一种全集成病原体核酸检测微流控芯片

技术领域

本发明涉及生物分析检测领域，具体的说，涉及一种全集成病原体核酸检测微流控芯片。

背景技术

作为体外诊断领域的主要检测方式之一，核酸检测是实现病原体早期、快速、特异检测的最直接、最可靠、最灵敏的方法，其能快速对检测样本中病原体核酸进行检测， 为感染病例确诊提供科学检验依据。

传统的核酸检测方法如Southern blot印迹杂交、琼脂糖凝胶电泳等，具有费时费力，灵敏度低，难以实现高通量检测，甚至还需使用放射性试剂等缺点。核酸扩增的 方法如聚合酶链式反应PCR、环介导等温扩增LAMP，重组酶聚合酶扩增RPA等，可极 大地提高检测灵敏度，同时还因操作相对简单使其成为现代分子生物学实验常用方法。 通过核酸扩增进行病原体检测一般包含样本前处理、核酸提取、扩增、检测四个步骤。 传统的在实验室进行病原体检测的方法需要有专业人员在具有专业条件的实验室中完 成，需要人工操作来完成试剂的转移和添加，依旧需要完成大量繁琐操作，在操作的 过程中还可能会将反应试剂暴露在空气中，极易造成污染，而且还需借助于温度控制 仪来提高精确地温度控制，因而限制了传统的实验室核酸检测实现对病原体的快速、 灵敏检测。

微流控芯片技术(Microfluidics)是把生物、化学、医学分析过程的样品制备、反应、 分离、检测等基本操作单元集成到一个微尺度的芯片上，自动完成分析全过程。由于它在生物、化学、医学等领域的巨大潜力，已经发展成为进行核酸检测的一个重要的 载体工具之一。微流控芯片在核酸提取扩增检测上已有诸多引用，但是大多数都依旧 停留在实验室阶段。究其因是其需要各种微阀、微泵和辅助设备，增加了芯片应用的 复杂度，使得制造难度、成本大大升高，限制了其进一步在临床上的应用，而且难以 实现全集成式的病原体核酸检测，因此急需一种全集成、高灵敏度的微流控芯片，在 改进核酸检测过程的同时，降低检测时间和芯片制造难度与成本。

发明内容

为了解决现有核酸检测技术中存在的不足，提供一种可以快速、高灵敏的集核酸捕获及原位扩增于一体的全集成病原体核酸检测微流控芯片。

本发明提供一种全集成病原体核酸检测微流控芯片，包括流体管道层、弹性胶 带层和试剂存储层，所述试剂存储层设有用于分别存储采集液、清洗液、反应试剂 和废液的腔室，所述流体管道层内设有带有捕获滤纸的原位提取扩增腔室，所述弹 性胶带层夹设在流体管道层和试剂存储层之间，所述试剂存储层中的储采集液、清 洗液和反应试剂在外力作用下穿过弹性胶带层流至流体管道层，并通过流体管道层 的流道流至原位提取扩增腔室进行反应。

进一步，所述试剂存储层上依次设置的采集液腔室、清洗液腔室、混匀腔室和 废液池，所述试剂存储层上可拆卸的连接有反应试剂存储套管，所述采集液、清洗 液、反应试剂分别密封存储在采集液腔室、清洗液腔室、反应试剂存储套管中。

进一步，所述反应试剂存储套管包括由下至上一次连接的下端旋冒、储液腔室 和上端旋冒，所述上端旋冒上连接有推杆，所述胶塞球位于储液腔室的底壁与推杆 之间，所述试剂存储层上设有与储液腔室下端相匹配的接口。

进一步，所述流体管道层上与混匀腔室对应位置设有原位提取扩增腔室中设有捕获滤纸固定位，用于捕获核酸的捕获滤纸连接在捕获滤纸固定位处；所述混匀腔 室对应位置设有原位提取扩增腔室之间的弹性胶带层设有去粘性层。

进一步，所述流体管道层上与采集液腔室对应的位置设有采集液池，所述采集 液池与采集液腔室之间的弹性胶带层设有由上向下连通的单向阀；所述流体管道层 上与清洗液腔室对应的位置设有清洗液池，所述清洗液池与清洗液腔室之间的弹性 胶带层设有由上向下连通的单向阀；所述流体管道层上反应试剂存储套管相对应的 位置，设有反应液池，所述反应液池与反应试剂存储套管之间的弹性胶带层设有由 上向下连通的单向阀。

进一步，所述由上向下连通的单向阀为带有通孔的去粘性层，所述通孔流体管 道层上额的流道或者各个反应池相连通，所述通孔与试剂存储层室的腔室的出液口 交错设置，当液体流向去粘性层时，去粘性层向下发生形变，是得其通过通孔形成 通路；而当液体由下向上流动时，由于通孔与出液口交错设置，去粘性层向上挤压 使得通孔封闭，此时单向阀关闭。

进一步，所述反应池靠近原位提取扩增腔室的一侧设有镁离子复溶腔室，所述 镁离子复溶腔室一侧与反应池相连通，另一端可以通过挤压对应设置的去粘性层与 原位提取扩增腔室相连通；所述流体管道层上设有第一流道，所述第一流道的一端 分别与清洗液池和采集液池相连接，另一端可以通过挤压对应设置的去粘性层与原 位提取扩增腔室相连通；所述原位提取扩增腔室靠近废液池的一侧设有与废液池联 通的第二流道，所述第二流道和废液池之间设有由下向上连通的单向阀。所述由下 向上连通的单向阀为带有通孔的去粘性层，所述通孔与废液池相连通，所述第二流 道的出液口与通孔相对于去粘性层交错设置，当第二流道的液体流向废液池时，去 粘性层向上发生形变是得第二流道与通孔相连通，液体流向废液池；而当液体由上 向下流动时，由于通孔与第二流道的出液口交错设置，去粘性层向下挤压使得通孔 封闭，此时单向阀关闭。

进一步，所述废液池上设有废液池排气孔，所述试剂存储层的外壁连接有气膜，所述气模与试剂存储层的外壁形成一密闭的容纳空间，所述容纳空间与废液池排气 孔相连通。

进一步，所述试剂存储层设有把手。

本发明还提供一种全集成病原体核酸检测系统，包括上述的全集成病原体核酸检测微流控芯片。

本发明的全集成病原体核酸检测微流控芯片可将病原体样本处理、核酸提取、原位扩增集成于同一微流控芯片装置中，因而摆脱了实际进行病原体核酸检测时的繁琐 操作以及对专业实验室的依赖。使用本发明提供的一种全集成病原体核酸检测微流控 芯片，可真正实现全集成式、快速、高灵敏的病原体核酸检测。

附图说明

图1为本发明的全集成病原体核酸检测微流控芯片的结构示意图；

图2为本发明的全集成病原体核酸检测微流控芯片的正视图；

图3为本发明的全集成病原体核酸检测微流控芯片的后视图；

图4为本发明的全集成病原体核酸检测微流控芯片的试剂存储套管的结构示意图；

图5为具体实施例1中的检测结果图。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域 普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用 的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

本发明提供一种全集成病原体核酸检测微流控芯片，如图1所示包括流体管道 层1、弹性胶带层2和试剂存储层3，所述流体管道层包括流体管道，可对试剂进行 微量操作；复溶腔室，可供冻干试剂进行复溶；核酸捕获滤纸固定位，可固定滤纸以 进行核酸捕获；反应腔室，可供核酸扩增腔室以对滤纸捕获后的核酸进行原位扩增。 所述弹性胶带层，选用双面胶基材，对流体管道层和试剂存储层进行粘接，以封装芯 片。通过局部去粘性处理还可配合其弹性特点起弹性阀作用，以配合流体管道层以对 试剂进行定向微量操作。所述试剂存储层包括，试剂存储腔室和废液池，以进行试剂 存储和试剂处理后的废液；反应密封阀，密封反应腔室；混匀腔室，可对进行中的反 应进行试剂混合，增强反应效果。

如图2所述，所述试剂存储层包括依次设置的采集液腔室32、清洗液腔室33、 反应试剂存储套管34、混匀腔室37和废液池36；所述反应试剂存储套管34可以为设 置在试剂存储层3上的通孔也可以为与试剂存储层的底部可拆卸的连接独立装置；

所述流体管道层1上与混匀腔室37对应位置设有原位提取扩增腔室17中设有捕获滤纸固定位18，用于捕获核酸的核酸捕获滤纸19连接在捕获滤纸固定位18处；所 述混匀腔室37对应位置设有原位提取扩增腔室17之间的弹性胶带层2设有去粘性层； 所述流体管道层1上与采集液腔室32对应的位置设有采集液池12，所述采集液池12 与采集液腔室32之间的弹性胶带层2设有去粘性层，所述去粘性层上设有由上向下连 通的单向阀；所述流体管道层1上与清洗液腔室33对应的位置设有清洗液池13，所 述清洗液池13与清洗液腔室33之间的弹性胶带层2设有去粘性层，所述去粘性层上 设有由上向下连通的单向阀；所述流体管道层1上反应试剂存储套管34相对应的位置， 设有反应液池14，所述反应液池14与反应试剂存储套管34之间的弹性胶带层2设有 去粘性层，所述去粘性层上设有由上向下连通的单向阀；所述反应池14靠近原位提取 扩增腔室4的一侧设有镁离子复溶腔室15，所述镁离子复溶腔室15一侧与反应池14 相连通，另一端可以通过挤压对应设置的去粘性层与原位提取扩增腔室17相连通。第 一流道11，所述第一流道11的一端分别与清洗液池和采集液池相连接，另一端可以 通过挤压对应设置的去粘性层与原位提取扩增腔室17相连通。所述原位提取扩增腔室 17靠近废液池的一侧设有与废液池联通的第二流道16，所述第二流道16和废液池36 之间设有去粘性层，所述去粘性层上设有由下向上连通的单向阀。

进一步，所述由上向下连通的单向阀为带有通孔的去粘性层，所述通孔流体管 道层上额的流道或者各个反应池相连通，所述通孔与试剂存储层室的腔室的出液口 交错设置，当液体流向去粘性层时，去粘性层向下发生形变，是得其通过通孔形成 通路；而当液体由下向上流动时，由于通孔与出液口交错设置，去粘性层向上挤压 使得通孔封闭，此时单向阀关闭。

所述由下向上连通的单向阀为带有通孔的去粘性层，所述通孔与废液池相连 通，所述第二流道的出液口与通孔相对于去粘性层交错设置，当第二流道的液体流 向废液池时，去粘性层向上发生形变是得第二流道与通孔相连通，液体流向废液池； 而当液体由上向下流动时，由于通孔与第二流道的出液口交错设置，去粘性层向下 挤压使得通孔封闭，此时单向阀关闭。

所述试剂存储层还包括密封阀室35，当反应试剂注入原位提取扩增腔室开始进行反应时，密封阀室35的内部腔室最低端会塞上一个直径略大于密封阀内部圆孔直径 的胶塞，胶塞靠挤压作用挤压原位提取扩增腔室两端的双面胶带，以此封住反应腔室 两端进行密封。

所述反应试剂存储套管34包括由下至上一次连接的下端旋冒341、储液腔室342、和上端旋冒343，所述上端旋冒343上连接有推杆344，所述储液腔室342内设有胶 塞球345，所述胶塞球位于推杆344与储液腔室342底壁之间所述试剂存储层3上设 有与储液腔室342下端相匹配的接口，使用时，可以去除下端旋冒341后将储液腔室 342的下端直接与接口相连接。所述储液腔室342的下端直接与接口之间密封连接。

所述废液池36上设有废液池排气孔361，所述试剂存储层的外壁连接有气膜38，所述气模38与试剂存储层的外壁形成一密闭的容纳空间，所述容纳空间与废液池排 气孔361相连通。

所述试剂存储层设有把手31。

具体实施例1

以通过重组酶聚合酶扩增反应RPA检测空气生物气溶胶中新冠病毒为例，该芯片具体实施方式如下：

存储试剂：试剂存储层与流体管道层通过弹性胶带层封装后即可进行试剂预存，以备后续实验；此时采集液腔室存储试剂可为2mL的病毒裂解液、清洗液腔室试剂可 为1mLDEPC水(DNase、RNase free)(货号：R0022，生产商：碧云天)，反应试剂套 管内的存储试剂可为DNA恒温快速扩增试剂盒(荧光型)(货号：WLE8202KIT，生 产商：安普未来)，镁离子复溶腔室的表面有晶体状2.5μL280nM醋酸镁冻干后试剂成 分。

样品采集：通过生物气溶胶采样器(规格：便携式生物气溶胶采样器WA-400， 生产商：北京鼎蓝科技有限公司)对公共空间环境中的病原体进行采集30分钟，此时 检测芯片裂解液腔室通过管阀直接与该生物气溶胶采样器出样口相接通，即可将空气 中的新冠病毒颗粒直接采集至采集液腔室，此实验中选用新型冠状病毒(2019-nCoV) 假病毒核糖核酸标准物质代替(货号：NIM-RM5203，生产商：中国计量科学研究院)；

病原体裂解：将检测芯片装载至全集成病原体核酸分析仪上，一次可装载8位检测芯片，让病原体在采集液腔室进行裂解，释放核酸；

核酸捕获：开始进样，对采集液腔室施压，试剂流过采集液腔室下端的单向阀流向采集液池并通过第一流道流向原位提取扩增腔室17中的核酸捕获滤纸，流过核酸捕 获滤纸时，核酸捕获滤纸对试剂中的核酸进行捕获、富集；

滤纸清洗：对清洗液腔室施压，使清洗液腔室中的清洗液试剂流过清洗液腔室下端单向阀，经过第一流到层流向核酸捕获滤纸，进行滤纸上的核酸清洗；

核酸原位扩增：对反应试剂存储套管加压，使反应试剂存储套管的反应体系试剂经过反应池和镁离子复溶腔室，将镁离子复溶腔室中的固态状醋酸镁进行复溶，随后 流至原位提取扩增腔室，接着，密封原位提取扩增腔室两端的密封阀，加热膜开始加 热，反应开始。反应时，混匀腔室在仪器推杆的作用下进行双向混匀，增强反应效果；

扩增结果检测：配合全集成核酸检测仪实时进行最高四色荧光扫描检测，并输出荧光扩增曲线，给出检测结果。

以20copies/mL的假病毒样品为例，按照上述方法进行检测，检测结果如附图5 所示，图5中，左侧为20copies/mL的假病毒样品，右侧为空白对照。从图5中的结 果可以看出，本发明的芯片可配合全集成核酸检测仪将待测样本的“样本前处理、核 酸提取、扩增、检测”于一体，操作简便，可避免传统实验室所需各种繁琐操作；芯 片全封闭式设计，试剂预混装，无需手工配液，安全可靠，与环境无交叉污染；芯片 配合壳聚糖修饰的特异性滤纸进行核酸捕获富集，可进行原位扩增，检测灵敏度可达 20copies/mL，尤其适用于空气气溶胶中、物品表面上的低copy病原体待检样本，这 对新冠疫情而言，可大大助力疫情防控；搭配全集成核酸分析仪，可一次性集成多个 芯片进行高通量检测；试剂存储腔室存储试剂种类、试剂存储腔室的腔室数量弹性可 调节，可适应多种不同条件下，对多种不同病原体进行特异性检测。

以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨 和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较 宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发 明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本 发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的 改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。