一种水包油型纳米乳疫苗佐剂及其制备方法

技术领域

本发明属于疫苗佐剂技术领域，具体涉及一种水包油型纳米乳疫苗佐剂及其制备方法。

背景技术

佐剂一词起源于拉丁文，是辅助或增强的意思，疫苗佐剂是添加到抗原中的分子，化合物或大分子复合物，与疫苗共同作用，增强或调节免疫原性，而本身无抗原性。佐剂与疫苗共同使用时，可以减少疫苗抗原的使用量，还可以提高机体的保护力，尤其是对免疫力低下的老年以及儿童等意义重大，也越来越成为疫苗不可缺少的一部分。

目前，商品化应用最为广泛的人用佐剂为铝盐佐剂，其通过抗原储库效应和诱发炎症等免疫刺激效应发挥增强免疫应答的作用，存在抗原缓释时间较长、注射部位偶尔有严重红斑、结节、肉芽肿性炎症等问题，因此，油乳佐剂应运而生。

油乳佐剂类型包括水包油型和油包水型，包水型佐剂优点是它适用于亲水性或两性抗原，但是油是连续相，所以粘度较大，注射机体以后副反应较大，一般会能引起注射部位肿胀，形成肉芽肿，而且粘度高，在注射时阻力较大，而水包油型则没有上述缺陷，因为水粘度小，能被机体迅速吸收，所以包裹在油相中的抗原能快速运输到淋巴组织，引起机体快速而且强烈的免疫反应，但是存在热稳定性差的问题，热应激会降低疫苗的效价，或甚至会使其失去活性，无法激活免疫反应。

发明内容

本发明的目的在于提供一种水包油型纳米乳疫苗佐剂及其制备方法，以解决现有水包油型疫苗佐剂热稳定性差的问题。

本发明的目的可以通过以下技术方案实现：

一种水包油型纳米乳疫苗佐剂，包括以下质量百分比的原料：

1-8％油相、1-8％乳化剂、1-3％多糖修饰纳米颗粒、0.1-1％络合剂、0.1-0.5％抗氧化剂，余量为去离子水；

该水包油型纳米乳疫苗佐剂的制备方法，包括以下步骤：

第一步、按照配方比例将多糖修饰纳米颗粒和络合剂分散于去离子水中，获得混合液a；

第二步、将配方比例的油相和乳化剂混合，获得混合液b；

第三步、将混合液b缓慢加入混合液a中并持续搅拌，用浓度0.1mol/L氢氧化钠溶液调节pH至7.5-9.0，采用8000-10000rpm剪切速率处理3-7min，压力600-1000bar循环处理3-5个循环，过0.22μm微孔膜，即得水包油型纳米乳疫苗佐剂。

进一步地，多糖修饰纳米颗粒通过以下步骤制成：

S1、将介孔羟基磷灰石置于乙醇溶液中，加入硅烷偶联剂KH-550，50-60℃下搅拌反应6-8h，冷却至室温，过滤，滤饼干燥，得到氨基化无机颗粒；

S2、将氨基化无机颗粒加入无水乙醇中，用甲酸调节pH为5.5，加入醛基化云芝多糖水溶液，60℃下搅拌反应2h，反应结构后，抽滤，滤饼干燥，得到多糖修饰纳米颗粒。

羟基磷灰石作为人体的天然成分，具有良好的生物相容性，且具有耐高温的特点，本发明以介孔羟基磷灰石为原料，通过偶联剂KH-550修饰处理，在介孔羟基磷灰石表面引入丰富的活性氨基，之后利用氨基与醛基之间的缩合反应，在介孔羟基磷灰石表面引入云芝多糖，得到多糖修饰纳米颗粒，而云芝多糖是一种抗肿瘤制剂，并且水溶性好，作为稳定剂，赋予多糖修饰纳米颗粒免疫调节性以及靶向作用，结合介孔羟基磷灰石的吸附和耐热性，能够有效存储抗原，提高疫苗整体的热稳定性。

进一步地，步骤S1中介孔羟基磷灰石、乙醇溶液和硅烷偶联剂KH-550的用量比为10g：100mL：0.5-1g，乙醇溶液质量分数为40-80％，介孔羟基磷灰石通过软模板法得。

进一步地，步骤S2中氨基化无机颗粒和醛基化云芝多糖的质量比为10：0.5-2。

进一步地，醛基化云芝多糖通过以下步骤制成：

将云芝多糖溶于4℃去离子水中，加入高碘酸钠，避光条件下冰水浴中，1000rpm搅拌反应2h，加入乙二醇终止反应，继续搅拌1h，所得产物于去离子水为介质避光下冰水浴中透析72h(截留分子量3.5KDa)，冷冻干燥，得到醛基化云芝多糖，云芝多糖和高碘酸钠的质量比为1：0.05-1。

进一步地，油相为美孚白矿油Marcol52、美孚白矿油Marcol82和白矿油Drakeol5中的一种。

进一步地，乳化剂为由亲水性表面活性剂和亲油性表面活性剂按照质量比1-2：2-1组成，亲水表面活性剂为吐温80、吐温85、聚氧乙烯氢化蓖麻油或泊洛沙姆407中一种或几种，亲油性表面活性剂为司盘20、司盘40、司盘60、司盘80和司盘85中一种或几种。

进一步地，络合剂为乙二胺四乙酸。

进一步地，抗氧化剂为二丁基羟基甲苯、维生素E和茶多酚中一种。

本发明的有益效果：

本发明提供一种水包油型纳米乳疫苗佐剂及其制备方法，由油相、乳化剂、多糖修饰纳米颗粒、络合剂、抗氧化剂和去离子水组成，具有剂性稳定的特点，且多糖修饰纳米颗粒具有免疫调节性以及靶向作用，结合介孔羟基磷灰石的吸附和耐热性，能够有效存储抗原，提高疫苗整体的热稳定性。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1

介孔羟基磷灰石通过以下步骤制成：

将3g十六烷基三甲基溴化铵、4.5g磷酸氢二胺和6.4g无水氯化钙分别依次加入100mL去离子水、300mL去离子水、300mL去离子水中依次得到溶液a、溶液b、溶液c，并均用氨水调节pH至10.5，之后将溶液a加入溶液b中，转速300r/mi n搅拌30mi n后，滴加溶液c，滴加结束后，搅拌30mi n后转移至反应釜中，120℃下恒温反应24h，冷却后，离心，沉淀用去离子水洗涤至洗涤液呈中性，80℃下干燥后，置于550℃下煅烧3h，之后冷却至室温，得到介孔羟基磷灰石。

实施例2

一种多糖修饰纳米颗粒，通过以下步骤制成：

S1、将10g实施例1的介孔羟基磷灰石置于100mL的40wt％乙醇溶液中，加入0.5g硅烷偶联剂KH-550，50℃下搅拌反应6h，冷却至室温，过滤，滤饼干燥，得到氨基化无机颗粒；

S2、将10g氨基化无机颗粒加入100mL无水乙醇中，用甲酸调节pH为5.5，加入由0.5g醛基化云芝多糖和10mL去离子水组成的溶液，60℃下搅拌反应2h，反应结构后，抽滤，滤饼干燥，得到多糖修饰纳米颗粒。

醛基化云芝多糖通过以下步骤制成：

将10g云芝多糖溶于4℃的100mL去离子水中，加入0.5g高碘酸钠，避光条件下冰水浴中，1000rpm搅拌反应2h，加入20mL乙二醇终止反应，继续搅拌1h，所得产物于去离子水为介质避光下冰水浴中透析72h(截留分子量3.5KDa)，冷冻干燥，得到醛基化云芝多糖。

实施例3

一种多糖修饰纳米颗粒，通过以下步骤制成：

S1、将10g实施例1的介孔羟基磷灰石置于100mL的60wt％乙醇溶液中，加入1g硅烷偶联剂KH-550，60℃下搅拌反应8h，冷却至室温，过滤，滤饼干燥，得到氨基化无机颗粒；

S2、将10g氨基化无机颗粒加入100mL无水乙醇中，用甲酸调节pH为5.5，加入由2g醛基化云芝多糖和10mL去离子水组成的溶液，60℃下搅拌反应2h，反应结构后，抽滤，滤饼干燥，得到多糖修饰纳米颗粒。

醛基化云芝多糖通过以下步骤制成：

将10g云芝多糖溶于4℃的100mL去离子水中，加入0.5g高碘酸钠，避光条件下冰水浴中，1000rpm搅拌反应2h，加入20mL乙二醇终止反应，继续搅拌1h，所得产物于去离子水为介质避光下冰水浴中透析72h(截留分子量3.5KDa)，冷冻干燥，得到醛基化云芝多糖。

实施例4

一种水包油型纳米乳疫苗佐剂，包括以下质量百分比的原料：

1％油相、1％乳化剂、1％实施例2的多糖修饰纳米颗粒、0.1％乙二胺四乙酸、0.1％抗氧化剂，余量为去离子水；

该水包油型纳米乳疫苗佐剂的制备方法，包括以下步骤：

第一步、按照配方比例将多糖修饰纳米颗粒和络合剂分散于去离子水中，获得混合液a；

第二步、将配方比例的油相和乳化剂混合，获得混合液b；

第三步、将混合液b缓慢加入混合液a中并持续搅拌，用浓度0.1mo l/L氢氧化钠溶液调节pH至7.5，采用8000rpm剪切速率处理7min，压力600bar循环处理3个循环，过0.22μm微孔膜，即得水包油型纳米乳疫苗佐剂。

其中，油相为美孚白矿油Marcol52，乳化剂为由吐温80和司盘80按照质量比1：1组成，抗氧化剂为二丁基羟基甲苯。

实施例5

一种水包油型纳米乳疫苗佐剂，包括以下质量百分比的原料：

5％油相、5％乳化剂、2％实施例2的多糖修饰纳米颗粒、0.5％乙二胺四乙酸、0.3％抗氧化剂，余量为去离子水；

该水包油型纳米乳疫苗佐剂的制备方法，包括以下步骤：

第一步、按照配方比例将多糖修饰纳米颗粒和络合剂分散于去离子水中，获得混合液a；

第二步、将配方比例的油相和乳化剂混合，获得混合液b；

第三步、将混合液b缓慢加入混合液a中并持续搅拌，用浓度0.1mol/L氢氧化钠溶液调节pH至8.5，采用9000rpm剪切速率处理5min，压力800bar循环处理4个循环，过0.22μm微孔膜，即得水包油型纳米乳疫苗佐剂。

其中，油相为美孚白矿油Marcol82，乳化剂为由吐温85和司盘85按照质量比1：2组成，抗氧化剂为维生素E。

实施例6

一种水包油型纳米乳疫苗佐剂，包括以下质量百分比的原料：

8％油相、8％乳化剂、3％实施例3的多糖修饰纳米颗粒、1％乙二胺四乙酸、0.5％抗氧化剂，余量为去离子水；

该水包油型纳米乳疫苗佐剂的制备方法，包括以下步骤：

第一步、按照配方比例将多糖修饰纳米颗粒和络合剂分散于去离子水中，获得混合液a；

第二步、将配方比例的油相和乳化剂混合，获得混合液b；

第三步、将混合液b缓慢加入混合液a中并持续搅拌，用浓度0.1mol/L氢氧化钠溶液调节pH至9.0，采用10000rpm剪切速率处理7min，压力1000bar循环处理3个循环，过0.22μm微孔膜，即得水包油型纳米乳疫苗佐剂。

其中，油相为白矿油Drakeol5，乳化剂为由吐温80和司盘60按照质量比2：1组成，抗氧化剂为茶多酚。

对比例1

将实施例4中多糖修饰纳米颗粒替换成实施例1中物质，其余原料及制备过程同实施例4。

对比例2

将实施例4中多糖修饰纳米颗粒去除，其余原料及制备过程同实施例4。

对实施例4-实施例6和对比例1-对比例2所得疫苗佐剂进行性能测试，测试内容如下：

(一)安全性：将体重为18-22g的SPF级的Balb/c小鼠雌雄各10只分为两组，选择实施例和对比例制备的纳米疫苗佐剂，分别在皮下注射纳米疫苗佐剂0.2ml/只，连续观察两周，是否出现由佐剂引起的死亡或者明显的局部和全身不良反应，检查注射部位有无异常；

(二)稳定性：稳定性常数的计算公式如下：Ke＝(A0-A)/A0×100％(0＜Ke＜1)。式中A0为乳剂的稀释液在设定波长处测得的吸光度；A为经离心后离心管底部乳剂的稀释液在同一波长处测得的吸光度。稳定性常数Ke越小，说明乳剂在离心前后变化越小，乳剂越稳定；

取各组疫苗佐剂5mL置于10mL离心试管中，4000r·min

(三)热稳定性：将各组疫苗佐剂加入到EV71疫苗液中(1×10

结果如表1所示：

表1

由表1可以看出，相比于对比例1和对比例2而言，实施例4-实施例6所制备的疫苗佐剂性能更加稳定，且耐温性好。

需要说明的是，在本文中，诸如第一和第二等之类的关系术语仅仅用来将一个实体或者操作与另一个实体或操作区分开来，而不一定要求或者暗示这些实体或操作之间存在任何这种实际的关系或者顺序。而且，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。

尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。