用于检测免疫抗氧化基因基因多态性的探针、引物、试剂盒

技术领域

本发明涉及分子生物学领域，具体的说涉及用于检测免疫抗氧化基因基因多态性的探针、引物、试剂盒。

背景技术

疾病的两大根源—抗氧化与免疫力，与癌症的有很大的关联；机体的免疫抗氧化功能与基因多态性有关。

肿瘤坏死因子-α(Tumor Necrosis Factor-α，TNF-α)是一种涉及到系统性炎症的细胞因子，主要由巨噬细胞分泌。其主要功能是调节免疫细胞，作为一种内源性致热源，可以导致发热，引起细胞凋亡，阻止肿瘤发生和病毒复制等，在炎症和免疫反应中起着重要的作用。基因变异可导致体内的免疫细胞活性调节能力受损，特异性免疫功能过强，容易导致炎症反应发生，造成强直性脊柱炎等多种炎症发病风险性疾病易感性增高。

细胞毒T淋巴细胞抗原4基因(CTLA4)是免疫球蛋白超家族的成员，CTLA-4蛋白由CTLA-4基因编码，CTLA-4与其配体结合后抑制T细胞激活，使肿瘤细胞免受T淋巴细胞攻击。基因变异导致CTLA4蛋白与B7蛋白分子的结合力下降，使得CTLA4蛋白对免疫信号的下调作用降低，破坏了正常的免疫信号调节，产生1型糖尿病等免疫性疾病。

白细胞介素-3(interleukin-3，IL-3)，又叫多集落刺激因子(multi-CSF)，是白细胞介素家族重要成员之一，主要由激活了的T细胞、巨噬细胞和骨髓基质干细胞产生，通过与其受体—IL-3R结合，在机体的造血调节和免疫调节中发挥重要作用。该基因不但与骨髓功能衰竭等造血细胞疾病相关，而且与多种炎症也相关，如类风湿性关节炎、青少年型皮肤炎等，甚至与精神分裂症也有关系。细基因多态性可能影响个体对炎症的反应，进而影响相关疾病的遗传易感性。

锰超氧化物歧化酶基因(SOD-2)编码锰超氧化物歧化酶(MnSOD)，是体内主要的超氧自由基清除剂，保护细胞免受ROS的损伤。基因变异导致超氧化物歧化酶活性下降，机体抗氧化能力不足，自由基在体内累积，从而影响健康。

针对上述基因多态性检测可作为机体免疫抗氧化功能的评估指标，具有较重要的意义。目前普遍应用的突变检测方法为DNA直接测序法，PCR产物直接进行DNA序列分析，可以明确突变位点，但存在费时费力，成本较昂贵，不适用于对大量样本进行检测等缺点。因此，需要开发一种适合大批量样本检测的方法。

发明内容

本发明的目的首先在于提供用于检测免疫抗氧化基因基因多态性的探针，该探针的序列如SEQ ID NO.:1、SEQ ID NO.:4、SEQ ID NO.:7、或SEQ ID NO.:10所示；

所述的免疫抗氧化基因为TNF-α、CTLA4、IL3、SOD-2基因；

所述的探针两端可以加基团修饰，

其中修饰基团为：5′的修饰基团为荧光基团，如FAM、HEX、ROX、CY5；3′的修饰基团为淬灭基团，如BHQ1、BHQ2；

具体的说，本发明提供的用于检测TNF-α(rs1799724)基因多态性的探针为：SEQIDNO.:1 5′-FAM-CATGGGGACCCCCCCTTAANGAAGACAGGGCCATG-BHQ1-3′；

其中N为变异碱基，具体为C>T；

所述的探针包括环序列和茎序列，其中环序列为第6～30bp(5′-GGACCCCCCCTTAANGAAGACAGGG-3′)，其两侧是两个反向互补的茎序列，茎序列为(5′-CATGG……CCATG-3′)。

本发明提供的用于检测CTLA4(rs231775)基因多态性的探针为：SEQ ID NO.:45′-HEX-CTCAGCTGAACCTGGCTNCCAGGACCTGGCCCTGAG-BHQ1-3′；

其中N为变异碱基，具体为A>G；

所述的探针包括环序列和茎序列，其中环序列为第6～31bp(5′-CTGAACCTGGCTNCCAGGACCTGGCC-3′)，其两侧是两个反向互补的茎序列，茎序列为(5′-CTCAG……CTGAG-3)。

本发明提供的用于检测IL3(rs31480)基因多态性的探针为：SEQ ID NO.:75′-ROX-CCAAGGCGGGAGGNTGTTGCCAACTCTTGG-BHQ2-3′；

其中N为变异碱基，具体为C>T；

所述的探针包括环序列和茎序列，其中环序列为第6～25bp(5′-GCGGGAGGNTGTTGCCAACT-3′)，其两侧是两个反向互补的茎序列，茎序列为(5′-CCAAG……CTTGG-3′)。

本发明提供的用于检测SOD-2(rs4880)基因多态性的探针为：SEQ ID NO.:105′-CY5-CTGGCTCCGGNTTTGGGGTATCTGGGCCAG-BHQ2-3′；

其中N为变异碱基，具体为T>C；

所述的探针包括环序列和茎序列，其中环序列为第6～25bp(5′-TCCGGNTTTGGGGTATCTGG-3′)，其两侧是两个反向互补的茎序列，茎序列为(5′-CTGGC……GCCAG-3′)。

探针的设计原理为：根据TNF-α、CTLA4、IL3、SOD-2分别设计探针和引物，需要保证在退火温度下DNA模板不存在时，探针呈茎环状态。探针所采用的淬灭基团为BHQ1或BHQ2，其淬灭空间范围很小，搭配短发射波长的荧光基团，如HEX，只有当分子信标呈茎环结构时，荧光才会被很好地淬灭。环序列与靶DNA序列互补时，确定最佳PCR引物为40-45bp大小，PCR产物长度设计在130-180bp。

本发明还提供了用于检测免疫抗氧化基因基因多态性的引物，该引物的序列如SEQID NO.:2和3、SEQ ID NO.:5和6、SEQ ID NO.:8和9、SEQ ID NO.:11和12，具体序列如下：

TNF-α(rs1799724)

SEQ ID NO.:2 5′-AGGTGACACTATAGAATA ACCACAGCAATGGGTAGGAG-3′

SEQ ID NO.:3 5′-GCAAGCCCTCACGTAGCGAACCAGTGTGTGGCCATATCTTC-3′

CTLA4(rs231775)

SEQ ID NO.:5 5′-AGGTGACACTATAGAATA ATGGCTTGCCTTGGATTTC-3′

SEQ ID NO.:6 5′-GCAAGCCCTCACGTAGCGAA CCTCCTCCATCTTCATGCTC-3′

IL3(rs31480)

SEQ ID NO.:8 5′-AGGTGACACTATAGAATA TGTGGTTTTCTATGGAGGTTCC-3′

SEQ ID NO.:9 5′-GCAAGCCCTCACGTAGCGAA CTGTCTTGTTCTGGTCCTTCG-3′

SOD-2(rs4880)

SEQ ID NO.:11 5′-AGGTGACACTATAGAATA GGCTGTGCTTTCTCGTCTTC-3′

SEQ ID NO.:12 5′-GCAAGCCCTCACGTAGCGAA ATGATCTGCGCGTTGATGT-3′

本发明还提供了用于检测免疫抗氧化基因基因多态性的试剂盒，该试剂盒包含如上所述的探针和/或引物；

该试剂盒还包含还有Taq酶、dNTP、和/或Mg

本发明还提供一种了用于检测免疫抗氧化基因的方法，该方法包括如下步骤：

(1)采集样本，抽提DNA；

(2)应用上述探针和引物进行荧光定量PCR反应；

(3)应用PCR仪配套软件分析结果，根据扩增曲线，规定合适基线和阈值，基于形成的杂交峰所显示的Tm值差异展现不同的基因型。

其中PCR反应的总体系为15ul(包括PCR Mix 7.5ul、四组正向引物溶液各0.5ul及四组反向引物溶液各0.5ul，4组探针各0.1ul，样本DNA2ul，灭菌重蒸馏水1.1ul)；在荧光定量PCR仪上进行反应，PCR反应条件为92-97℃预变性5-15分钟；92-97℃变性10-30秒，57-65℃退火10-30秒，70-75℃延伸10-30秒，40-50个循环；72℃延伸10分钟；92-97℃变性1分钟，40℃复性1分钟，熔解温度45-80℃过程中实时监测荧光信号，每升温1℃记录5次。

本发明利用一种可以特异识别核酸序列的荧光探针，通过与靶序列进行杂交后发生构象的变化而释放荧光染料，根据杂交后产生不同温度的峰图判定分型结果。在没有靶DNA存在的情况下，荧光基团与淬灭基团可以稳定地结合在一起，检测不到荧光信号；当有靶DNA存在时，荧光标记探针结构被破坏，荧光基团与淬灭基团相互分离，即可检测到荧光信号。该方法与其他遗传分型技术相比，操作简单，2-3小时可以完成多例检测，具有灵敏度高、特异性好、快速、高通量检测等优点，且荧光标记探针可以在不同位点使用不同的荧光基团，可实现多重检测，通过直接探测PCR过程中荧光信号获得检测结果，基因分型清晰，不需要PCR后处理或电泳检测，可实现真正的闭管操作。

附图说明

图1、探针茎环结构示意图

图2、TNF位点的三种峰型(CC型、TT型、CT型)

图3、CTLA4位点的三种峰型(AA型、AG型、GG型)

图4、IL3位点的三种峰型(CC型、CT型、TT型)

图5、SOD-2位点的三种峰型(CC型、CT型、TT型)

图6、多样本的熔解曲线图

具体实施方式

实施例1：探针及引物设计

本发明是针对TNF-α、CTLA4、IL3、SOD-2的SNP位点设计探针及引物序列。具体原理是利用荧光探针与靶序列进行杂交后发生构象的变化而释放荧光染料，根据杂交后产生不同温度的峰图及Tm值判断基因分型结果。在没有靶DNA存在的情况下，荧光基团与淬灭基团可以稳定地结合在一起，检测不到荧光信号；当有靶DNA存在时，荧光标记探针结构被破坏，荧光基团与淬灭基团相互分离，即可检测到荧光信号。

设计探针和引物，实现在退火温度下模板不存在时，探针呈茎环状态。以TNF为例，如图1，包括环序列及其两侧呈反向互补的茎序列，总长度为35bp，其中环序列为25bp(5′-GGACCCCCCCTTAANGAAGACAGGG-3′)，两端各5个碱基构成茎序列；且两端的茎序列正好形成互补；采用的淬灭基团为BHQ1，配短发射波长的荧光基团FAM。环序列与靶DNA序列互补，确定PCR引物为38-40bp大小，PCR产物长度166bp。

TNF(rs1799724)探针和引物序列如下：

SEQ ID NO.:1 5′-FAM-CATGGGGACCCCCCCTTAANGAAGACAGGGCCATG-BHQ1-3′

SEQ ID NO.:2 5′-AGGTGACACTATAGAATA ACCACAGCAATGGGTAGGAG-3′

SEQ ID NO.:3 5′-GCAAGCCCTCACGTAGCGAACCAGTGTGTGGCCATATCTTC-3′

其中N为变异碱基，具体为C>T。

CTLA4(rs231775)探针和引物序列如下：

SEQ ID NO.:4 5′-HEX-CTCAGCTGAACCTGGCTNCCAGGACCTGGCCCTGAG-BHQ1-3′

SEQ ID NO.:5 5′-AGGTGACACTATAGAATA ATGGCTTGCCTTGGATTTC-3′

SEQ ID NO.:6 5′-GCAAGCCCTCACGTAGCGAA CCTCCTCCATCTTCATGCTC-3′

其中N为变异碱基，具体为A>G。

IL3(rs31480)探针和引物序列如下：

SEQ ID NO.:7 5′-ROX-CCAAGGCGGGAGGNTGTTGCCAACTCTTGG-BHQ2-3′

SEQ ID NO.:8 5′-AGGTGACACTATAGAATA TGTGGTTTTCTATGGAGGTTCC-3′

SEQ ID NO.:9 5′-GCAAGCCCTCACGTAGCGAA CTGTCTTGTTCTGGTCCTTCG-3′

其中N为变异碱基，具体为C>T。

SOD-2(rs4880)探针和引物序列如下：

SEQ ID NO.:10 5′-CY5-CTGGCTCCGGNTTTGGGGTATCTGGGCCAG-BHQ2-3′

SEQ ID NO.:11 5′-AGGTGACACTATAGAATA GGCTGTGCTTTCTCGTCTTC-3′

SEQ ID NO.:12 5′-GCAAGCCCTCACGTAGCGAA ATGATCTGCGCGTTGATGT-3′

其中N为变异碱基，具体为T>C。

上述探针和引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

实施例2：检测不同基因型标准品

1、用质粒免疫抗氧化构建并制备含有目的基因TNF、CTLA4、IL3、SOD-2基因位点的野生型标准品质粒和突变型标准品质粒(质粒来源，以及含目的基因质粒的合成由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。通过sanger测序确定序列的准确性，野生型标准品质粒TNF基因型为CC、CTLA4基因型为AA、IL3基因型为CC、SOD-2基因型为TT；突变型标准品质粒TNF基因型为TT、CTLA4基因型为GG、IL3基因型为TT、SOD-2基因型为CC。标准品质粒DNA浓度标化到10ng/ul。

2、采用实施例1中的探针及引物。

3、PCR反应体系：

1)在每一个PCR反应孔中依次加入PCR Mix 7.5ul，4组正向引物溶液0.5uM及4组反向引物溶液各0.5uM，4组探针各0.1uM，然后在4个不同的PCR反应孔中分别加入野生型标准品质粒DNA、突变型标准品质粒DNA、混合型DNA(野生型标准品质粒和突变型标准品质粒按照1:1比例混合)各2ul，用灭菌蒸馏水补足15ul。

2)在荧光定量PCR仪上进行反应，PCR反应条件为95℃预变性5分钟；95℃变性30秒，60℃退火30秒，72℃延伸30秒，45个循环；72℃延伸10分钟；95℃变性1分钟，40℃复性1分钟，熔解温度45-80℃过程中实时监测荧光信号，每升温1℃记录5次。

4、应用PCR仪配套软件SLAN分析结果，基于不同通道形成的杂交峰所显示的Tm值差异展现不同的基因型。TNF位点峰出现在61℃为CC基因型，出现在54℃为TT基因型，两个位置都有峰为CT基因型(图2)。CTLA4位点峰出现在53℃为GG基因型，出现在62℃为AA基因型，两个位置都有峰为AG基因型(图3)。IL3位点峰出现在53℃为TT基因型，出现在62℃为CC基因型，两个位置都有峰为CT基因型(图4)。SOD-2位点峰出现在59℃为TT基因型，出现在66℃为CC基因型，两个位置都有峰为CT基因型(图5)。

实施例3：使用免疫抗氧化检测试剂盒双盲实验考察

1、采用硅胶吸附法抽提75例上海地区健康志愿者口腔上皮细胞基因组DNA，电泳凝胶成像法对DNA的浓度和纯度作检测，待测样本DNA浓度标化到10ng/ul。

2、检测方法如下：在每一个PCR反应孔中依次加入PCR Mix 7.5ul，正向引物溶液各0.5uM及反向引物溶液各0.5uM，探针各0.1uM，同时进行弱阳性对照(TNF基因型为CT、CTLA4基因型为AG、IL3基因型为CT和SOD-2基因型为TT)、阴性对照(TNF基因型为CC、CTLA4基因型为AA、IL3基因型为CC和SOD-2基因型为TT)和待测样本的检测，每个反应孔加入DNA2ul，用灭菌重蒸馏水补足15ul；在荧光定量PCR检测仪上进行反应，PCR反应条件为95℃预变性5分钟；95℃变性30秒，60℃退火30秒，72℃延伸30秒，45个循环；72℃延伸10分钟；95℃变性1分钟，40℃复性1分钟，熔解温度45-80℃过程中实时监测荧光信号，每升温1℃记录5次。

3、应用配套软件分析结果，基于不同通道形成的杂交峰所显示的Tm值差异展现不同的基因型。TNF位点峰出现在61℃为CC基因型，出现在54℃为TT基因型，两个位置都有峰为CT基因型。CTLA4位点峰出现在53℃为GG基因型，出现在62℃为AA基因型，两个位置都有峰为AG基因型。IL3位点峰出现在53℃为TT基因型，出现在62℃为CC基因型，两个位置都有峰为CT基因型。SOD-2位点峰出现在59℃为TT基因型，出现在66℃为CC基因型，两个位置都有峰为CT基因型。如图6所示为多样本的熔解曲线图，分型成功率达到100％。

4、将75例口腔上皮细胞基因组DNA同时进行sanger测序，检测结果与本发明的检测结果完全相符，由此说明，本发明的方法用于免疫抗氧化基因多态性结果准确度高。

序列表

<110> 上海中优精准医疗科技股份有限公司

<120> 用于检测免疫抗氧化基因基因多态性的探针、引物、试剂盒

<160> 12

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> misc_feature

<222> (20)..(20)

<223> n=c或t

<400> 1

catggggacc cccccttaan gaagacaggg ccatg 35

<210> 2

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

aggtgacact atagaataac cacagcaatg ggtaggag 38

<210> 3

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

gcaagccctc acgtagcgaa ccagtgtgtg gccatatctt c 41

<210> 4

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> misc_feature

<222> (18)..(18)

<223> n=a或g

<400> 4

ctcagctgaa cctggctncc aggacctggc cctgag 36

<210> 5

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

aggtgacact atagaataat ggcttgcctt ggatttc 37

<210> 6

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

gcaagccctc acgtagcgaa cctcctccat cttcatgctc 40

<210> 7

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> misc_feature

<222> (14)..(14)

<223> n=c或t

<400> 7

ccaaggcggg aggntgttgc caactcttgg 30

<210> 8

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

aggtgacact atagaatatg tggttttcta tggaggttcc 40

<210> 9

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

gcaagccctc acgtagcgaa ctgtcttgtt ctggtccttc g 41

<210> 10

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> misc_feature

<222> (11)..(11)

<223> n=t或c

<400> 10

ctggctccgg ntttggggta tctgggccag 30

<210> 11

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

aggtgacact atagaatagg ctgtgctttc tcgtcttc 38

<210> 12

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

gcaagccctc acgtagcgaa atgatctgcg cgttgatgt 39