兰的药效团结构。

最近一些候选药物在晚期临床试验中的失败导致了这样的假设：开发能够延缓或阻止AD发展的药物不应该仅针对单独的靶点，而应将对特定靶点的行动与对其他关键靶点的进一步行动结合起来。因此，多靶点配体(MTDL)策略是当前研究的一个重要方向，多靶点药物可以同时作用于一个以上的病理靶点，在调节AD进展方面可能更具前景和更有效。由于ChEs和MAOs是治疗AD的两个关键靶点，许多同时针对ChEs和MAOs的多靶点药物被发现和开发。Ladostigil是一种由卡巴拉汀的氨基甲酸酯部分和雷沙吉兰(rasagiline)的吲哚胺部分开发的新型神经保护剂，其对大脑中的AChE、BChE、MAO-A和MAO-B均具有抑制活性，目前已进入IIb期临床试验。

本申请以他克林和司来吉兰为基础，合成一系列结构新颖的他克林-司来吉兰衍生物，并在体外研究它们对AChE/BuChE和MAO-A/B的抑制作用。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一系列结构新颖且对胆碱酯酶和单胺氧化酶具有显著抑制活性他克林-司来吉兰衍生物及其制备方法和应用。

为解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案：

本发明所述的他克林-司来吉兰衍生物为具有下述式9或10所示结构的化合物或其药学上可接受的盐：

其中，R

进一步的，上述式9所示结构的化合物中，R

更进一步的，上述式10所示结构的化合物中，R

本发明所述他克林-司来吉兰衍生物的制备方法，包括以步骤：

1)取下述式1所示结构的化合物和式2所示结构的化合物置于有机溶剂中，于加热条件下进行反应，得到式5所示结构的化合物；

2)取式5所示结构的化合物置于有机溶剂中，进行氮甲基化反应，得到式6所示结构的化合物；

3)取式6所示结构的化合物和下述式3所示结构的化合物置于有机溶剂中，加入碱性试剂进行反应，得到式7或式8所示结构的化合物；

4)取式7或式8所示结构的化合物和下述式4所示结构的化合物置于有机溶剂中，加入碱性试剂进行反应，得到式9或式10所示结构的化合物；

上述各式中，涉及的R

上述制备方法的步骤1)中，反应通常是在≥60℃的条件下进行，进一步优选是在≥75℃的条件下进行，更优选是在≥90℃的条件下进行。为了提高反应速率，优选是在反应之前加入催化剂。所述的催化剂可以是碘化钠和/或碘化钾，优选采用碘化钾。所述催化剂的用量通常为式1所示结构化合物的摩尔量的0.03～0.1倍。

上述制备方法的步骤2)中，可采用现有已知的方法实现在式5所示结构化合物二级胺的氮甲基化，比如通过向其中加入甲基化试剂进行氮甲基化反应的方法。所述的甲基化试剂的选择及其用量与现有技术相同，具体的，对于甲基化试剂可以是选自甲醛、硫酸二甲酯和碳酸二甲酯中的一种或两种以上的组合；对于甲基化试剂的用量优选为式5所示结构化合物摩尔量的2～5倍。当甲基化试剂为甲醛或者是含有甲醛时，反应优选是在酸性条件下进行，且需要配合加入还原试剂；此时，酸性条件优选是指体系的pH＝4～6，通常采用乙酸调节体系的pH值；还原试剂通常是选自硼氢化钠、硼氢化钾和氰基硼氢化钠中的一种或两种以上的组合；还原试剂的用量通常为式5所示结构化合物摩尔量的2～5倍。而当甲基化试剂为硫酸二甲酯和/或碳酸二甲酯时，反应则优选是在碱性条件下进行，通常是在pH≥8的碱性条件下进行，优选采用有机碱(如三乙胺等)来调节体系的pH值。该步骤中，反应可以在加热或不加热的条件下进行，优选是在常温下进行。

上述步骤2)中的氮甲基化反应对能否得到目标产物有关键的影响。申请人在试验中发现，如果不进行步骤2)的氮甲基化反应，直接采用式5所示结构的化合物进行下一步反应，由于其具有他克林上的亚氨基和羟基或酚羟基，会不可避免地同时发生N-烷基化反应和O-烷基化反应，不能选择性、高效的生成所设计的化合物。此外，当烷基链延长时，他克林上的氨基与羟基或酚羟基可能会同时发生分子内烷基化从而堵住反应位点，影响既定路线设计的反应的进一步进行。

上述制备方法中，涉及的有机溶剂具体可以是选自1,2-二氯乙烷(DCE)、氯仿、氯苯、N,N-二甲基甲酰胺(DMF)、乙腈、正戊醇、正丁醇、叔丁醇、甲醇和乙醇中的一种或两种以上的组合；优选采用N,N-二甲基甲酰胺、乙腈或正戊醇。所述有机溶剂的用量可以根据需要进行确定，通常以能够充分溶解所参加反应的原料为宜。

上述制备方法中，涉及的碱性试剂可以是现有技术的常规选择，优选为选自碳酸钠、碳酸钾、碳酸铯、叔丁醇钾、叔丁醇钠、氢化钠、氢化钾、氢氧化钠和氢氧化钾中的一种或两种以上的组合。对于碱性试剂的用量，步骤3)中优选为式6所示结构化合物摩尔量的1～1.1倍，步骤4)中则优选为式7或式8所示结构化合物摩尔量的3～5倍。申请人在试验中发现，在步骤3)中以氢化钠为碱性试剂可提高产物的收率，而在步骤4)中则是以碳酸钾或碳酸铯为碱性试剂可提高产物的收率。

上述制备方法的步骤3)和4)中，反应都可以在加热或不加热的条件下进行，当选用的碱性试剂为氢化钠或含有氢化钠时，反应优选是在常温或冰浴条件下进行；除此之外的其他碱性试剂，则优选反应是在加热条件下进行。

上述制备方法各步骤中原料的配比均为它们化学计量比，各步骤反应的时间通过薄层层析跟踪监测反应直至完全。

上述方法制备得到的是式9或式10所示结构目标化合物的粗产物，因此，本发明所述方法还包括对制得的目标化合物粗品进行纯化的步骤。具体的，可以采用现有常规的纯化方法对其进行纯化以提高各目标化合物的纯度，如采用硅胶柱层析的方式对粗产物进行纯化。更优选是将反应所得的物料先萃取后再进行硅胶柱层析，以减少硅胶柱的负担。其中，柱层析时用于洗脱的洗脱剂优选为由石油醚(PE)与乙酸乙酯(EA)，或者是二氯甲烷与甲醇组成的混合溶剂。所述的混合溶剂中，石油醚与乙酸乙酯的体积比优选为1：1～1：3，二氯甲烷与甲醇的体积比优选为20：1～10：1。如果涉及萃取，萃取剂与反应时所用的极性溶剂的选择相同，如1,2-二氯乙烷；也可以是如二氯甲烷或乙酸乙酯等常规萃取剂。

为了提高目标化合物的产率，优选是对步骤1)～3)制得的中间产物进行纯化后再进行下一步骤。纯化的操作通常是采用硅胶柱层析，更优选是将反应所得的物料先萃取后再进行硅胶柱层析。其中，对于步骤1)制得的式5所示结构化合物进行柱层析时，用于洗脱的洗脱剂优选为二氯甲烷与甲醇按20：1～10：1的体积比组成的混合溶剂；对于步骤2)制得的式6所示结构化合物进行柱层析时，用于洗脱的洗脱剂优选为石油醚与乙酸乙酯按1：1～1：3的体积比组成的混合溶剂；对于步骤3)制得的式7或式8所示结构化合物进行柱层析时，用于洗脱的洗脱剂优选为石油醚与乙酸乙酯按4：1～1：1的体积比组成的混合溶剂。如果涉及萃取，萃取剂与反应时所用的极性溶剂的选择相同，如1,2-二氯乙烷；也可以是如二氯甲烷或乙酸乙酯等常规萃取剂。

本发明通过试验发现上述他克林-司来吉兰衍生物具有良好的胆碱酯酶(AChE/BuChE)和/或单胺氧化酶(MAO-A/B)的抑制活性以及血脑屏障通透性，因此，本发明还包括上述他克林-司来吉兰衍生物或其药学上可接受的盐在制备胆碱酯酶抑制剂，或者是在制备单胺氧化酶抑制剂，或者是在制备胆碱酯酶/单胺氧化酶双重抑制剂中的应用。更为具体的，是在制备治疗阿尔茨海默病药物中的应用。

进一步的，本发明还包括一种胆碱酯酶抑制剂，或者是一种单胺氧化酶抑制剂，或者是一种胆碱酯酶/单胺氧化酶双重抑制剂，其中包含上述他克林-司来吉兰衍生物或其药学上可接受的盐。

与现有技术相比，本发明提供了一系列结构新颖的他克林-司来吉兰衍生物及它们的制备方法。申请人的试验结果表明，本发明提供的他克林-司来吉兰衍生物具有良好的胆碱酯酶和单胺氧化酶的抑制活性，有望用于治疗阿尔茨海默病，具有很好的潜在药用价值。

具体实施方式

为了更好的解释本发明的技术方案，下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

对以下各实施例中出现的一些简称解释如下：

化合物1表示式1所示结构的化合物，化合物2表示式2所示结构的化合物，化合物3表示式3所示结构的化合物，化合物4表示式4所示结构的化合物，化合物5表示式5所示结构的化合物，化合物6表示式6所示结构的化合物，化合物7表示式7所示结构的化合物，化合物8表示式8所示结构的化合物，化合物9表示式9所示结构的化合物，化合物10表示式10所示结构的化合物。

实施例1：化合物5a～5e的通用制备方法

化合物1中，R

5a:R

5b:R

5c:R

5d:R

5e:R

取化合物1(6.89mmol,1.0equiv.)、KI(0.34mmol,0.05equiv.)置于正戊醇(20mL)中，搅拌溶解后加入化合物2(3-氨甲基苯酚或4-胺甲基苄醇)(13.78mmol，2.0equiv.)，混合物在130℃下搅拌回流8～10h(TLC监测反应)。反应完全后，反应物浓缩至干燥，加水稀释，用EA萃取(30mL×1,20mL×3)。有机相用饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤后减压蒸发，所得残留物经硅胶柱层析纯化(DCM/MeOH：20/1～10/1，v/v)，得到化合物5a～5e，具体表征如下：

化合物3-(((1,2,3,4-tetrahydroacridin-9-yl)amino)methyl)phenol(5a)：收率51％；淡黄色固体；

化合物3-(((7-methyl-1,2,3,4-tetrahydroacridin-9-yl)amino)methyl)phenol(5b)：收率54％；黄色固体；

化合物3-(((7-fluoro-1,2,3,4-tetrahydroacridin-9-yl)amino)methyl)phenol(5c)：收率72％；淡黄色固体；

化合物(4-(((1,2,3,4-tetrahydroacridin-9-yl)amino)methyl)phenyl)methanol(5d)：收率77％；黄色固体；

化合物(4-(((7-methyl-1,2,3,4-tetrahydroacridin-9-yl)amino)methyl)phenyl)methanol(5e)：收率62％；黄色固体；

实施例2：化合物5a、5e的制备

化合物5a：取化合物1(式中R

化合物5e：取化合物1(式中R

实施例3：化合物6a～6e的通用制备方法

化合物5中，R

6a:R

6b:R

6c:R

6d:R

6e:R

分别取化合物5a～5e(4.24mmol,1.0equiv.)溶于DMF(30mL)，再加入40％甲醛溶液(14.84mmol，3.5equiv.)、冰乙酸(4.24mmol,1.0equiv.)(此时体系的pH＝4)，室温下搅拌60min后，加入氰基硼氢化钠(12.72mmol,3.0equiv.)，继续常温搅拌反应6～8h(TLC监测反应)。反应结束后，将反应物倒入适量水中，用EA萃取(20mL×3,10mL×1)。有机相用饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，真空浓缩，所得残留物经硅胶层析纯化(PE/EA：1/1～1/3，v/v)，得到化合物6a～6e，具体表征如下：

化合物3-((methyl(1,2,3,4-tetrahydroacridin-9-yl)amino)methyl)phenol(6a)：收率78％；黄色固体；

化合物3-((methyl(7-methyl-1,2,3,4-tetrahydroacridin-9-yl)amino)methyl)ph enol(6b)：收率80％；黄色固体；

化合物3-(((7-fluoro-1,2,3,4-tetrahydroacridin-9-yl)(methyl)amino)methyl)ph enol(6c)：收率72％；淡黄色固体；

化合物(4-((methyl(1,2,3,4-tetrahydroacridin-9-yl)amino)methyl)phenyl)meth anol(6d)：收率69％；黄色固体；

化合物(4-((methyl(7-methyl-1,2,3,4-tetrahydroacridin-9-yl)amino)methyl)ph enyl)methanol(6e)：收率76％；黄色固体；

实施例4：化合物6a、6e的制备

取化合物5a(4.24mmol,1.0equiv.)溶于DMF(30mL)，再加入硫酸二甲酯(14.84mmol，3.5equiv.)、三乙胺(6.36mmol,1.5equiv.)(此时体系的pH＝9)，室温下搅拌反应8h(TLC监测反应)。反应结束后，将反应物倒入适量水中，用EA萃取(20mL×3,10mL×1)。有机相用饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，真空浓缩，所得残留物经硅胶层析纯化(PE/EA：1/1～1/3，v/v)，得到黄色固体，收率为25％。经核磁氢谱、碳谱及高分辨质谱表征，确定为化合物6a。

取化合物5e(4.24mmol,1.0equiv.)溶于氯仿(20mL)，再加入碳酸二甲酯(14.84mmol，3.5equiv.)、二乙胺(6.36mmol,1.5equiv.)(此时体系的pH＝8)，室温下搅拌反应8h(TLC监测反应)。反应结束后，将反应物倒入适量水中，用EA萃取(20mL×3,10mL×1)。有机相用饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，真空浓缩，所得残留物经硅胶层析纯化(PE/EA：1/1～1/3，v/v)，得到黄色固体，收率为30％。经核磁氢谱、碳谱及高分辨质谱表征，确定为化合物6e。

实施例5：关键中间体7a～7o和8a～8l的通用制备方法

分别取化合物6a～6e(3.10mmol,1.0equiv.)溶于经分子筛预先干燥过的DMF(20mL)中，在氮气氛围的保护下加入NaH(6.20mmol，2.0equiv.，60％mineral oil)于冰浴下搅拌30min，然后加入相应的化合物3(18.6mmol，6.0equiv.)，转为常温搅拌反应12h。未反应的NaH通过加入适量冰水淬灭。反应物用EA(30mL×3)萃取，有机相经饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，真空浓缩，所得残留物用硅胶柱层析(PE/EA：4/1～1/1，v/v)纯化，得到淡黄色到黄色的油状化合物7a～7o和8a～8l。具体表征如下：

化合物7a：收率31％；淡黄色油状物；HRMS(ESI):m/z calcd for C

化合物7b：收率62％；淡黄色油状物；

化合物7c：收率75％；淡黄色油状物；

化合物7d：收率86％；淡黄色油状物；

化合物7e：收率80％；黄色油状物；

化合物7f：收率71％；淡黄色油状物；

化合物7g：收率63％；淡黄色油状物；

化合物7h：收率55％；黄色油状物；

化合物7i：收率75％；黄色油状物；

化合物7j：收率63％；黄色油状物；

化合物7k：收率58％；黄色油状物；

化合物7l：收率84％；黄色油状物；

化合物7m：收率69％；黄色油状物；

化合物7n：收率55％；黄色油状物；

化合物7o：收率82％；黄色油状物；

化合物8a：收率45％；黄色油状物；HRMS(ESI):m/z calcd for C

化合物8b：收率60％；黄色油状物；

化合物8c：收率74％；黄色油状物；

化合物8d：收率65％；黄色油状物；

化合物8e：收率58％；黄色油状物；

化合物8f：收率78％；黄色油状物；

化合物8g：收率85％；淡黄色油状物；HRMS(ESI):m/z calcd for C

化合物8h：

化合物8i：收率51％；淡黄色油状物；

化合物8j：收率65％；淡黄色油状物；

化合物8k：收率55％；淡黄色油状物；

化合物8l：收率67％；淡黄色油状物；

实施例6：目标化合物9a～9o和10a～10l的通用制备方法

将相应的化合物7a～7o或8a～8l(2.32mmol,1.0equiv.)溶于乙腈(23mL)中，加入化合物4(4.64mmol，2.0equiv.)，然后再加入碳酸钾(11.60mmol，5.0equiv.)，70℃回流搅拌12h(TLC监测)。反应结束后，真空旋干乙腈，再加入适量水，用DCM萃取水相(30mL×3)，合并有机相，先用饱和食盐水洗涤1次，再用无水硫酸钠干燥，过滤后减压蒸除溶剂，所得残留物用硅胶柱层析(PE/EA:1/1～1/3，v/v)纯化，得到淡黄色到黄色的油状化合物9a～9o和10a～10l，具体表征如下：

目标化合物9a：收率62％；淡黄色油状物；

目标化合物9b：收率57％；淡黄色油状物；

目标化合物9c：收率80％；淡黄色油状物；

目标化合物9d：收率86％；淡黄色油状物；

目标化合物9e：收率83％；黄色油状物；

目标化合物9f：收率75％；淡黄色油状物；

目标化合物9g：收率66％；淡黄色油状物；

目标化合物9h：收率85％；黄色油状物；

目标化合物9i：收率86％；黄色油状物；

目标化合物9j：收率87％；黄色油状物；

目标化合物9k：收率78％；黄色油状物；

目标化合物9l：收率78％；黄色油状物；

目标化合物9m：收率83％；黄色油状物；

目标化合物9n：收率77％；黄色油状物；

目标化合物9o：收率77％；黄色油状物；

目标化合物10a：收率37％；黄色油状物；

目标化合物10b：收率89％；黄色油状物；

目标化合物10c：收率80％；黄色油状物；

目标化合物10d：收率64％；黄色油状物；

目标化合物10e：收率37％；黄色油状物；

目标化合物10f：收率51％；黄色油状物；

目标化合物10g：收率29％；淡黄色油状物；

目标化合物10h：收率42％；淡黄色油状物；

目标化合物10i：收率61％；淡黄色油状物；

目标化合物10j：收率82％；淡黄色油状物；

目标化合物10k：收率61％；淡黄色油状物；

目标化合物10l：收率65％；淡黄色油状物；

实施例7：目标化合物9h、目标化合物10d的制备

将化合物7h(2.32mmol,1.0equiv.)溶于氯苯(30mL)中，加入化合物4(4.64mmol，2.0equiv.)，然后再加入氢氧化钾(11.60mmol，5.0equiv.)，100℃回流搅拌8h(TLC监测)。反应结束后，真空旋干氯苯，再加入适量水，用DCM萃取水相(30mL×3)，合并有机相，先用饱和食盐水洗涤1次，再用无水硫酸钠干燥，过滤后减压蒸除溶剂，所得残留物用柱层析法(DCM/MeOH:20/1～10/1，v/v)纯化，得到黄色油状物，收率为66％。经核磁氢谱、碳谱及高分辨质谱表征，确定为目标化合物9h。

将化合物8d(2.32mmol,1.0equiv.)溶于乙醇(30mL)中，加入化合物4(4.64mmol，2.0equiv.)，然后再加入叔丁醇钠(11.60mmol，5.0equiv.)，70℃回流搅拌10h(TLC监测)。反应结束后，真空旋干乙醇，再加入适量水，用DCM萃取水相(30mL×3)，合并有机相，先用饱和食盐水洗涤1次，再用无水硫酸钠干燥，过滤后减压蒸除溶剂，所得残留物用柱层析法(PE/EA:1/1～1/3，v/v)纯化无过量溶剂的粗品，得到黄色油状物，收率为43％。经核磁氢谱、碳谱及高分辨质谱表征，确定为目标化合物10d。

实验例1：目标化合物9a～9o和10a～10l的AChE/BuChE抑制活性研究

采用Ellman分光光度法，评价目标化合物对AChE或BuChE的抑制活性。

AChE(E.C.3.1.1.7,来自电鳗和人)，BuChE(E.C.3.1.1.8,来自马血清和人)，5,5′-dithiobis-(2-nitrobenzoic acid)(Ellman试剂,DTNB)，硫代丁酰胆碱(S-butylthiocholine iodide,BTCI),碘化乙酰胆碱(acetylthiocholine iodide,ATCI)和多奈哌齐购买于Sigma-Aldrich公司。具体步骤如下：首先，将待测化合物溶解于DMSO中，用Tis-HCl缓冲液(PH＝8.0)稀释至所需要的浓度(DMSO浓度小于1％)。在96孔板中依次加入160μL DTNB(1.5mM),50μL AChE(0.22U/mL)和10μL待测药物，37℃孵育6分钟。然后加入30μL ATCI(15mM)作为底物，在酶标仪(SpectraMax Plus 384，Molecular devices，CA，USA)中在405nm处检测的吸光值变化(0,60,120和180秒)。抑制率＝[1-(实验组吸光度变化/空白组吸光度变化)]*100％。丁酰胆碱酯酶活性的测定只需用BuChE代替AChE，并改变底物为硫代丁酰胆碱(BTCI),其它操作相同。通过Graph Pad Prism 7.00版软件(GraphPadSoftware,San Diego,CA)计算化合物50％抑制作用时的摩尔浓度，即为该化合物的IC

表1.化合物9a～9o和10a～10l对电鳗胆碱酯酶和人源单胺氧化酶的抑制活性

表2.部分化合物的人源胆碱酯酶活性

从表1可看出，绝大多数化合物都是AChE和BuChE的有效抑制剂。化合物9a～g,9h～m,10a～f和10g～l对AChE的抑制活性一般随碳链长的延长而逐渐降低。相反，一般而言，短键化合物的BuChE抑制活性相对较差。在化合物9h～m中，具有3个碳间隔的化合物9h对AChE的抑制活性最强(IC

为了更加准确的目标化合物的胆碱酯酶活性，我们选择在人源性胆碱酯酶上进一步测定部分化合物9a～g,10b～d and 10h～j的活性。从表2可知，与电鳗胆碱酯酶相比，大部分化合物对人源胆碱酯酶中表现出更强的抑制活性。综合考虑在人源胆碱酯酶和电鳗胆碱酯酶上的测定结果，大多数杂交物表现出良好的AChE/BuChE抑制活性的平衡，特别是10d对双酯酶的抑制活性最平衡(IC

实验例2：目标化合物9a～9o和10a～10l的hMAO-A/hMAO-B抑制活性研究

以雷沙吉兰、异丙烟肼作为对照药物，通过Amplex Red荧光法测定目标化合物对MAOs活性的抑制作用。单胺氧化酶(EC1.4.3.4),Amplex Red试剂，辣根过氧化酶(HRP)以及雷沙吉兰和异丙烟肼均购买于Sigma-Aldrich公司。具体实验步骤如下。将溶解在DMSO中的受试化合物稀释于PBS缓冲液(0.05M,pH 7.4)中配制成不同的终浓度(DMSO浓度小于1％)。不同浓度的受试化合物(20μL)与包含有hMAO-A或hMAO-B的PBS缓冲液(80μL)于黑暗中37℃下孵育15分钟。然后在反应液中加入200μM10-acetyl-3,7dihydroxyphenoxazine试剂(Amplex Red assay kit)、1U/mL辣根过氧化酶和1mM酪胺引发反应。反应结束后，利用酶标仪(SpectraMax Plus384，Molecular devices，CA，USA)记录各组溶液在20分钟内的荧光变化。检测条件为激发波长545nm，发射波长590nm。抑制率＝[1-(实验组荧光值变化/空白组荧光值变化)]×100％。实验结果表达为三个独立实验的平均值±SD。结果见表1。

如表1所示，大多数所合成的化合物对MAO-A和MAO-B具有有效的抑制作用。除了他克林7位氟取代的化合物(6n:hMAO-B IC