新型布鲁氏菌菌壳疫苗及其应用

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，具体涉及新型布鲁氏菌菌壳疫苗及其应用。

背景技术

细菌菌壳是一种缺少细胞浆和核酸而导致无繁殖能力的细菌空壳形态。自然形成的菌壳是由感染了噬菌体Phi X174的大肠杆菌在溶菌周期由于宿主细胞裂解而形成的；人为制备菌壳技术主要利用基因工程技术依赖大肠杆菌噬菌体Phi X174的裂解基因E的表达产物，在其寡聚化、构象改变及其它生化反应使大多数革兰氏阴性细菌形成一个40-200nm直径的跨膜孔道，导致宿主菌的细胞浆和核酸等细胞内容物在渗透作用下外流而溶菌形成菌壳。由于该技术制备菌壳过程中没有蛋白变性，菌壳保留了与活菌完全一样的细胞膜结构和相关抗原蛋白，从而没有任何免疫原性的改变，是一种新型非变性灭活菌苗，比传统甲醛灭活菌苗在理论上具有更好的免疫原性和免疫保护效果。

布鲁氏菌目前在人畜间的危害日益加剧，给动物健康养殖、畜产品安全、公共卫生安全及进出口贸易带来了严重的危害。人间传播的报道时常发生，已达历史最高峰，染病动物是主要传染源，目前仍无人用疫苗。近些年来随着动物流动性与养殖密度的增加，布病也呈爆发式增长，处于历史高度流行期。疫苗接种是预防传染病最有效的方法，在布病的防控与净化过程中尤为如此。目前国内外使用的疫苗多为弱毒疫苗，主要为S2、M5、S19、A19等，虽然这些疫苗在防控动物布病上起到了一定的作用，但是因为其安全性较差，可致孕畜流产，还可以感染人；其可造成免疫抑制，导致免疫保护率不高；其具有一定毒力，可发生毒力返强、破坏生态环境；无法区分自然感染和疫苗免疫动物等缺陷严重地限制了布鲁氏菌病疫苗在防控过程中发挥的作用，导致目前布病疫苗免疫密度不高，造成动物布病流行的不利局面。

在1982年，国外Young K和Henrich B等最早开始研究菌壳技术，直至2004年国内才见诸报道菌壳技术研究，但发展较快已成功构建了多种大肠杆菌、副猪嗜血杆菌、多杀性巴氏杆菌、嗜水单气胞菌、胸膜肺炎放线杆菌、迟缓爱德华菌、伤寒沙门氏菌、柱状黄杆菌及布鲁氏菌等菌壳，并都能达到可观的溶菌率，用这些制备的菌壳作为非变性灭活疫苗比传统甲醛灭火菌苗能有较为理想的免疫效果。王丽哲等制备的大肠杆菌O138菌影可以刺激机体产生对大肠杆菌O138抗原的特异性免疫应答，且经腹腔注射和口服免疫的保护率分别为100％和70％。常月红等制备的胸膜肺炎放线杆菌菌壳经肌肉注射免疫后，可产生一定的抗体水平，对于同型和非同型APP的攻毒均具有一定的免疫保护效果。刘东胜等制备的多杀性巴氏杆菌菌壳可使小鼠产生较好的免疫保护，其保护率高达100％。王雪鹏等制备的迟缓爱德华菌菌壳疫苗和付立霞等制备的嗜水气单胞菌菌壳疫苗对于预防鱼类细菌性疾病具有潜在的价值。因此，菌壳疫苗预防传染性细菌疾病大有可为，应用前景广阔。

目前市售的布鲁氏菌疫苗均为弱毒疫苗，如S2、M5、S19、A19等，虽然这些疫苗效力较高、保护周期久，但是也存在严重的不足，严重制约了疫苗免疫在动物布病防控中的作用。主要问题：1)安全性差，导致孕畜流产，可感染人；2)菌株均为自然弱毒的菌株，免疫后可造成免疫抑制，免疫保护率不高，抗体水平持续时间较短；3)接种后容易出现毒力返强，自然排毒等，破坏生态环境；4)疫苗所选菌株均为平滑型菌株，无法区分自然感染和疫苗免疫动物，导致当前动物布病疫苗的免疫密度较低，无法真正有效防控动物布病的流行。

安全有效的灭活疫苗是当前产业急需的产品，而传统甲醛灭活的疫苗因破坏了布鲁氏菌表面完整的抗原结构，导致其免疫有效期较短，免疫保护力不佳，无法有效开展动物布病防控；因为布鲁氏菌感染和免疫机制较为复杂，有效抗原的筛选较难，一些基因工程亚单位疫苗均停留在实验室研究阶段，还无法投入生产，在临床应用。

以上这些问题，是当前布动物布病疫苗研究的技术瓶颈，严重制约了我国动物布病新型疫苗的研发与应用。

发明内容

有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供新型布鲁氏菌菌壳疫苗及其应用，本发明提供的新型布鲁氏菌菌壳疫苗保留了细菌表面完整的抗原决定簇，免疫原性和免疫保护效果更佳，更安全，且能够有效区分布鲁氏菌自然感染和疫苗免疫的动物。

本发明提供了新型布鲁氏菌，其缺失尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶UGPase基因且包含噬菌体裂解蛋白E基因；

所述尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶UGPase基因具有如SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列，所述噬菌体裂解蛋白E基因具有如SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列。

在一些具体实施例中，所述新型布鲁氏菌的底盘菌为羊布鲁氏菌16M菌株。

本发明提供的新型布鲁氏菌由于缺失尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶UGPase基因且包含噬菌体裂解蛋白E基因，改变了菌体的表面结构，极大减弱了与自然感染的布病阳性血清的免疫反应，可实现鉴别诊断作用。

本发明还提供了所述的新型布鲁氏菌的制备方法，包括对底盘菌中的尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶UGPase基因进行突变并引入噬菌体裂解蛋白E基因后获得。

进一步的，所述尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶UGPase基因的突变包括：构建含有UGPase基因的自杀质粒，将其电转化入羊布鲁氏菌16M感受态细胞中培养，经筛选和鉴定后获得布鲁氏菌UGPase基因缺失株。

更进一步的，所述噬菌体裂解蛋白E基因的引入包括：构建含有噬菌体裂解蛋白E基因的质粒，将其电转化入所述布鲁氏菌UGPase基因缺失株中，经筛选和鉴定后获得所述新型布鲁氏菌。

在一些具体实施例中，所述质粒为温度敏感型质粒。

本发明通过基因缺失技术和菌壳制备技术，分别在布鲁氏菌基因组上缺失尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶UGPase基因，构建了可实现鉴别诊断的布鲁氏菌基因缺失株，并以此菌株为基础转入噬菌体裂解蛋白E基因温度敏感型质粒，与现有布鲁氏菌株相比，本发明的新型布鲁氏菌保留了细菌表面完整的抗原决定簇，免疫原性和免疫保护效果更佳，同时更安全，从未提供了更准确的技术效果。

本发明提供了所述的新型布鲁氏菌或所述的制备方法制得的新型布鲁氏菌在制备新型布鲁氏菌疫苗中的应用。

本发明提供了新型布鲁氏菌疫苗，包括如下①或②所述新型布鲁氏菌的菌壳疫苗和佐剂：

①、所述的新型布鲁氏菌；

②、所述的制备方法制得的新型布鲁氏菌。

与传统灭活疫苗相比，本发明的新型布鲁氏菌菌壳疫苗保留了细菌表面完整的抗原决定簇，免疫原性和免疫保护效果更佳，同时更安全，从而提供了更准确的技术效果。

在一些具体的实施例中，所述佐剂为HMT31，所述菌壳疫苗中新型布鲁氏菌的含量为9.3×10

实验表明，本发明的菌壳疫苗配合专属佐剂HMT31对动物进行免疫接种，在细胞免疫水平上取得了良好的效果，能够明显提高IL-2、IL-12p70、IFN-γ、TNF-α这4种细胞因子分泌水平，并抑制IL-10的分泌水平，在上述浓度范围内，所述菌壳疫苗和佐剂的配合更好，从而提供了更准确的技术效果。

本发明提供了所述的新型布鲁氏菌疫苗的制备方法，包括取所述的新型布鲁氏菌经培养、诱导和离心后添加所述佐剂获得所述新型布鲁氏菌疫苗。

进一步的，所述培养包括取所述新型布鲁氏菌于28℃下培养至OD

在一些具体实施例中，所述离心后的菌壳疫苗经无菌PBS重悬至少1次后再进行保存。

本发明还提供了所述的新型布鲁氏菌疫苗在鉴别自然感染和疫苗免疫布鲁氏菌的动物中的应用。

本发明提供了缺失尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶UGPase基因且包含噬菌体裂解蛋白E基因的新型布鲁氏菌及其制备方法，进一步提供了包含所述新型布鲁氏菌的新型布鲁氏菌菌壳疫苗及其制备方法。

与现有弱毒疫苗相比，①安全性高，对孕畜安全，不感染人，免疫的菌数可提高10个数量级，对动物仍安全。②无免疫抑制现象，可激活机体细胞免疫水平，有效提高疫苗的免疫保护效果。③可实现鉴别诊断，因该疫苗在制备前利用基因缺失技术进行了有效基因的缺失，致使该疫苗免疫后能够有效区分自然感染和疫苗免疫的动物。④该疫苗选择的菌株是当前危害最严重的，导致人感染的最严重的，流行率在95％以上的菌株，有效提高该疫苗的免疫覆盖率。

与传统的灭活疫苗相比，①该疫苗采用的灭活技术能够保留细菌表面完整的抗原结构和天然构象，能够产生良好的免疫原性，该技术优于传统甲醛灭活方法制备的灭活疫苗；②能够有效诱导机体产生良好的体液免疫和细胞免疫水平，具有较好的免疫保护水平；③生产工艺简单，诱导效率高，可致细菌100％灭活，可冻干保存；④菌壳疫苗含有脂多糖和肽聚糖，本身具有佐剂效应，再配合专属佐剂HMT31，显著增加了免疫效果。

附图说明

图1示上游同源臂Ugpf与下游同源臂Ugpr的PCR图；

图2示自杀质粒简图；

图3示自杀质粒pBK-CMV-SacB-Ugp的PCR鉴定图，其中，M：DNA Marker，5、8、9和10为自杀质粒PCR阳性结果；

图4示自杀质粒pBK-CMV-SacB-Ugp的双酶切鉴定图，其中，M：DNA Marker，1和2为自杀质粒PCR阳性结果；

图5示布鲁氏菌缺失株16MΔUGP的PCR鉴定图，其中，M：DNA Marker，3、4、6、9、10、11、12、13和14为16MΔUGP PCR阳性结果；

图6示转化菌生长情况；

图7示E基因的PCR扩增图；

图8示TLC片段的PCR扩增结果；

图9示免疫小鼠血清抗体检测；

图10示豚鼠各免疫组IL-2含量比较；

图11示豚鼠各免疫组IL-10含量比较；

图12示豚鼠各免疫组IL-12p70含量比较；

图13示豚鼠各免疫组IFN-γ含量比较；

图14示豚鼠各免疫组TNF-α含量比较；

图15示绵羊各免疫组IFN-γ含量比较；

图16示绵羊各免疫组IL-2含量比较；

图17示绵羊各免疫组IL-10含量比较；

图18示绵羊各免疫组IL-12含量比较；

图19示绵羊各免疫组TNF-α含量比较；

图20示试验组豚鼠各脏器载菌量分析；

图21示试验组克脾菌数分析；

图22示琼脂糖扩散试验结果；

图23示A-M因子凝集试验结果。

具体实施方式

本发明提供了新型布鲁氏菌菌壳疫苗及其应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

布鲁氏菌是典型的胞内寄生菌，传统灭活疫苗虽安全，但是引起免疫保护效力不佳，未能进行推广应用，目前布鲁氏菌疫苗多为弱毒疫苗，这些疫苗虽然在布鲁氏菌防控上起到了一定的作用，但是因为其安全性差，容易造成人感染，孕畜流产，免疫保护率不高，存在毒力返强，接种后排毒等风险，严重制约了其使用。而且传统甲醛灭活疫苗与弱毒疫苗都无法区分自然感染与疫苗免疫的动物，致使当前动物布病疫苗免疫密度不高，严重制约了该病的防控与净化，导致当前畜间动物布病流行率逐渐增加，公共卫生安全事件频发。

目前同类型的布鲁氏菌菌壳疫苗均是在现有疫苗株的基础上进行制备的菌壳，在免疫保护性和流行菌株上优势不足，菌株选择无优势，同时均无法区分自然感染与疫苗免疫的动物，不能实现鉴别诊断，对当前我国动物布病流行率较高的情况下严重制约着动物布病净化。

本发明针对以上的问题，发明了一种新型布鲁氏菌菌壳疫苗。本发明通过基因缺失技术和菌壳制备技术，分别在布鲁氏菌基因组上缺失了一个特定的基因，构建了可实现鉴别诊断的布鲁氏菌基因缺失株，并以此菌株为基础转入温控的裂解基因质粒，在特定诱导条件下制备了布鲁氏菌新型灭活的菌壳疫苗。与传统灭活疫苗相比，本发明的新型布鲁氏菌菌壳疫苗保留了细菌表面完整的抗原决定簇，免疫原性和免疫保护效果更佳，同时更安全。该疫苗缺失了布鲁氏菌与脂多糖(LPS)合成有关的基因，改变了LPS的表面结构，极大减弱了与自然感染的布病阳性血清的免疫反应，可实现鉴别诊断作用。

除此之外，本发明的新型疫苗配合专属佐剂HMT31对动物进行免疫接种，在细胞免疫水平上取得了良好的效果。

本发明中相关术语解释：

(1)灭活疫苗：灭活疫苗是指利用物理及化学方法使病原体死亡制备而成的疫苗，疫苗中的病原体没有活性，注入人体后无法繁殖，不具有传染性。

(2)弱毒疫苗：弱毒疫苗是指一种病原致病力减弱但仍具有活力的完整病原疫苗。

(3)菌壳疫苗：是一种利用细胞膜打孔技术让细菌细胞内容物全部释放出来，是使细菌丧失复制能力但保留细菌表面完整抗原结构的灭活菌体疫苗。

(4)佐剂：指通过给免疫系统施行非特异性刺激，而能加强对抗原的特异性免疫反应的物质总称，亦称助剂。

本发明采用的试材皆为普通市售品，皆可于市场购得。下面结合实施例，进一步阐述本发明：

实施例1菌株构建

1.1

通过构建针对UGPase基因的自杀质粒，经抗性基因和SacB基因的正、负向筛选，获得布鲁氏菌UGPase缺失株，即16MΔUGP株。

1.1.1引物设计与合成

根据GeneBank中登录的羊布鲁氏菌UGPase基因序列以及T1 cloning vector克隆载体、pBK-CMV-SacB载体的特性及所含酶切位点，使用Primer5.0设计引物，引物序列见表1。

表1引物名称及序列

UGPase基因序列如下所示：

ATGAGTTCTATTCGGAAAATCCGCAAGGCAGTCTTTCCCGTCGCAGGTCTTGGAACGCGCTTCCTGCCCGCAACCAAATCCATCCCGAAGGAAATGCTGACGGTTGTTGACAAACCCGTCATCCAATATGTCGTGGACGAAGCGCGCGAGGCGGGTATTGAACACCTGATTTTCGTTACGGGGCGCAACAAGGCTGTCATCGAGGATTATTTCGATGCGCAGGTGGAGCTTTATTCCACACTGGCCGAACGGGGGAAAACCGAAGAGTTGAACCGCCTGCAGGATTTGCAGCCGCAGCCGGGCACCACCAGCTTTACCCGCCAGCAGGTGCCGCTTGGCCTCGGCCACGCTGTCTGGTGTGCGCGGGAACTGGTGGGCAACGAACCTTTTGCACTGCTTCTGCCTGATATGGTGATGCAGTCGAAAAAGGGCTGCCTTGCCGAAATGGTCGAACTTTACGAACAGACCGGCGGCAATATCATCGCCGTGCAGGAATGCGACCCGGAAGAGGCGCATAAATACGGTATCGTGGGCAAGGGCGGCGCTGTCGGCAATGGCTTCGAGATTACGCGCATGGTCGAAAAGCCGGCTAAGGGCACGGCGCCGTCCAATCTCTATATCAATGGGCGCTATATCCTCCAGCCGGAGATTTTCGGGCTGTTGAGCAAGCAGGAAAAGGGTGCGGGCAACGAAATCCAGCTGACCGATGCCATGCTGAAGCTTGCCGACCAGCAGAAGTTCTATGGCTTCGATTATCGCGGGCTGACCTTCGATTGCGGCTCGAAGGCAGGCTTCATTGAGGCCAATGTGGCTTTCGCACTATGGCGTGAGGATATCCGCCCGTCCGTGGAAGGCTCCATCGGCCATCTGTTGAAGACGATCCAGCCAGCCTGA(SEQ ID NO:1)

1.1.2UGPase基因上、下游同源臂的克隆

取-80C°保存的羊布鲁氏菌16M菌株，在TSA平板上划线，37C°培养4-5d，挑取单菌落，接种于6mL液态TSB培养液中，160rpm，37C°培养36-48h，取1mL菌液，12000rpm/min离心1min，弃上清，用1mL无菌PBS重悬后，12000rpm/min离心1min，弃上清，加入90μL蒸馏水，沸水浴10min，离心重悬即为基因组模板。以16M基因组DNA为模板，利用引物Ugpf-F/Ugpf-R和Ugpr-F/Ugpr-R进行PCR扩增。PCR条件：94℃,5min，(94℃30s，58℃30s，72℃1min)30circles，72℃10min。PCR产物1％琼脂糖凝胶电泳分析。

将回收PCR片段与pMD19-T vector连接，16℃，2h。连接产物转化DH5α感受态。涂于抗性LB平板(Amp)，37℃静置培养。次日，挑取单菌落培养并提取质粒，分别用BamH I/Xho I和Xho I/Xba I双酶切鉴定。

PCR电泳结果可见，成功扩增出预期条带大小的Ugpf 762bp和Ugpr909bp片段，见图1。

1.1.3UGPase自杀质粒的构建与鉴定

将鉴定正确的UGPase上、下游同源臂经双酶切后回收，同时也将实验室保存的pBK-CMV-SacB质粒经BamH I和Xba I酶切消化后回收。T4连接酶于16℃先作用3h后4℃作用2h，次日转化至DH5α感受态，42℃热击90s后加入无抗性LB，37℃震荡2h后，涂于抗性LB平板(Kan)，37℃静置培养用Ugpf-F和Ugpr-R进行PCR鉴定，阳性样品提取质粒，用BamH I和XbaI双酶切鉴定，阳性即为pBK-CMV-SacB-Ugp，自杀质粒构建见图2。

用引物Ugpf-F和Ugpr-R对挑取的菌落进行PCR鉴定，见图3，将PCR正确的菌液提取质粒，进行双酶切鉴定，结果可见目的条带，见图4。

1.1.4UGPase布鲁氏菌16M感受态的制备及电转化

将冻存羊布鲁氏菌16M划线于TSA上，37℃，4-6d；单菌落接入6mL TSB培养液，180rpm，37℃，培养32h；以1:150比例转接入300mL TSB培养液，180rpm，37℃，16h；将细菌置于冰浴中45min，期间每10min晃动1次；转入预冷离50mL心管中，4℃5500rpm，离心20min，弃上清；加入190mL蒸馏水重悬，4℃，5500rpm，离心20min，弃上清；加入25～30mL蒸馏水重悬，转至50mL离心管中；弃上清，加入600μL蒸馏水重悬，每管110μL分装，-80℃保存。

布鲁氏菌16M感受态放入冰浴解冻，加入10μL自杀质粒，混匀冰浴30min；缓慢移入预冷的电击杯中，13.5KV/cm电击，迅速加入2mL的SOC-B，37℃，180rpm，培养1d。取150μL涂TSA(Kan)平板，37℃，培养3d。

1.1.5双向筛选与鉴定

同源重组载体上带有Kan筛选标记，因此TSA(Kan)平板上生长的单菌落及即为单交换子；将单交换子在液体培养基中培养2-3d，稀释后取100μL，涂于5％的蔗糖TSA上，37℃，培养3d。筛选出的△UGP涂于TSA(Kan)平板，将阳性菌株置于5ml TSB(Kan)培养基中观察是否生长，没有生长的菌株视为鉴定正确。用Ugpf-F和Ugpr-R进行PCR进一步鉴定，符合片段长度即为羊布鲁氏菌16M△UGP株。经Kan抗性正向筛选和SacB基因负向筛选，同样采用Ugpf-F和Ugpr-R引物对重组菌株进行PCR鉴定，野生型布鲁氏菌可扩增得到2565bp，如泳道1,2，发生同源重组的菌株则可扩增出1671bp(或同时包含2565bp)，如泳道3,4等，见图5。

1.2、利用含有E裂解基因的温度敏感型质粒pBBR1MCS-2-TLC，通过电击转化进入羊布鲁氏菌16M△UGPase株，筛选获得重组菌株。经鉴定此菌株即为缺失尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶UGPase基因且包含噬菌体裂解蛋白E基因的新型布鲁氏菌(16MΔUGP-BG)株。

其中E裂解基因的序列如下所示：

ATGGTACGATGGACTTTGTGGGATACCCTCGCTTTCCTGCTCCTGTTGAGTTTATTGCTGCCGTCATTGCTTATTATGTTCATCCCGTCAACATTCAAACGGCCTGTCTCATCATGGAAGGCGCTGAATTTACGGAAAACATTATTAATGGCGTCGAGCGTCCGGTTAAAGCCGCTGAATTGTTCGCGTTTACCTTGCGTGTACGCGCAGGAAACACTGACGTTCTTACTGACGCAGAAGAAAACGTGCGTCAAAAATTACGTGCGGAAAGAG(SEQ ID NO:2)

1.2.1广宿主表达质粒pBBR1MCS-2-TLC的电击转化

将△UGP感受态从-80℃冰箱取出，冰浴10min融化，加入10μL重组广宿主质粒pBBR1MCS-2-TLC，慢慢吹匀，冰浴30min；快速用移液器吸将混合液转入预冷的1mm电击杯中；电转仪电转，参数13kV/cm，6ms；移入1.5mL离心管，与1mL 6％TSB混匀，置于28℃恒温摇床，160r/min培养3h；取150μL菌液涂于TSA(Kan)平板上，28℃培养5～7d。筛选菌落见图6。

分别用特异性引物(E基因、TLC片段)对筛选菌落进行PCR鉴定，结果显示筛选到了与预期条带大小相符的候选菌株。这说明含有目的片段的质粒成功转入羊布鲁氏菌ΔUGP中，结果见图7。对鉴定为阳性的ΔUGP重组菌株，利用布鲁氏菌种引物进行PCR鉴定，扩增出片段为272bp和1071bp条带，符合布鲁氏菌菌种多重PCR大小，见图8。鉴定为阳性菌株命名为16MΔUGP-BG疫苗株。

经实验验证，布鲁氏菌16MΔUGP-BG株连续传17代后仍可继续培养，这说明携带的广宿主质粒基因在此过程中没有发生丢失突变现象，表明该菌株具有良好的遗传稳定性。

实施例2新型布鲁氏菌菌壳疫苗免疫原性试验

将实施例1构建的新型布鲁氏菌菌株于28℃下培养，当OD

2.1菌壳疫苗的最小免疫保护剂量

为了确定菌壳疫苗的最小免疫保护剂量，分别将菌壳疫苗设计了2.5×10

表2不同免疫剂量与脏器载菌量的关系

2.2评价动物抗体水平

使用菌壳疫苗免疫小鼠，首次免疫后第1周至第6周尾静脉采集小鼠血，室温放置2h后，4℃，4000r/min离心10min，收集血清，-20℃保存备用。用间接ELISA法检测小鼠血清中特异性IgG水平，结果如图9所示。菌壳组抗体水平在第2周后明显上升，与M5组相当，于第5周达到最高值，且与FKB组差异显著。

(1)菌壳疫苗免疫豚鼠，根据免疫剂量不同与是否使用免疫增强剂分为5组，即10

豚鼠加强免疫后14天采血，检测INF-γ，IL-2，IL-12，IL-10，TNF-α这五种细胞因子含量，结果显示10

表3豚鼠免疫剂量分组

由图10～14结果可知，本实验对适龄的豚鼠进行免疫实验，根据不同免疫剂量与是否使用HMT31佐剂进行分组，同时设置PBS对照组。由实验结果可知，10

菌壳疫苗免疫绵羊，根据免疫剂量不同与是否使用免疫增强剂分组，同时增加S2疫苗免疫组。即10

绵羊加强免疫后14天采血，检测INF-γ，IL-2，IL-12，IL-10，TNF-α这五种细胞因子含量，结果显示10

表4绵羊免疫剂量分组

由图15～19结果可知，本实验对适龄的绵羊进行免疫实验，根据不同免疫剂量与是否使用HMT31佐剂进行分组，同时设置PBS对照组。由实验结果可知，10

2.3疫苗的攻毒保护试验

菌壳疫苗免疫豚鼠，免疫后44天攻毒，每只豚鼠攻毒羊种布鲁菌M28，剂量为15CFUs。攻毒后30天，取脾脏、颌下淋巴结、腹股沟淋巴结、肠系膜淋巴结、肩前淋巴结进行无菌研磨，细菌培养。菌落计数统计学分析数据显示，菌壳(2.5×10

与S2相比，菌壳疫苗在载菌数量，平均菌落数，平均脾脏载菌量，平均脾重，平均克脾菌数以及保护单位均相当并略有优势，如表5所示。

各脏器载菌落量检测发现菌壳与S2与PBS组比较均有明显的除菌率，如图20所示。从克脾菌数上分析，菌壳苗脾脏的克脾菌数为0，明显优于S2和PBS组豚鼠，如图21所示。

表5BG和S2疫苗攻毒保护比较分析

由表5及图20可知，布鲁氏菌菌壳疫苗组各脏平均载菌数为4.1CFU，显著优于空白对照组，也优于S2疫苗组。

由图21可知，布鲁氏菌菌壳疫苗组脾脏的克脾菌数为0，明显优于S2和PBS组。

实施例3新型布鲁氏菌菌壳疫苗的鉴别诊断

3.1琼脂糖扩散试验

分别对基因改造后的疫苗菌株与正常菌株进行琼脂糖扩散试验，分别采用25ng/mL、50ng/mL、100ng/mL与200ng/mL 4个浓度梯度进行试验，由图22可以看出，正常16M菌株可明显看到圆形沉淀线，这是抗原与抗体反应的结果，而改造后新型疫苗株无沉淀线。.

3.2A-M因子凝集试验

分别对基因改造后的疫苗菌株与正常菌株进行A-M因子凝集试验，由图23可明显的看出，正常16M菌株与A-M血清菌发生了反应，出现了凝集现象。而改造后新型疫苗株无凝集现象。

通过上述两个试验结果可知，新型布鲁氏菌菌壳疫苗能够实现自然感染与疫苗免疫的鉴别诊断。

以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。