用于检测细菌的试剂盒及基于CRISPRCas-SDA-AuNPs的细菌检测方法

技术领域

本发明属于细菌检测技术领域，具体涉及一种用于检测细菌的试剂盒及基于CRISPR/Cas-SDA-AuNPs的细菌检测方法。

背景技术

细菌是引起许多疾病的重要病原体。快速、准确的细菌检测可以实现突发传染病病原体的早期诊断；可指导临床合理用药，减少因病原不明或经验性用药导致的日益严峻的耐药性问题。然而，当前传统的细菌检测技术如细菌培养方法非常耗时，聚合酶链式反应（PCR）或酶联免疫吸附试验（ELISA）依赖于昂贵的仪器设备和熟练的操作人员，无法满足医疗条件落后国家和地区的检测需求，也限制了它们在即时检测中的广泛应用。

基于纳米材料的即时检测方法在快速、灵敏和特异性的细菌检测方面引起了人们的兴趣。金纳米颗粒（AuNPs）是合成历史最悠久且应用领域最为广泛的纳米材料之一，具有与尺寸相关的光学特性，可以表现出一系列的颜色性质，分散的AuNPs在可见光范围内表现出典型的等离子体吸收。当发生聚集时，其吸收峰值红移，颜色由红色变为蓝色。由于这一特性，基于AuNPs的细菌比色检测法已被广泛应用于食品安全、疾病诊断等检测领域。该方法可以通过肉眼直观判断颜色变化，实现对目标物的定性或半定量检测。但为了实现其定量测量，往往需要借助于分光光度计等大型仪器，不适用于现场快速检测。

此外，现有的高灵敏核酸检测技术通常使用核酸扩增技术来进行信号放大，以进一步提高检测的灵敏度。链置换等温扩增反应（strand displacement amplification，简称为SDA）是一种基于限制性核酸内切酶和DNA聚合酶催化的连续切割和聚合/置换过程的酶促DNA体外等温扩增方法，具有效率高、特异性高、设备要求低等优点，尽管在核酸分析方面表现出明显的优势，但SDA无法直接用于细菌基因组的检测，往往需要与适体特异性结合。受制于高特异性适体的筛选，目前基于适体的SDA细菌检测方法往往存在特异性不高的问题。

发明内容

本发明的目的是为了克服现有技术存在的缺点和不足，而提供一种用于检测细菌的试剂盒及基于CRISPR/Cas-SDA-AuNPs的细菌检测方法。

本发明的第一方面，提供一种用于检测细菌的试剂盒，包括SDA体系、CRISPR/Cas体系和DNA-AuNPs；

所述SDA体系包括Template、Primer、Bst3.0 DNA聚合酶、Nt.BbvCI切刻内切酶、dNTPs；

所述CRISPR/Cas体系包括Cas12a和crRNA，所述Cas12a和crRNA可识别细菌基因组并在识别出含有目标细菌基因组后可非特异性切割Template；

所述DNA-AuNPs上的DNA与SDA体系中Template和Primer在Bst3.0 DNA聚合酶和Nt.BbvCI内切酶作用下经过链置换等温扩增后产生的ssDNA链两端互补。

优选的，所述DNA-AuNPs为SH-DNA1和SH-DNA2与AuNPs混合孵育得到；

SH-DNA1序列为5’- TTG TCG TTG CGT GCT GA-SH-3’；

SH-DNA2序列为5’- SH-CCC AGG TTC TCT -3’；

Template序列为5’- CCC AGG TTC TCT TTG TCG TTG CGT GCT GAG GTT AGC AAAGTA GCG TG-3’；

Primer序列为5’- CAC GCT ACT TTG CTA A-3’；

crRNA序列为5’- UAA UUU CUA CUA AGU GUA GAU GGG CCU AGA UAA AGA AGAAC-3’。

优选的，所述DNA-AuNPs为SH-DNA1和SH-DNA2与AuNPs混合后于36-38℃振荡孵育10-50分钟，然后加入柠檬酸/盐酸缓冲液，震荡孵育振荡孵育8-12小时。

优选的，柠檬酸/盐酸缓冲液孵育时间为10小时。

优选的，所述DNA和AuNPs的最佳比例为200：1。

本发明的第二方面，提供一种基于CRISPR/Cas-SDA-AuNPs的细菌检测方法，所述方法为非疾病诊断或治疗应用，其采用如权利要求1-5任一项所述的用于检测细菌的试剂盒；

所述方法包括以下步骤：

（1）采用CRISPR/Cas体系与待测试样进行酶切反应，得到酶切反应液；

（2）采用SDA体系对步骤（1）得到的酶切反应液进行扩增得到SDA扩增产物；

（3）将SDA扩增产物与DNA-AuNPs混合进行反应。

优选的，步骤（1）中酶切反应得到的酶切反应液先通过升温孵育进行Cas酶活性灭活，灭活后进行杂交反应使灭活过程中打开的杂交双链重新恢复为杂交双链，然后在步骤（2）中采用SDA体系进行扩增。

优选的，步骤（2）中所得到的SDA扩增产物通过升温孵育进行酶失活。

优选的，步骤（3）反应后，通过光热检测，当存在创伤弧菌时，经过660 nm激光照射后，温度上升。

优选的，步骤（3）反应后，通过UV-vis检测，所述细菌为创伤弧菌，所述细菌浓度与步骤（3）得到的反应液于530 nm处吸光度值呈正比。

本发明的有益效果如下：本发明引入CRISPR-Cas系统（Clustered RegularlyInterspaced Short Palindromic Repeat and CRISPR-Associated Protein），通过CRISPR/Cas12a特异性识别细菌和SDA进行检测信号放大，提出了基于CRISPR/Cas12a-SDA和DNA-AuNPs光热效应的细菌检测方法，可以实现对细菌的简便、快速、高灵敏检测。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，根据这些附图获得其他的附图仍属于本发明的范畴。

图1 为基于SDA的DNA-AuNPs光热体系检测原理图（A）和基于CRISPR/Cas12a-SDA和DNA-AuNPs光热效应的细菌光热检测原理示意图（B）；

图2 为AuNPs和DNA-AuNPs加入1 M NaCl后的颜色变化（A）和紫外可见吸收光谱结果（B），柠檬酸/盐酸缓冲液孵育时间优化（C），DNA和AuNPs比例优化（D）；

图3为SDA可行性的9%凝胶电泳图谱（A），溶液颜色变化（B），UV-vis（C），光热效应（D）验证结果；

图4为CRISPR切割体系荧光验证原理图（A），荧光值结果（B）；

图5为基于CRISPR/Cas12a-SDA细菌检测方案可行性的UV-vis（A）及温度变化结果（B）；

图6为创伤弧菌的检测性能验证结果。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明作进一步地详细描述。

本发明通过对SDA的Template和Primer以及DNA-AuNPs中DNA序列的设计，构建了基于SDA的DNA-AuNPs光热体系，其检测原理图如图1A所示。该体系中Template和Primer在Bst3.0 DNA聚合酶和Nt.BbvCI内切酶作用下经过链置换等温扩增后，产生大量ssDNA，这些ssDNA链两端分别与DNA1和DNA2互补，诱导DNA1-AuNPs和DNA2-AuNPs杂交聚集。Template浓度越高，导致SDA扩增产物Linker浓度越高，进而导致DNA-AuNPs的聚集程度越大，经激光照射后产生的温度变化越大；反之亦然。

CRISPR/Cas体系（Clustered Regularly Interspaced Short PalindromicRepeat and CRISPR-Associated Protein）是一种原核生物的免疫防御系统，用来抵抗外来遗传物质的入侵，比如噬菌体病毒等。同时，它为细菌提供了获得性免疫（类似于哺乳动物的二次免疫），当细菌遭受病毒入侵时，会产生相应的“记忆”。当病毒二次入侵时，CRISPR系统可以识别出外源DNA，并将它们切断，沉默外源基因的表达，抵抗病毒的干扰。正是由于这种精确的靶向功能，CRISPR/Cas系统被开发成一种高效的基因编辑工具。CRISPR/Cas可以对基因进行定点的精确编辑。

本发明创新引入CRISPR/Cas体系，该系统可用于细菌基因组的检测，其检测原理如图1B所示。当体系内含有创伤弧菌DNA时，Cas12a/crRNA反式切割活性被激活，非特异性切割ssDNA（即Template），缺少Template的SDA体系无法扩增出导致AuNPs聚集的Linker链，因此AuNPs不发生聚集。当不含有创伤弧菌扩增DNA时，Template不被Cas12a/crRNA切割，经过SDA之后扩增出大量Linker，诱导DNA-AuNPs聚集，其光热转换效率明显提升，经过660 nm激光照射后，温度上升值明显。最后通过温度信号变化判定结果，从而建立基于CRISPR/Cas-SDA-AuNPs检测方法，并将该方法应用到创伤弧菌及其它细菌的定量检测。

以下实施例所采取的材料以及设备来源具体如下：

1. 材料与试剂

氯金酸购自上海麦克林生化科技有限公司。柠檬酸三钠和4-巯基苯硼酸购自Sigma-Aldrich（美国）。碳酸氢铵购自阿拉丁化学有限公司。Bst3.0 DNA聚合酶和Nt.BbvCI切刻内切酶购自美国NEB公司。dNTPs和DNA Ladder（20 bp）购自北京宝日医生物技术有限公司。染液Ultra GelRed购自北京诺唯赞生物科技股份有限公司。DNA序列由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。实验用水均为超纯水，电导率为18.2 MΩ cm。

表1 主要DNA序列

注：（1）FAM为荧光基团，BHQ1为荧光淬灭基团；

（2）-SH为巯基修饰。

2. 仪器与设备

多功能酶标仪（SpectraMax iD3，美谷分子仪器有限公司，上海）、高速冷冻离心机（5417 R 型，Eppendorf，德国）、集热式恒温加热磁力搅拌器（DF-101S型，上海力辰邦西仪器科技有限公司）、红外光热检测平台（MW-GX-660/2000 MW，长春镭仕光电科技有限公司），紫外可见光谱分析仪（凌析 V-3000，上海凌析仪器有限公司）、便携式温度计（榛利GL637，福州榛利机光电科技有限公司）、JEM-2100F高分辨透射电子显微镜（JEM-2100F，日本东京）等。

实施例1 DNA-AuNPs的制备：

（1）在经王水洗涤后的250 mL三颈圆底烧瓶中加入100 mL HAuCl

（2）根据AuNPs的消光系数ε为2.7×10

（3）分别将8 μL浓度为100 μM的SH-DNA1和SH-DNA2与400 μL的浓度为10 nM的AuNPs混匀，37℃振荡孵育30分钟。然后，加入柠檬酸/盐酸缓冲液（终浓度为10 nM），震荡孵育不同时间。将制得的溶液于4℃，12000 rpm离心10分钟，用超纯水洗涤两次以去除未结合DNA，重悬于400 μL含0.05%Tween-20的1 M的NaCl中，4℃保存。

以在高浓度盐溶液中的稳定分散状态探究性DNA-AuNPs的成功制备。如图2A-B所示，裸的AuNPs加入1 M NaCl后立刻发生聚集，溶液颜色由红色快速变为蓝色，并快速沉淀至管底，其在520 nm处的吸光度值也大幅度下降。而DNA-AuNPs加入相同浓度的NaCl依旧保持红色，吸光度值也未发生变化。结果表明，DNA功能化AuNPs的成功合成。

在酸化法合成DNA-AuNPs的过程中，柠檬酸/盐酸缓冲液孵育时间和DNA与AuNPs比例是影响DNA-AuNPs稳定性的重要因素。如图2C-D所示，根据520 nm处的吸光度，选择最适的柠檬酸/盐酸缓冲液孵育时间为10小时，DNA和AuNPs的最佳比例为200：1。

实施例2：

（1）CRISPR/Cas12a反式切割

首先将Template（1 μM）和Primer（1 μM）在95℃金属浴上孵育5分钟，然后缓慢降温至37℃并保持1小时，以形成杂交双链。将浓度均为200 nM的Cas12a和crRNA在37℃孵育30分钟，然后加入创伤弧菌的RPA扩增基因，Template和Primer的杂交双链（25 nM），1×2.1NEBuffer，以超纯水将体系补充至10 μL，将混合体系混匀后于37℃金属浴上孵育60分钟以进行酶切反应。

（2）链置换等温扩增反应（SDA）

SDA体系由Template、Primer、Bst3.0 DNA聚合酶、Nt.BbvCI切刻内切酶、dNTPs和rCutSmart Buffer组成。由于Cas酶活性灭活过程会打开Template和Primer的杂交双链，为了后续SDA过程，因此再次进行杂交反应，即将温度调回95℃孵育5分钟，然后缓慢降温至37℃并保持1小时，以形成杂交双链。然后，向上述体系中加入0.05 U Bst3.0 DNA聚合酶、0.05 U Nt.BbvCI切刻内切酶、250 μM dNTPs、1×rCutSmart Buffer和20 mM磷酸缓冲液（PB），37℃扩增100分钟，最后80℃孵育20分钟使酶活性失活。

（3）光热检测

取SDA扩增产物10 μL，加入40 μL DNA-AuNPs反应10分钟后进行1UV-vis和光热检测（1 W cm

SDA过程能扩增出大量ssDNA链，从而诱导DNA-AuNPs聚集，当SDA系中缺少Template链时，SDA过程无法进行。以Template和Primer同时存在为实验组，以无Template（即仅Primer）为阴性对照组。如图3A电泳结果所示，实验组（1泳道）中Template和Primer经退火后形成杂交双链，扩增反应后生成Linker条带。对照组（2泳道）中无Template时，无法扩增出ssDNA。如图3B-D所示，实验组DNA-AuNPs颜色由红色变为蓝紫色，吸光度值发生红移，激光照射后温度上升约6℃。而阴性对照组DNA-AuNPs仍保持分散状态的红色，激光照射后温度上升值明显低于实验组。结果证明了基于SDA诱导DNA-AuNPs聚集方案的可行性。

CRISPR/Cas12a切割过程示意图如图4A所示，完整的切割体系包括：Cas12a、crRNA、荧光基团（FAM）和荧光淬灭基团（BHQ）同时标记的探针（Probe）以及靶标（创伤弧菌DNA）。只有当体系完整（即创伤弧菌DNA存在）时，Cas12a/crRNA反式切割活性被激活，非特异性切割外源性ssDNA（荧光探针）。由于该Probe两端修饰有荧光基团和荧光淬灭基团，当探针完整时，荧光基团的荧光被淬灭基团淬灭；而当探针被切割后，修饰在两端的荧光基团和淬灭基团由于发生远离从而发出强烈荧光信号，通过紫外灯可视化观察或酶标仪定量检测体系荧光即可判断Cas12a/crRNA的反式切割活性。实验中，以创伤弧菌DNA存在时为实验组，以不存在靶DNA时为对照组。如图4B所示，实验组试管在紫外灯下产生绿色荧光，522 nm处荧光值较强，说明Cas12a/crRNA反式切割活性被激活，探针被非特异性切割。而对照组中未产生荧光，说明不存在靶DNA时，非特异性切割未发生。上述结果证明CRISPR/Cas12a切割体系的成功建立。

创伤弧菌检测的可行性验证如图5所示。实验组为存在创伤弧菌RPA扩增靶基因，靶基因和crRNA结合后，诱导Cas12的酶切过程，非特异性切割外源性ssDNA（即长链Template和短链Primer杂交后，Template上非杂交的单链片段）。由于缺少Template，SDA扩增后Linker产生效率显著降低，因此DNA-AuNPs仍保持分散状态，溶液为红色（图5A），激光照射后温度上升约5℃（图5B）。对照组为无创伤弧菌靶基因，因此体系中Template和Primer保持完整，经过SDA之后扩增出大量ssDNA，诱导了DNA-AuNPs的聚集，激光照射后温度上升约6.7℃（图5B）。实验结果表明，基于CRISPR/Cas12a-SDA细菌检测策略的可行性。

创伤弧菌的检测性能如图6所示，创伤弧菌RPA扩增靶基因浓度的对数值与530 nm处吸光度值呈正比，细菌浓度越高，DNA-AuNPs分散程度越明显，且在10

以上实施例提供了检测创伤弧菌的应用，本领域技术人员可以设计更换实施例中的crRNA，从而用于检测其它细菌。具体crRNA的设计过程如下：随机设计一段含有 PAM序列（TTTN）的长度为35 bp的dsDNA作为靶核酸，以Cas12a的scaffold序列（UAA UUU CUA CUAAGU GUA GAU）加上靶核酸PAM序列后的20个碱基。

以上所揭露的仅为本发明较佳实施例而已，当然不能以此来限定本发明之权利范围，因此依本发明权利要求所作的等同变化，仍属本发明所涵盖的范围。