CLIC4在制备放射治疗鼻咽癌制剂中的应用

技术领域

本发明涉及生物医学技术领域，涉及CLIC4作为蛋白标志物的新用途，具体涉及CLIC4作为蛋白标志物在制备预测鼻咽癌光子辐射耐受制剂中应用；尤其涉及CLIC4的表达用于制备在鼻咽癌光子辐射敏感性差异以及其在鼻咽癌放疗效果预测和治疗制品中的应用。

背景技术

现有技术公开了鼻咽癌是发生在鼻咽侧壁和顶部的恶性肿瘤，发病率在耳鼻咽喉恶性肿瘤中居于第一位，临床研究显示，鼻咽癌主要好发于东南亚,特别是中国华南地区。实践显示，放射治疗是治疗鼻咽癌的首选方法之一。随着科学技术的进步，立体定向放疗技术的应用越来越广泛，据统计，早期鼻咽癌的放疗后5年生存率达到了90％多，晚期生存率也达到了70％多，但遗憾的是，放疗耐受会导致治疗效果差和早期复发，因此，寻找鼻咽癌产生光子耐受的基因/蛋白对今后鼻咽癌治疗的发展具有非常重要的实践指导意义。

近年来，随着经济的发展和科技的进步，TMT(Tandem Mass Tag)差异蛋白质组学定量分析技术应用越来越广泛。本发明的研究退队通过将TMT标记、高效液相色谱分级技术以及基于质谱的定量蛋白质组学技术等一系列前沿技术的有机结合，对有关样本进行定量蛋白组的研究，之后对包含定量信息的蛋白质进行了系统的生物信息学分析，包括蛋白注释、功能分类、功能富集及基于功能富集的聚类分析，并综合以上信息，结合临床基因芯片筛选出可能的辐射敏感性差异相关的分子标志物，将为今后鼻咽癌预后相关标志物的研究提供理论基础和科学依据。

本发明通过质谱结果筛选出在鼻咽癌辐射耐受细胞株与辐射敏感细胞株中差异表达的基因，显示CLIC4在鼻咽癌辐射耐受株细胞中的表达明显高于鼻咽癌辐射敏感株细胞中的表达，检索Pubmed及相关数据库发现，CLIC4在鼻咽癌辐射敏感性中的功能未见报道。

基于现有技术的基础与现状，本申请的发明人拟提供CLIC4作为蛋白标志物的新用途，具体涉及CLIC4作为蛋白标志物在制备预测鼻咽癌光子辐射耐受制剂中应用。

发明内容

本发明的目的是基于现有技术的基础与现状，提供CLIC4作为蛋白标志物的新用途，具体涉及CLIC4作为蛋白标志物在制备预测鼻咽癌光子辐射耐受制剂中应用。

本发明通过质谱结果筛选出在鼻咽癌辐射耐受细胞株与辐射敏感细胞株中差异表达的基因CLIC4，结果显示CLIC4在鼻咽癌辐射耐受株细胞中的表达明显高于鼻咽癌辐射敏感株细胞中的表达。

更具体的，本发明取待测样本，然后分析比较待测样本与正常对照中CLIC4的表达量，CLIC4的表达量越高，鼻咽癌细胞的光子辐射敏感性越差，耐受性越强。

本发明中，所述的待测样本可以是细胞样本，组织样本，或者细胞、组织的蛋白抽提物；正常对照可以是正常人的样本，较好的是取自患者本人肿瘤组织周边的组织或者细胞样本；检测时，通常采用相关抗体等检测样本中CLIC4含量；实验结果用三次独立实验的平均值和标准差表示，用双侧t检验来比较差异；p＜0.01认为具有统计学差异；所有数据采用SPSS V13.0软件或者具备类似统计功能的软件分析。

本发明的CLIC4是细胞内氯离子通道蛋白，其序列及相关信息可以参考Genbank数据库。

本发明进行了实验，其中，先对鼻咽癌细胞系(即鼻咽癌辐射敏感株CNE-1,CNE-2)进行γ射线照射，分割照射累计剂量至60Gy，建立辐射耐受株(CNE-1R,CNE-2R)；接着利用TMT技术，分析鼻咽癌辐射耐受株与辐射敏感株中的差异蛋白，结果显示CLIC4在鼻咽癌辐射耐受株中的表达高于辐射敏感株；其次，结合临床基因芯片，验证CLIC4在鼻咽癌放疗抵抗样本组中的表达显著高于放疗敏感样本组；

本发明中，在细胞水平，证实CLIC4在鼻咽癌辐射耐受株中的表达高于辐射敏感株，结果表明，本发明的CLIC4可作为蛋白标志物用于制备预测鼻咽癌光子辐射敏感性的制剂。

本发明中，运用细胞存活克隆形成实验检测辐射耐受细胞与敏感细胞在细胞不同光子剂量下的存活能力差异，结果显示，相同剂量下，鼻咽癌辐射耐受细胞的克隆形成能力显著强于辐射敏感细胞，即鼻咽癌辐射耐受细胞辐射敏感性低。

本发明中，运用qRT-PCR和western blot技术对鼻咽癌辐射耐受细胞与敏感细胞中CLIC4的表达进行检测，结果显示，鼻咽癌辐射耐受细胞中的CLIC4的mRNA和蛋白水平均明显高于辐射敏感细胞。

本发明中，运用shRNA显著下调鼻咽癌辐射耐受细胞和辐射敏感细胞中的CLIC4，结果显示，CLIC4下调后细胞株的辐射敏感性均提高。

本发明还提供了CLIC4在制备抑制鼻咽癌细胞辐射耐受制品中的应用，所述的CLIC4可以作为筛选鼻咽癌细胞辐射耐受药物的药靶；降低CLIC4表达量的物质可作为抑制肿瘤细胞侵袭药物的候选药物。本发明同时提供了IAA94(Indanyloxyacetic acid 94，R(+)-IAA-94)是一类潜在的氯离子通道蛋白抑制剂，可以抑制CLIC4及其同家族氯离子蛋白的表达，进一步可以制备作为临床鼻咽癌放疗时增加肿瘤细胞辐射敏感性的潜在药物。

本发明运用了ROS荧光探针检测技术对CLIC4表达发生改变时细胞内ROS的改变进行检测，结果显示，CLIC4高表达细胞在受到辐射后ROS的水平上升较弱，反之，敲低细胞内CLIC4后，细胞在受到辐射后ROS的水平明显上调，表明CLIC4通过抑制细胞内ROS水平促进细胞辐射耐受，进一步，本发明的CLIC4可以制备作为筛选鼻咽癌辐射增敏的药物的药靶。

本发明提供CLIC4作为蛋白标志物的新用途，尤其CLIC4作为蛋白标志物在制备预测鼻咽癌光子辐射耐受制剂中应用。本发明通过质谱结果筛选出在鼻咽癌辐射耐受细胞株与辐射敏感细胞株中差异表达的基因CLIC4，经试验，结果显示CLIC4在鼻咽癌辐射耐受株细胞中的表达明显高于鼻咽癌辐射敏感株细胞中的表达。进一步，所述的CLIC4可作为蛋白标志物用于制备预测鼻咽癌光子辐射敏感性的制剂，以及采用降低CLIC4表达量的物质用于制备抑制肿瘤细胞侵袭药物的候选药物，和，所述的CLIC4可以制备作为筛选鼻咽癌辐射增敏的药物的药靶。

本发明的实施例中以鼻咽癌细胞为模型，但是，本发明也可以应用于其他一些肿瘤，。因此CLIC4的特性及其与胞内ROS代谢通路作用的分子机制可以为肿瘤辐射抵抗的基础研究和辐射增敏药物的研发提供新的思路。

附图说明

图1显示克隆形成实验说明gamma射线0、2、4、6Gy照射下，鼻咽癌辐射耐受株(CNE-1R、CNE-2R)与辐射敏感株(CNE-1、CNE-2)的剂量存活曲线。

图2显示qRT-PCR结果中的CLIC4在CNE-1R、CNE-2R和CNE-1、CNE-2中的相对表达。

图3显示蛋白印迹实验结果中的CLIC4在CNE-1R、CNE-2R和CNE-1、CNE-2中的表达。

图4显示qRT-PCR结果中的CNE-1R、CNE-2R和CNE-1、CNE-2细胞受到光子照射(4Gy)后，CLIC4的相对表达情况。

图5显示shRNA干扰后，qRT-PCR结果中的CLIC4在CNE-1R、CNE-2R中的表达。

图6显示shRNA干扰后，蛋白印迹实验结果中的CLIC4在CNE-1R、CNE-2R、CNE-1、CNE-2中的表达及细胞受到辐射后CLIC4变化情况。

图7显示shRNA病毒干扰后，克隆形成实验说明gamma射线0、2、4、6Gy照射下，CNE-1R、CNE-2R、CNE-1、CNE-2的阴性对照组(Negative control组)、CLIC4敲低组(shRNA组)剂量存活曲线。

图8显示ROS荧光探针检测实验中CNE-1R、CNE-2R和CNE-1、CNE-2受到辐射(4Gy)后不同时间ROS的变化情况。

图9显示shRNA病毒干扰后，ROS荧光探针检测实验中CNE-1R、CNE-2R、CNE-1、CNE-2的阴性对照组(Negative control组)、CLIC4敲低组(shRNA组)受到辐射(4Gy)后不同时间ROS的变化情况。

具体实施方式

下面结合附图对本发明的具体的实施方案进行详述。除非特别说明，本发明中所涉及的技术手段均为本领域内的技术人员所公知的方法。此外，实施方案应理解为说明性的，而非限制本发明的范围，本发明的实质和范围仅由权利要求书所限定。对于本领域内的技术人员而言，在不违背本发明的实质和范围的前提下，对本发明涉及的试剂进行成分和用量的各种改变或改动也属于本发明的保护范围。本发明所涉及细胞及试剂均在市场上有销售。

实施例1

1)方法

1.1细胞系

人鼻咽癌细胞株(NPC)CNE1、CNE2细胞由复旦大学附属肿瘤医院惠赠。

1.2主要试剂

胎牛血清购于美国Gibco公司；RPMI1640培养基购于美国Gibco公司；FastQuantcDNA第一链合成试剂盒、荧光定量检测试剂盒(SuperReal PreMix(SYBR Green))购于北京天根生物技术有限公司；qRT-PCR的引物由上海赛百盛基因技术有限公司合成，纯化方式为PAGE；CLIC4的siRNA购于广州市锐博生物科技有限公司；β-actin、CLIC4抗体购于Abclonal武汉爱博泰克生物科技有限公司；山羊抗兔IgG(H+L)、山羊抗鼠IgG(H+L)(荧光二抗)购于江苏碧云天生物科技有限公司；预染三色蛋白Marker购于上海翊圣生物技术有限公司；ROS荧光探针DCFH-DA购于江苏碧云天生物科技有限公司。

1.3细胞培养

人鼻咽癌细胞株CNE1、CNE2细胞的培养条件为含有10％胎牛血清的RPMI1640培养基，37℃下在含有5％CO2的培养箱中培养。

1.4建立辐射耐受株

Cs-137γ源(Cs-137,0.73Gy/min)分割照射，分割照射2,2,4,4,4,4,6,6,6,6,8,8Gy累积剂量60Gy。

1.5细胞集落形成实验

每种细胞设置对照组和辐射组(2、4、6Gy)。将处于对数生长期的对照组和辐射组的细胞，胰蛋白酶消化，稀释细胞至适当浓度，加入2ml培养液的6孔培养板中，每组处理均设置3个平行样，放置5％CO

1.6细胞转染

用CLIC4的shRNA病毒转染CNE1、CNE2、CNE1R、CNE2R细胞，获得稳定细胞株。其干扰序列如表3。

表3

1.7 qRT-PCR应用

qRT-PCR检测转染细胞中CLIC4的表达，转染后48h收集各组细胞，利用柱式离心法提取细胞中总RNA，用Nano Vue核酸蛋白检测仪定量检测。RNA样品用逆转录反应合成cDNA后，用SYBR Green PCR试剂盒检测样本中CLIC4含量，其引物序列如表4。反应条件为95℃预变性30s，95℃、5s，55℃、30s；72℃、1min，40个循环，反应结束后得到各个样本CLIC4和内参β-actin的基本循环数(Ct值)。根据公式计算目的基因相对含量，即为CLIC4相对含量，实验重复三次。

表4

1.8 Western blot实验

Western blot检测转染细胞中相关蛋白的表达，收集不同条件处理后的鼻咽癌细胞(NPC、NPC-R)，利用RIPA裂解液(强)提取细胞中总蛋白并进行BCA蛋白定量，然后加入0.25倍体积的5×loading buffer，混匀，煮沸法进行蛋白变性。SDS-PAGE电泳条件：根据蛋白相对分子量的大小配制适宜浓度的分离胶和5％的浓缩胶，每孔加入等量经过变形处理的蛋白样本，样品两侧的孔内加入预染三色蛋白Marker；打开电源，将电压设置到80V恒压，当待测样本的蛋白跑至分离胶时调换至120V，待Marker最下面蓝色条带距离胶底1cm左右，终止电泳。转膜条件：冰水浴，300mA，1～2h(具体时间根据目的蛋白相对分子量大小进行调整)。封闭条件：放入1×TBST配制的封闭液(5％脱脂奶粉)，放置水平摇床上，室温下缓慢晃动2h。一抗孵育条件：按照说明书(1：1000)用一抗稀释液配制相应的一抗孵育液，4℃孵育过夜。二抗孵育：1×TBST清洗三次；按照说明书(1：3000～10000)用1×TBST配制所需体积二抗孵育液，浸没目的条带，放置垂直摇床上，室温下上下缓慢晃动2h。显影：1×TBST清洗三次，按照说明书配制化学发光底物(A液：B液＝1：1)，使其均匀覆盖目的条带膜表面，启动化学发光成像系统，进行显影成像，最终使用Quantity One软件分析所有检测目标条带的灰度值。

1.9细胞内ROS检测实验

细胞接种于96孔板中，完全贴壁后进行4Gy gamma照射。照射后弃去培养基，加入稀释后的DCFH-DA探针溶液，终浓度为3μM。37℃培养箱内孵育30min后，用PBS洗涤细胞，充分去除未进入细胞内的荧光探针。再次加入无血清培养基孵育1.5小时。孵育结束后，采用多功能荧光酶标仪进项细胞内ROS含量测定，读取平均荧光强度。

2)统计学处理

采用SPSS 20.0统计学软件进行分析，论文中的实验结果均为3～5次重复实验的平均值，Student’s-t检验进行统计分析，P＜0.05则认为差异具有统计学意义。

3)

构建鼻咽癌CNE1、CNE2细胞株辐射耐受株后，使用γ源(Cs-137,0.73Gy/min)验证NPC-R辐射敏感性(如图1所示)；由剂量-存活曲线可以看出，CNE1R和CNE2R和其亲本细胞CNE1、CNE2相比，出现明显的辐射抗性。以辐射敏感性较低的细胞株与辐射敏感性较高的细胞株做比对：CNE1R/CNE1,CNE2R/CNE2,对鼻咽癌细胞株TMT检测结果进行生物信息学分析，筛选表达差异在1.5倍以上的蛋白，确定研究目标CLIC4(如表1所示)；

表1显示TMT结果中的CLIC4在CNE-1R、CNE-2R和CNE-1、CNE-2中的表达

利用鼻咽癌临床样本(鼻咽癌放疗敏感、放疗抵抗病人病灶活检组织)的基因表达谱芯片检测结果，查询CLIC4的表达情况，确定CLIC4在放疗抵抗病人中高表达，与鼻咽癌细胞株TMT结果一致(如表2所示)；

表2显示临床基因芯片中的CLIC4在鼻咽癌放疗抵抗组病人样本和鼻咽癌放疗敏感组病人样本中的表达

实验结果表明，CLIC4可以作为鼻咽癌辐射耐受的标志。

实施例2

利用qRT-PCR、Western blot实验检测鼻咽癌细胞株CNE1、CNE2及其辐射耐受株CNE1R、CNE2R中CLIC4表达情况，及经过辐射后CLIC4在细胞株中随时间的变化情况。qRT-PCR、Western blot实验结果显示CNE1R、CNE2R的CLIC4的转录水平与蛋白水平均高于CNE1、CNE2，与TMT和表达谱芯片结果一致(如图2-3所示)，受到4Gy光子照射后，相比于CNE1照后升高的水平,CNE1R的CLIC4持续低表达，CNE2在1小时左右表达明显降低，CNE2R在4小时内表达逐渐降低，最终均维持较低水平(如图4所示)；

实验结果表明，CLIC4的高表达水平与鼻咽癌细胞辐射耐受相关。

实施例3

利用sh-CLIC4病毒对鼻咽癌细胞进行CLIC4敲低实验，利用qRT-PCR、Westernblot实验验证细胞株内CLIC4的敲低水平，获得稳定的CLIC4低表达细胞株(如图5-6所示)，并检测细胞受照后不同时间点的CLIC4蛋白表达含量，实验结果与mRNA水平基本保持一致，获得稳定CLIC4低表达细胞株后，通过细胞集落形成实验，检测癌细胞光子放射敏感性的变化(如图7所示)，实验结果显示，CLIC4表达下调后，癌细胞的光子辐射敏感性明显升高；

表明CLIC4在调控细胞辐射敏感性上能够发挥稳定作用。

实施例4

利用ROS荧光探针实验，通过对鼻咽癌细胞株及CLIC4敲低细胞株受辐射后胞内ROS含量的测定，进一步分析CLIC4对辐射敏感性的影响；。ROS荧光探针实验显示，高表达CLIC4的CNE1R、CNE2R细胞在受到辐射后，ROS水平明显低于CNE1、CNE2细胞(如图8所示)；同时，经过CLIC4敲低后，CNE1 sh-CLIC4、CNE1R sh-CLIC4、CNE2sh-CLIC4、CNE2R sh-CLIC4细胞在受到辐射后，ROS水平明显高于sh-NC细胞(如图9所示)；

上述实验进一步证实了CLIC4通过调控细胞受辐射后胞内ROS含量，降低癌细胞的辐射敏感性。

综上所述，所述的CLIC4及其调控的ROS代谢通路，不仅可以为鼻咽癌的基础研究提供新的思路，还可以为临床鼻咽癌抗辐射耐受药物的研究和筛选提供参考；例如，氯离子通道抑制剂IAA94可以明显抑制ROS的生成，能够明显抑制鼻咽癌细胞的放疗耐受；CLIC4可以用于筛选抑制肿瘤辐射耐受的药物，尤其是抑制鼻咽癌辐射耐受的药物。

序列表

<110> 复旦大学

<120> CLIC4在制备放射治疗鼻咽癌制剂中的应用

<130> 20190709

<160> 7

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 53

<212> DNA

<213> siCLIC4-1

<400> 1

ccgggatggc aatgaaatga cattactcga gtaatgtcat ttcattgcca tct 53

<210> 2

<211> 58

<212> DNA

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<400> 2

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<210> 3

<211> 52

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<400> 3

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<210> 4

<211> 21

<212> DNA

<213> CLIC4 F

<400> 4

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<210> 5

<211> 22

<212> DNA

<213> CLIC4 R

<400> 5

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<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> β-actin F

<400> 6

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<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> β-actin R

<400> 7

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