多肽递送组合物

技术领域

本发明涉及用于递送多肽的组合物。

背景技术

为了维持生命活动，体内的各种蛋白质与其它生物聚合物相互作用，例如蛋白质-蛋白质相互作用、蛋白质-RNA相互作用和蛋白质-DNA相互作用，并且在体内的信号转导系统中起重要作用。经常发现特定蛋白质之间的相互作用被异常激活，导致特定疾病的发生并且维持相应的疾病状态。在很多情况下，这些聚合物之间的相互作用是通过蛋白质的特定二级结构例如α-螺旋和β链来进行的。

α-螺旋结构是最为众所周知的蛋白质的二级结构之一，占在球状蛋白质中发现的二级结构的30％以上，并且这些α-螺旋结构在与生物聚合物的相互作用中起到至关重要的作用。此外，由于构成蛋白质的肽具有较短的长度，因此易于化学合成多肽并且容易对其进行操作。此外，由于多肽根据结构和形态而具有特定活性，因此在基于这些特性的自组装纳米结构方面的兴趣增加。因此，可以认为具有上述二级结构的短序列肽作为用于生物学机理研究的有用研究工具或者作为用于治疗疾病的药物具有非常大的潜力。

肽在蛋白质中是稳定的，但是，当从蛋白质中分离并且以肽形式存在时，肽在热力学上是不稳定的，从而例如螺旋结构等二级结构几乎无法保持并且具有无序形式。结果，难以实现对靶点的高亲和性和选择性。因此，为了解决上述问题并且作为可以控制或抑制生物体的各种相互作用的药物来应用，迫切需要制备无论环境如何变化都可以维持肽或自组装肽纳米结构的活化形式和折叠形式的肽并且使其稳定的溶液。

发明内容

本发明的目的在于提供可以通过钉合(stapling)多肽来显著地提高稳定性和功效的用于递送多肽的组合物。

本发明的目的在于提供可以通过钉合多肽来显著地提高稳定性和功效的用于递送多肽的组合物。

1.一种用于递送多肽的组合物，其包含平均孔径为1至100nm的多孔人工伴侣颗粒(porous artificial chaperone particles)。

2.根据上述1的组合物，其中所述颗粒用于钉合负载在其孔内部的多肽。

3.根据上述1的组合物，其中多孔人工伴侣颗粒的平均直径为150至1000nm。

4.根据上述1的组合物，其中多孔人工伴侣颗粒的BET表面积为200至700m

5.根据上述1的组合物，其中多孔人工伴侣颗粒通过如下方法来制备：使具有孔径小于5nm的孔的二氧化硅颗粒与扩张剂在120至180℃下反应24至96小时以使孔径小于5nm的孔扩张；并且将具有扩张的孔的二氧化硅颗粒在400℃以上的温度下煅烧至少3小时。

6.根据上述1的组合物，其中多孔人工伴侣颗粒的特征在于，在下式1中的吸光度比达到1/2时，t为24以上。

[式1]

A

(其中A

使15ml与悬浮液相同的溶剂与渗透膜的外部接触，并且在37℃下以60rpm水平地搅拌渗透膜的内部和外部，

悬浮液的pH为7.4，和

A

7.根据上述1的组合物，其中多孔人工伴侣颗粒在其外表面上具有亲水性取代基并且在孔的内部具有疏水性取代基。

8.根据上述1的组合物，其中多肽为α螺旋多肽或酶多肽。

9.根据上述8的组合物，其中α螺旋多肽为选自由Bcl-2家族蛋白抑制剂、MDM2/MDMX抑制剂、HIV包膜蛋白gp41抑制剂、表皮生长因子受体抑制剂、Kirsten大鼠肉瘤病毒致癌基因同源物(KRAS)抑制剂、Rab(脑内Ras相关(Ras-related in brain))抑制剂、和myoA(疟疾入侵马达肌球蛋白(malaria invasion motor myosin))尾部相互作用蛋白(MTIP)抑制剂组成的组中的至少一种。

10.根据上述8的组合物，其中酶多肽为选自由碳酸酐酶、溶菌酶、胰岛素、BSA、脂肪酶、淀粉酶、胰凝乳蛋白酶、柠檬酸合酶、甲酸脱氢酶、GFP和线粒体苹果酸脱氢酶(mMDH)组成的组中的至少一种。

11.根据上述1的组合物，其中多肽为p53。

12.一种用于递送多肽的组合物，其包含：平均孔径为1至100nm的多孔人工伴侣颗粒；和负载并且钉合在所述颗粒的孔的内部的多肽。

13.根据上述12所述的组合物，其中多孔人工伴侣颗粒的平均直径为150至1000nm。

14.根据上述12所述的组合物，其中多孔人工伴侣颗粒的BET表面积为200至700m

15.根据上述12所述的组合物，其中多孔人工伴侣颗粒通过如下方法来制备：使具有孔径小于5nm的孔的二氧化硅颗粒与扩张剂在120至180℃下反应24至96小时以使孔径小于5nm的孔扩张；并且将具有扩张的孔的二氧化硅颗粒在400℃以上的温度下煅烧至少3小时。

16.根据上述12所述的组合物，其中多孔人工伴侣颗粒的特征在于，在下式1中的吸光度比达到1/2时，t为24以上。

[式1]

A

(其中A

使15ml与悬浮液相同的溶剂与渗透膜的外部接触，并且在37℃下以60rpm水平地搅拌渗透膜的内部和外部，

悬浮液的pH为7.4，和

A

17.根据上述12所述的组合物，其中多孔人工伴侣颗粒在其外表面上具有亲水性取代基并且在孔的内部具有疏水性取代基。

18.根据上述12所述的组合物，其中多肽在孔的内部具有α-螺旋结构。

19.根据上述12所述的组合物，其中多肽为α螺旋多肽或酶多肽。

20.根据上述19的组合物，其中α螺旋多肽为选自由Bcl-2家族蛋白抑制剂、MDM2/MDMX抑制剂、HIV包膜蛋白gp41抑制剂、表皮生长因子受体抑制剂、Kirsten大鼠肉瘤病毒致癌基因同源物(KRAS)抑制剂、Rab(脑内Ras相关)抑制剂、和myoA(疟疾入侵马达肌球蛋白)尾部相互作用蛋白(MTIP)抑制剂组成的组中的至少一种。

21.根据上述19的组合物，其中酶多肽为选自由碳酸酐酶、溶菌酶、胰岛素、BSA、脂肪酶、淀粉酶、胰凝乳蛋白酶、柠檬酸合酶、甲酸脱氢酶、GFP和线粒体苹果酸脱氢酶(mMDH)组成的组中的至少一种。

22.根据上述12所述的组合物，其中所述多肽为p53。

23.用于钉合多肽的方法，其包括：将平均孔径为1至100nm的多孔人工伴侣颗粒和多肽混合以使多肽负载在孔的内部；和将多肽钉合。

本发明可以将多肽钉合以使多肽的无规卷曲的三级结构固定为稳定的α-螺旋结构，从而显著地提高多肽的稳定性和功效。

附图说明

图1为根据本发明的一个实施方案的基于多孔纳米颗粒的人工伴侣(ACPN；下文中也称为“多孔人工伴侣颗粒”)的显微照片。

图2为根据本发明的一个实施方案的多孔人工伴侣颗粒的显微照片。

图3为根据本发明的一个实施方案的多孔人工伴侣颗粒的制造过程中的小孔颗粒的显微照片。

图4为根据本发明的一个实施方案的小孔颗粒的显微照片。

图5为根据本发明的一个实施方案的各孔径的多孔人工伴侣颗粒的显微照片。可降解的递送载体(Degradable Delivery Vehicle(DDV))为根据实施方案的颗粒，其中括号中的数字意指颗粒的直径并且下标的数字意指孔径。例如，DDV(200)

图6为鉴定根据本发明的一个实施方案的多孔人工伴侣颗粒的生物降解性的显微照片。

图7为示出根据一个说明性实例的具有圆筒状渗透膜的管的视图。

图8为示出根据本发明的一个实施方案的多孔人工伴侣颗粒的吸光度随时间降低的结果的图。

图9为示出根据本发明的一个实施方案的各粒径的多孔人工伴侣颗粒的吸光度随时间降低的结果的图。

图10为示出根据本发明的一个实施方案的各孔径的多孔人工伴侣颗粒的吸光度随时间降低的结果的图。

图11为示出根据本发明的一个实施方案的多孔人工伴侣颗粒的吸光度针对环境的每种pH随时间降低的结果的图。

图12为示出根据本发明的一个实施方案的多孔人工伴侣颗粒的吸光度随时间降低的结果的图。

图13为示意性地示出将多肽钉合至多孔人工伴侣颗粒的图。一旦使多肽负载至多孔人工伴侣颗粒的内部时，就会进行点击反应(click reaction)，由此将多肽钉合以形成不可逆的α螺旋结构。

图14为示出根据本发明的一个实施方案的多孔人工伴侣颗粒的设计和特性的图。具体地，(a)为多孔人工伴侣颗粒的设计图。短的聚乙二醇部分缀合在外表面。将羟基、丙基和辛基引入至内表面。(b)为包封在多孔人工伴侣颗粒中的尼罗红的荧光光谱(λex＝510nm)。(c)示出ACPN-C8和ACPN-C8@p53的TEM图像(比例尺，200nm)。(d)示出ACPN-C8和ACPN-C8@p53的DLS数据。

图15为示出当p53负载在根据本发明的一个实施方案的多孔人工伴侣颗粒上时的α螺旋值(α-螺旋度(helicity))的表。这是使用CONTIN程序方法基于CD光谱来计算的。

图16为示出当p53负载在根据本发明的一个实施方案的多孔人工伴侣颗粒上时的细胞实验和细胞死亡结果的图。

具体地，(a)为显示经点击的p53(clicked p53)自身和ACPN-C8@点击的p53被吸收至Hela细胞中的明视野图像和荧光图像(bar＝25μm)。(b)示出各种浓度的ACPN-C8@点击的p53和比较组对HeLa细胞的细胞毒性。(c)示出各种浓度的ACPN@点击的p53对HeLa细胞的细胞毒性。通过对数曲线拟合法来收集ACPN@点击的p53的EC50值。(d)示出ACPN-C8@点击的p53的相对半胱天冬酶-3活性。

图17为示出当p53负载在根据本发明的一个实施方案的多孔人工伴侣颗粒上时的体内实验的结果的图。具体地，(a)示出以5天的间隔引入有TAMRA标记的ACPN-C8@点击的p53的肿瘤异种移植小鼠(tumor xenograft mice)和比较组的时间依赖性的相对肿瘤体积(N＝4)。(b)示出引入有TAMRA标记的ACPN-C8@点击的p53的肿瘤异种移植小鼠和比较组的时间依赖性的全身荧光图像(N＝4)(绿色：经点击的p53，红色：ACPN-C8)。(c)示出经点击的p53的时间依赖性的相对FAM荧光强度，其中该强度通过基于肿瘤异种移植小鼠的全身荧光图像的ROI分析来获得。

图18为示出ACPN-C8@点击的p53的多肽释放评价的结果的图。

具体实施方式

下文中，将详细描述本发明。

本发明提供包含平均孔径为1至100nm的多孔人工伴侣颗粒的用于递送多肽的组合物。

本发明的多孔人工伴侣颗粒具有纳米尺寸的孔，并且可以在颗粒的外表面上和/或孔的内部携带多肽。

多肽(蛋白质)不仅包括化学合成的多肽还包括由所培养的细胞的基因编码的天然合成的多肽、以及由细胞分泌的重组多肽。重组多肽可以指肽、多肽、寡肽和/或融合多肽、以及由编码氨基酸的重组遗传物质表达的任何多肽或其生物活性部分(例如，保留整个多肽的生物活性的部分)。重组多肽产品可以包括治疗性产品、预防性产品或诊断性产品。

在本发明中，将多肽钉合意指使无规卷曲结构变为α螺旋并且保持该结构。

当作为药物的多肽的结构无序度(structural disorder)较高时，三维结构不固定。因此，要与其结合的蛋白质难以识别该三维结构，从而使作为药物的蛋白质的性能降低。

对于本发明的组合物，纳米颗粒起到伴侣颗粒的作用以使多肽的三级结构稳定，并且还参与肽的点击-钉合(click-stapling)从而不可逆地保持多肽的α-螺旋。此外，多个孔可以携带要递送的目标肽，从而使无规卷曲的三级结构具有稳定的α-螺旋结构。因此，可以使多肽的功效最大化。

在本发明中，能够将多肽钉合，并且可以无限制地应用，只要多肽的三维结构可能不稳定即可，并且多肽的具体实例可以包括例如α螺旋多肽或酶多肽。

α螺旋多肽是指通过借助体内的若干多肽-多肽相互作用使α-螺旋基序结合至疏水性口袋而形成的具有α-螺旋基序的多肽。本发明的α螺旋多肽可以具有此类基序或模拟基序(mimic motif)。例如，上述α螺旋多肽可以包括Bcl-2家族蛋白抑制剂、MDM2/MDMX抑制剂、HIV包膜蛋白gp41抑制剂、表皮生长因子受体抑制剂、Kirsten大鼠肉瘤病毒致癌基因同源物(KRAS)抑制剂、Rab(脑内Ras相关)抑制剂、和myoA(疟疾入侵马达肌球蛋白)尾部相互作用蛋白(MTIP)抑制剂等，更具体为p53，但是不限于此。

通过携带非天然蛋白质能够将酶多肽钉合至天然蛋白质中，并且酶多肽可以包括例如碳酸酐酶、溶菌酶、胰岛素、BSA、脂肪酶、淀粉酶、胰凝乳蛋白酶、柠檬酸合酶、甲酸脱氢酶、GFP、和线粒体苹果酸脱氢酶(mMDH)等，但是不限于此。

本发明的组合物可以用于将所负载的多肽递送至个体，即，对象(subject)。在这一点上，本文中使用的多肽可以包括任一种，只要其具有源自与要递送的对象相同的种属的序列、或者即使多肽源自其它种属但是适用于相应的对象即可。

本发明的多孔人工伴侣颗粒是可生物降解的颗粒。在此类情况下，当伴侣颗粒携带多肽并且被给予至体内时，伴侣颗粒会被生物降解以释放多肽。本发明的多孔人工伴侣颗粒可以在体内缓慢地降解以使所负载的多肽以持续的方式释放。例如，在下式1中的吸光度比达到1/2时，t为24以上。

[式1]

A

(其中A

使15ml与悬浮液相同的溶剂与渗透膜的外部接触，并且在37℃下以60rpm水平地搅拌渗透膜的内部和外部，

悬浮液的pH为7.4，和

A

上式1意指多孔人工伴侣颗粒在类似于体内的环境中降解的速率。

如图7中所示，例如，可以在将多孔人工伴侣颗粒和悬浮液置于圆筒状渗透膜中并且还将相同的悬浮液置于渗透膜的外部之后测量上式1中的吸光度A

本发明的多孔人工伴侣颗粒是可生物降解的，并且可以在悬浮液中缓慢地降解。50kDa的直径相当于约5nm，其允许可生物降解的多孔人工伴侣颗粒通过直径为50kDa的渗透膜，并且以60rpm水平搅拌圆筒状渗透膜以将悬浮液均匀地混合，以使降解的多孔人工伴侣颗粒可以从渗透膜中出来。

可以例如在其中用新的悬浮液替换渗透膜外部的悬浮液的环境下测量上式1中的吸光度。悬浮液可以连续替换或者每周期替换，其中所述周期是定期的或不规律的。例如，可以在1小时至1周的范围内以1小时间隔、2小时间隔、3小时间隔、6小时间隔、12小时间隔、24小时间隔、2天间隔、3天间隔、4天间隔、7天间隔等替换悬浮液，但是不限于此。

吸光度比为1/2意味着在t小时后吸光度为初始吸光度的一半，即，意味着约一半的多孔人工伴侣颗粒被降解。

悬浮液可以是缓冲溶液，例如，选自由磷酸盐缓冲盐水(PBS)和模拟体液(SBF)组成的组中的至少一种，并且更具体地为PBS。

在吸光度比达到1/2时，本发明的上式1中的t可以为24以上，例如，t可以为24至120。即，t可以为在上述范围内的24至96、24至72、30至70、40至70、50至65等，但是不限于此。

对于本发明的多孔人工伴侣颗粒，在上式1中的吸光度比达到1/5时，t可以为70至140。例如，t可以为在上述范围内的80至140、80至120、80至110、70至140、70至120、70至110等，但是不限于此。

对于本发明的多孔人工伴侣颗粒，在上式1中的吸光度比达到1/20时，t可以为130至220。例如，t可以为在上述范围内的130至200、140至200、140至180、150至180等，但是不限于此。

对于本发明的多孔人工伴侣颗粒，在上式1中的吸光度比达到0.01以下时，t可以为250以上。例如，t可以为300以上、350以上、400以上、500以上、1000以上等，并且上限可以为2000，但是不限于此。

对于本发明的多孔人工伴侣颗粒，上式1中的吸光度比与t具有高的正相关性。例如，皮尔森相关系数可以为0.8以上，例如0.9以上和0.95以上。

上式1中的t意味着多孔人工伴侣颗粒在类似于体内的环境下降解的速度。即，可以通过调整例如多孔人工伴侣颗粒的表面积、粒径、孔径、在颗粒的表面上和/或孔的内部的取代基、和表面的致密性等来调节t。

例如，可以增加颗粒的表面积来使t减小，或者可以减小表面积来使t增大。可以通过调整颗粒的粒径和孔径来调节表面积。此外，如果通过使取代基处于颗粒的表面上和/或孔的内部来减少多孔人工伴侣颗粒对环境(例如溶剂)的直接暴露，则可以使t增大。此外，当多孔人工伴侣颗粒负载或携带多肽并且增加多肽与多孔人工伴侣颗粒之间的亲和性时，可以减少多孔人工伴侣颗粒对环境的直接暴露，从而使t增大。此外，可以通过制备具有更致密的表面的颗粒来使t增大。如上所述，已描述了调整上式1中的t的各种实例，但是不限于此。

本发明的多孔人工伴侣颗粒可以具有球形形状，但是不限于此。

本发明的多孔人工伴侣颗粒的平均直径可以为例如150至1000nm。例如，平均直径可以为在上述范围内的150至800nm、150至500nm、150至400nm、150至300nm、和150至200nm等，但是不限于此。

本发明的多孔人工伴侣颗粒的平均孔径可以为例如1至100nm。例如，平均直径可以为在上述范围内的5至100nm、7至100nm、7至50nm、10至50nm、10至30nm、7至30nm等，但是不限于此。具有如上所述的较大直径的伴侣颗粒可以携带大量的多肽，并且还可以携带大尺寸的多肽。

本发明的多孔人工伴侣颗粒的BET表面积可以为例如200至700m

本发明的多孔二氧化硅纳米颗粒的每克的体积可以为例如0.7至2.2ml。例如，该体积可以为在上述范围内的0.7至2.0ml、0.8至2.2ml、0.8至2.0ml、0.9至2.0ml、1.0至2.0ml等，但是不限于此。如果每克的体积过小，则降解速率可能会过高。此外，难以制造过大的颗粒或具有完整形状的颗粒。

本发明的多孔人工伴侣颗粒可以在其外表面上和/或孔的内部具有亲水性取代基和/或疏水性取代基。例如，仅亲水性取代基或仅疏水性取代基可以存在于颗粒的表面和孔的内部二者，亲水性取代基或疏水性取代基可以存在于颗粒的表面或孔的内部，或者亲水性取代基可以存在于颗粒的表面上而疏水性取代基可以存在于孔的内部，反之亦然。

负载在根据本发明的多孔人工伴侣颗粒上的多肽的释放主要通过纳米颗粒的降解来进行。具体地，调整多孔人工伴侣颗粒与多肽的释放环境的相互作用以调节纳米颗粒的降解速率，从而可以调节多肽的释放速率。此外，多肽可以从纳米颗粒中扩散和释放，其中调整取代基可以调节多肽与纳米颗粒的结合力，从而控制多肽的释放。

此外，为了增加多孔人工伴侣颗粒与难溶性(疏水性)多肽的结合力，可以使疏水性取代基存在于颗粒的孔内部。此外，在容易使用和配制的方面，还可以对颗粒的表面进行处理以具有亲水性取代基。

具体地，多孔人工伴侣颗粒可以在颗粒的表面上具有亲水性取代基并且在孔的内部具有疏水性取代基。从优异的分散性和所携带的多肽的观点，此类多孔人工伴侣颗粒是优选的。

亲水性取代基可以包括例如羟基、羧基、氨基、羰基、巯基、磷酸基、硫醇基、铵基、酯基、酰亚胺基、硫代酰亚胺基、酮基、醚基、茚基、磺酰基、和聚乙二醇基等。此外，疏水性取代基可以包括例如取代或未取代的C1至C30烷基、取代或未取代的C3至C30环烷基、取代或未取代的C6至C30芳基、取代或未取代的C2至C30杂芳基、卤素基团、C1至C30酯基、和含卤素基团等。

此外，本发明的多孔人工伴侣颗粒可以在颗粒的外表面和/或孔的内部带正电荷和/或带负电荷。例如，颗粒的表面和孔的内部二者均可以带正电荷或带负电荷，并且仅颗粒的表面或孔的内部可以带正电荷或带负电荷。可选地，颗粒的表面可以带正电荷而孔的内部可以带负电荷，反之亦然。

可以例如借助阳离子取代基或阴离子取代基的存在来进行带电荷。

阳离子物质可以包括例如氨基或任何其它含氮基团。此外，阴离子取代基可以包括例如作为酸性基团的羧基(-COOH)、磺酸基(-SO

同样地，当通过调整取代基借助带电荷来调节多孔人工伴侣颗粒与多肽的释放环境的相互作用时，可以调节纳米颗粒的降解速率以控制多肽的释放速率。此外，多肽可以从纳米颗粒中扩散和释放。在这一点上，调整取代基可以调节多肽与纳米颗粒的结合力，从而控制多肽的释放。

此外，本发明的多孔人工伴侣颗粒可以包含取代基用于以下目的：在颗粒的表面上和/或孔的内部负载多肽；将多肽递送至靶细胞中；负载其它物质用于其它目的；或者结合其它取代基。此外，多孔人工伴侣颗粒还可以包括与其结合的抗体、配体、细胞穿膜肽(cell permeable peptide)或适体。

可以通过例如表面修饰来添加上述在颗粒的表面上和/或孔的内部的取代基、电荷、粘合剂等。

可以例如通过使具有要引入的取代基的化合物与颗粒反应来进行表面修饰，其中该化合物可以为例如具有C1至C10烷氧基的烷氧基硅烷，但是不限于此。烷氧基硅烷具有一个或多个烷氧基，例如，1至3个烷氧基。此外，可以存在要引入至未键合有烷氧基的部位的取代基、或被烷氧基取代的取代基。

本发明的多孔人工伴侣颗粒可以例如通过小孔颗粒制备和孔扩张工序来制造，并且，如果需要，可以进一步通过煅烧或表面修饰工序等来制造。如果实施煅烧和表面修饰工序二者，则可以在煅烧后对颗粒进行表面修饰。

小孔颗粒可以为例如平均孔径为1至5nm的颗粒。

可以通过在溶剂中添加表面活性剂和二氧化硅前体、然后进行搅拌和均匀化来收获小孔颗粒。

溶剂可以为水和/或有机溶剂，并且有机溶剂可以包括例如：醚类，例如1,4-二噁烷(特别是环醚)；卤代烃类，例如氯仿、二氯甲烷、四氯化碳、1,2-二氯乙烷、二氯乙烯、三氯乙烯、全氯乙烯、二氯丙烷、戊基氯、1,2-二溴乙烷等；酮类，例如丙酮、甲基异丁基酮、γ-丁内酯、1,3-二甲基-咪唑啉酮、甲基乙基酮、环己酮、环戊酮、4-羟基-4-甲基-2-戊酮等；芳香族碳基材料，例如苯、甲苯、二甲苯、四甲基苯等；烷基酰胺，例如N,N-二甲基甲酰胺、N,N-二丁基甲酰胺、N,N-二甲基乙酰胺、N-甲基吡咯烷酮等；醇类，例如甲醇、乙醇、丙醇、丁醇等；二醇醚类(溶纤剂类)，例如乙二醇单乙醚、乙二醇单甲醚、乙二醇单丁醚、二甘醇单乙醚、二甘醇单甲醚、二甘醇单丁醚、丙二醇单甲醚、丙二醇单乙醚、二丙二醇二乙醚、三甘醇单乙醚等；其它，例如二甲基乙酰胺(DMAc)、N,N-二乙基乙酰胺、二甲基甲酰胺(DMF)、二乙基甲酰胺(DEF)、N,N-二甲基乙酰胺(DMAc)、N-甲基吡咯烷酮(NMP)、N-乙基吡咯烷酮(NEP)、1,3-二甲基-2-咪唑啉酮、N,N-二甲基甲氧基乙酰胺、二甲亚砜、吡啶、二甲砜、六甲基膦酰胺、四甲基脲、N-甲基己内酰胺、四氢呋喃、间二噁烷、对二噁烷、和1,2-二甲氧基乙烷等。具体地，可以使用醇，更具体地为甲醇，但是不限于此。

当使用水和有机溶剂的混合溶剂时，水与有机溶剂的相对比例可以为例如以体积比计为1:0.7至1.5，例如，1:0.8至1.3，但是不限于此。

表面活性剂可以包括例如鲸蜡基三甲基溴化铵(CTAB)、十六烷基三甲基溴化铵(TMABr)、十六烷基三甲基氯化吡啶鎓(TMPrCl)、四甲基氯化铵(TMACl)等，并且具体地，可以使用CTAB。

可以例如以每1升溶剂1至10g例如1至8g、2至8g或3至8g的量添加表面活性剂，但是不限于此。

在将表面活性剂添加至溶剂中的情况下，可以在搅拌后添加二氧化硅前体。二氧化硅前体可以为例如原硅酸四甲酯(TMOS)，但是不限于此。

搅拌可以进行例如10至30分钟，但是不限于此。

可以以每1升溶剂0.5至5ml，例如，在上述范围内的0.5ml至4ml、0.5至3ml、0.5至2ml、1至2ml等的量添加二氧化硅前体，但是不限于此。

如果需要，可以进一步使用氢氧化钠作为催化剂，具体地，可以在向溶剂中添加表面活性剂之后并且在向溶剂中添加二氧化硅前体之前在搅拌下添加。

可以基于1M氢氧化钠水溶液以每1升溶剂0.5至8ml，例如，在上述范围内的0.5至5ml、0.5至4ml、1至4ml、1至3ml、2至3ml等的量添加氢氧化钠，但是不限于此。

在添加二氧化硅前体之后，可以使溶液在搅拌下反应。搅拌可以进行2至15小时，例如，在上述范围内的3至15小时、4至15小时、4至13小时、5至12小时、6至12小时、6至10小时等，但是不限于此。如果搅拌时间(反应时间)过短，则成核(nucleation)可能不充分。

搅拌后，可以使溶液老化。老化可以进行8至24小时，例如，在上述范围内的8至20小时、8至18小时、8至16小时、8至14小时、10至16小时、10至14小时等，但是不限于此。

此后，可以将反应产物清洗并且干燥以收获多孔人工伴侣颗粒，并且，如果需要，可以在清洗前进行未反应的材料的分离。

可以通过例如借助离心将上清液分离来进行未反应的材料的分离。例如，可以以6,000至10,000rpm进行离心，并且离心时间可以为3至60分钟，例如，在上述范围内的3至30分钟、3至30分钟、5至30分钟等，但是不限于此。

可以用水和/或有机溶剂进行清洗。具体地，由于不同的物质溶解于不同的溶剂中，因此水和有机溶剂可以交替使用一次或数次，或者可以单独用水或有机溶剂进行清洗一次或数次。上述数次可以为2次以上且10次以下，例如，3次以上且10次以下、4次以上且8次以下、4次以上且6次以下。

有机溶剂可以包括例如：醚类，例如1,4-二噁烷(特别是环醚)；卤代烃类，例如氯仿、二氯甲烷、四氯化碳、1,2-二氯乙烷、二氯乙烯、三氯乙烯、全氯乙烯、二氯丙烷、戊基氯、1,2-二溴乙烷等；酮类，例如丙酮、甲基异丁基酮、γ-丁内酯、1,3-二甲基-咪唑啉酮、甲基乙基酮、环己酮、环戊酮、4-羟基-4-甲基-2-戊酮等；芳香族碳基材料，例如苯、甲苯、二甲苯、四甲基苯等；烷基酰胺，例如N,N-二甲基甲酰胺、N,N-二丁基甲酰胺、N,N-二甲基乙酰胺、N-甲基吡咯烷酮等；醇类，例如甲醇、乙醇、丙醇、丁醇等；二醇醚类(溶纤剂类)，例如乙二醇单乙醚、乙二醇单甲醚、乙二醇单丁醚、二甘醇单乙醚、二甘醇单甲醚、二甘醇单丁醚、丙二醇单甲醚、丙二醇单乙醚、二丙二醇二乙醚、三甘醇单乙醚等；其它，例如二甲基乙酰胺(DMAc)、N,N-二乙基乙酰胺、二甲基甲酰胺(DMF)、二乙基甲酰胺(DEF)、N,N-二甲基乙酰胺(DMAc)、N-甲基吡咯烷酮(NMP)、N-乙基吡咯烷酮(NEP)、1,3-二甲基-2-咪唑啉酮、N,N-二甲基甲氧基乙酰胺、二甲亚砜、吡啶、二甲砜、六甲基膦酰胺、四甲基脲、N-甲基己内酰胺、四氢呋喃、间二噁烷、对二噁烷、和1,2-二甲氧基乙烷等。具体地，可以使用醇，更具体地为甲醇，但是不限于此。

可以在例如以6,000至10,000rpm进行的离心下进行清洗，并且离心时间可以为3至60分钟，例如，在上述范围内的3至30分钟、3至30分钟、5至30分钟等，但是不限于此。

可选地，可以在不离心的情况下通过使颗粒通过过滤器滤出来进行清洗。过滤器可以具有尺寸小于或等于多孔人工伴侣颗粒的直径的孔。当用如上所述的此类过滤器来过滤反应溶液时，只有颗粒保留在过滤器上，所述颗粒可以通过在过滤器上倒水和/或有机溶剂来清洗。

在清洗中，水和有机溶剂可以交替使用一次或数次，或者可以单独用水或有机溶剂进行清洗一次或数次。上述数次可以为2次以上且10次以下，例如，3次以上且10次以下、4次以上且8次以下、4次以上且6次以下。

可以例如在20至100℃下进行干燥，但是不限于此，并且还可以在真空状态下进行干燥。

此后，可以使收获的多孔人工伴侣颗粒的孔扩张，并且此类孔扩张可以使用孔扩张剂来进行。

孔扩张剂可以包括例如三甲基苯、三乙基苯、三丙基苯、三丁基苯、三戊基苯、三己基苯、甲苯、苯等，并且具体地，可以使用三甲基苯，但是不限于此。

此外，本文中使用的孔扩张剂可以为例如N,N-二甲基十六烷基胺(DMHA)，但是不限于此。

可以例如通过使多孔人工伴侣颗粒与孔扩张剂在溶剂中混合并且加热混合物以诱导反应来进行孔扩张。

溶剂可以为水和/或有机溶剂，并且有机溶剂可以包括例如：醚类，例如1,4-二噁烷(特别是环醚)；卤代烃类，例如氯仿、二氯甲烷、四氯化碳、1,2-二氯乙烷、二氯乙烯、三氯乙烯、全氯乙烯、二氯丙烷、戊基氯、1,2-二溴乙烷等；酮类，例如丙酮、甲基异丁基酮、环己酮等；芳香族碳基材料，例如苯、甲苯、二甲苯等；烷基酰胺，例如N,N-二甲基甲酰胺、N,N-二丁基甲酰胺、N,N-二甲基乙酰胺、N-甲基吡咯烷酮等；醇类，例如甲醇、乙醇、丙醇、和丁醇等。具体地，可以使用醇，更具体地为甲醇，但是不限于此。

可以以每1升溶剂10至200g，例如，在上述范围内的10至150g、10至100g、30至100g、40至100g、50至100g、50至80g、60至80g等的比例添加多孔人工伴侣颗粒，但是不限于此。

可以将多孔人工伴侣颗粒均匀地分散在溶剂中。例如，可以将多孔人工伴侣颗粒添加至溶剂中并且进行超声分散。在使用混合溶剂的情况下，可以将多孔人工伴侣颗粒分散在第一溶剂中，然后向其中添加第二溶剂。

可以以相对于100体积份溶剂为10至200体积份，例如，在上述范围内的10至150体积份、10至100体积份、10至80体积份、30至80体积份、30至70体积份等的比例添加孔扩张剂，但是不限于此。

反应可以在120至190℃，例如，在上述范围内的120至190℃、120至180℃、120至170℃、130至170℃、130至160℃、130至150℃、130至140℃等下进行，但是不限于此。

反应可以进行6至96小时，例如，在上述范围内的30至96小时、30至96小时、30至80小时、30至72小时、24至80小时、24至72小时、36至96小时、36至80小时、36至72小时、36至66小时、36至60小时、48至96小时、48至88小时、48至80小时、48至72小时、6至96小时、7至96小时、8至80小时、9至72小时、9至80小时、6至72小时、9至96小时、10至80小时、10至72小时、12至66小时、13至60小时、14至96小时、15至88小时、16至80小时、17至72小时等，但是不限于此。

可以在以上示例的范围内根据期望调整时间和温度，从而可以使反应充分地进行但不会过度进行。例如，当使反应温度降低时，可以增加反应时间，并且当使反应温度提高时，可以缩短反应时间。如果反应没有充分地进行，则孔扩张可能不充分。另一方面，如果反应过度进行，则颗粒可能会由于孔的过度扩张而塌陷。

反应可以例如通过逐渐升高温度来进行。具体地，可以通过将温度以0.5至15℃/min的速率从室温逐渐升高至以上限定的温度来进行反应。例如，可以使温度以1至15℃/min、3至15℃/min、3至12℃/min、3至10℃/min等的速率升高，但是不限于此。

反应可以在搅拌下进行。例如，可以以100rpm以上的速度，具体地，以100至1000rpm的速度进行搅拌，但是不限于此。

反应后，可以例如通过逐渐降低温度来使反应溶液缓慢地冷却。具体地，可以通过将温度以0.5至20℃/min的速率从以上限定的温度逐渐降低至室温来进行反应。例如，可以使温度以在上述范围内的1至20℃/min、3至20℃/min、3至12℃/min、3至10℃/min等的速率降低，但是不限于此。

冷却后，可以将反应产物清洗并且干燥以收获具有扩张的孔的多孔人工伴侣颗粒。如果需要，可以在清洗前首先分离未反应的材料。

可以通过例如借助离心将上清液分离来进行未反应的材料的分离。本文中，可以例如以6,000至10,000rpm进行离心，并且离心时间可以为3分钟至60分钟。例如，离心可以进行在上述范围内的3至30分钟、3至30分钟、5至30分钟等，但是不限于此。

可以用水和/或有机溶剂进行清洗。具体地，由于不同的物质溶解于不同的溶剂中，因此水和有机溶剂可以交替使用一次或数次，或者可以单独用水或有机溶剂进行清洗一次或数次。上述数次可以为2次以上且10次以下，例如，3次、4次、5次、6次、7次、8次等。

有机溶剂可以包括例如：醚类，例如1,4-二噁烷(特别是环醚)；卤代烃类，例如氯仿、二氯甲烷、四氯化碳、1,2-二氯乙烷、二氯乙烯、三氯乙烯、全氯乙烯、二氯丙烷、戊基氯、1,2-二溴乙烷等；酮类，例如丙酮、甲基异丁基酮、环己酮等；芳香族碳基材料，例如苯、甲苯、二甲苯等；烷基酰胺，例如N,N-二甲基甲酰胺、N,N-二丁基甲酰胺、N,N-二甲基乙酰胺、N-甲基吡咯烷酮等；醇类，例如甲醇、乙醇、丙醇、和丁醇等。具体地，可以使用醇，更具体地为甲醇，但是不限于此。

可以在例如以6,000至10,000rpm进行的离心下进行清洗，并且离心时间可以为3至60分钟，例如，在上述范围内的3至30分钟、3至30分钟、5至30分钟等，但是不限于此。

可选地，可以在不离心的情况下通过使颗粒通过过滤器滤出来进行清洗。过滤器可以具有尺寸小于或等于多孔人工伴侣颗粒的直径的孔。当用如上所述的此类过滤器来过滤反应溶液时，只有颗粒保留在过滤器上，所述颗粒可以通过在过滤器上倒水和/或有机溶剂来清洗。

在清洗中，水和有机溶剂可以交替使用一次或数次，或者可以单独用水或有机溶剂进行清洗一次或数次。上述数次可以为2次以上且10次以下，例如，3次以上且10次以下、4次以上且8次以下、4次以上且6次以下。

可以例如在20至100℃下进行干燥，但是不限于此，并且还可以在真空状态下进行干燥。

此后，可以对收获的颗粒进行煅烧，其为加热颗粒以除去存在于颗粒的表面上和孔的内部的硅烷醇基从而降低颗粒的反应性、提供更致密的结构并且除去填充孔的有机物质的工序。例如，可以将颗粒加热至400℃以上的温度。对温度的上限没有特别限制，但是可以为1000℃、900℃、800℃、700℃等。加热可以进行例如3小时以上。对加热时间的上限没有特别限制，并且可以为24小时、12小时、10小时、8小时、6小时等。更具体地，加热可以在400至700℃下进行3至8小时或者在500至600℃下进行4至5小时，但是不限于此。

除去填充孔的有机物质可以防止由残留的有机物质导致的细胞毒性或起泡的一些问题。

然后，可以对收获的多孔人工伴侣颗粒进行表面修饰，并且可以在颗粒的表面上和/或孔的内部进行表面修饰。颗粒表面和孔的内部二者可以以相同的方式进行表面修饰，或者可以以不同的方式进行表面修饰。

通过表面修饰可以使颗粒带电荷或具有亲水性和/或疏水性。

更具体地，为了有效地负载多肽，可以通过具有选自由氨基、氨基烷基、烷基氨基、含有氮原子的杂环芳香族化合物基团、氰基和胍基组成的组中的至少一种取代基来进行多孔人工伴侣颗粒的表面修饰。

可以例如通过使具有要引入的亲水性取代基、疏水性取代基、阳离子取代基或阴离子取代基的化合物与颗粒反应来进行表面修饰，其中该化合物可以为例如具有C1至C10烷氧基的烷氧基硅烷，但是不限于此。

烷氧基硅烷具有一个或多个烷氧基，例如，1至3个烷氧基。此外，可以存在要引入至未键合有烷氧基的部位的取代基、或被烷氧基取代的取代基。

当烷氧基硅烷与多孔人工伴侣颗粒反应时，在硅原子和氧原子之间形成共价键以使烷氧基硅烷可以键合至多孔人工伴侣颗粒的表面和/或孔的内部。由于烷氧基硅烷具有要引入的取代基，因此可以将相应的取代基引入至多孔人工伴侣颗粒的表面和/或孔的内部。

反应可以通过使分散在溶剂中的多孔人工伴侣颗粒与烷氧基硅烷反应来进行。

溶剂可以为水和/或有机溶剂，并且有机溶剂可以包括例如：醚类，例如1,4-二噁烷(特别是环醚)；卤代烃类，例如氯仿、二氯甲烷、四氯化碳、1,2-二氯乙烷、二氯乙烯、三氯乙烯、全氯乙烯、二氯丙烷、戊基氯、1,2-二溴乙烷等；酮类，例如丙酮、甲基异丁基酮、γ-丁内酯、1,3-二甲基-咪唑啉酮、甲基乙基酮、环己酮、环戊酮、4-羟基-4-甲基-2-戊酮等；芳香族碳基材料，例如苯、甲苯、二甲苯、四甲基苯等；烷基酰胺，例如N,N-二甲基甲酰胺、N,N-二丁基甲酰胺、N,N-二甲基乙酰胺、N-甲基吡咯烷酮等；醇类，例如甲醇、乙醇、丙醇、丁醇等；二醇醚类(溶纤剂类)，例如乙二醇单乙醚、乙二醇单甲醚、乙二醇单丁醚、二甘醇单乙醚、二甘醇单甲醚、二甘醇单丁醚、丙二醇单甲醚、丙二醇单乙醚、二丙二醇二乙醚、三甘醇单乙醚等；其它，例如二甲基乙酰胺(DMAc)、N,N-二乙基乙酰胺、二甲基甲酰胺(DMF)、二乙基甲酰胺(DEF)、N,N-二甲基乙酰胺(DMAc)、N-甲基吡咯烷酮(NMP)、N-乙基吡咯烷酮(NEP)、1,3-二甲基-2-咪唑啉酮、N,N-二甲基甲氧基乙酰胺、二甲亚砜、吡啶、二甲砜、六甲基膦酰胺、四甲基脲、N-甲基己内酰胺、四氢呋喃、间二噁烷、对二噁烷、和1,2-二甲氧基乙烷等。具体地，可以使用醇，更具体地为甲醇，但是不限于此。

带正电荷可以通过使多孔人工伴侣颗粒与具有例如含氮基团(例如，氨基或氨基烷基)等碱性基团的烷氧基硅烷反应来进行。具体地，可以使用N-[3-(三甲氧基甲硅烷基)丙基]乙二胺、N1-(3-三甲氧基甲硅烷基丙基)二亚乙基三胺、(3-氨基丙基)三甲氧基硅烷、N-[3-(三甲氧基甲硅烷基)丙基]苯胺、三甲氧基[3-(甲基氨基)丙基]硅烷、3-(2-氨基乙基氨基)丙基二甲氧基甲基硅烷等，但是不限于此。

带负电荷可以通过使多孔人工伴侣颗粒与具有例如羧基、磺酸基、硫醇基等酸性基团的烷氧基硅烷反应来进行。具体地，可以使用(3-巯基丙基)三甲氧基硅烷，但是不限于此。

可以通过使多孔人工伴侣颗粒与具有亲水性基团例如羟基、羧基、氨基、羰基、巯基、磷酸基、硫醇基、铵基、酯基、酰亚胺基、硫代酰亚胺基、酮基、醚基、茚基、磺酰基、和聚乙二醇基等的烷氧基硅烷反应来获得亲水性。具体地，可以使用N-[3-(三甲氧基甲硅烷基)丙基]乙二胺、N1-(3-三甲氧基甲硅烷基丙基)二亚乙基三胺、(3-氨基丙基)三甲氧基硅烷、(3-巯基丙基)三甲氧基硅烷、三甲氧基[3-(甲基氨基)丙基]硅烷、3-(2-氨基乙基氨基)丙基二甲氧基甲基硅烷，但是不限于此。

可以通过使多孔人工伴侣颗粒与具有疏水性取代基例如取代或未取代的C1至C30烷基、取代或未取代的C3至C30环烷基、取代或未取代的C6至C30芳基、取代或未取代的C2至C30杂芳基、卤素基团、C1至C30酯基、和含卤素基团等的烷氧基硅烷反应来获得疏水性。具体地，可以使用三甲氧基(十八烷基)硅烷、三甲氧基正辛基硅烷、三甲氧基(丙基)硅烷、异丁基(三甲氧基)硅烷、三甲氧基(7-辛烯-1-基)硅烷、三甲氧基(3,3,3-三氟丙基)硅烷、三甲氧基(2-苯基乙基)硅烷、乙烯基三甲氧基硅烷、氰基甲基、3-(三甲氧基甲硅烷基)丙基]三硫代碳酸酯、(3-溴丙基)三甲氧基硅烷等，但是不限于此。

此外，为了增加多孔人工伴侣颗粒与难溶性(疏水性)多肽的结合力，可以使疏水性取代基存在于颗粒的孔内部。此外，在容易使用和配制的方面，还可以对颗粒的表面进行处理以具有亲水性取代基。

此外，表面修饰可以组合进行。例如，可以在颗粒的外表面上或孔的内部进行表面修饰两次以上。作为具体实例，可以使含有羧基的化合物通过酰胺键结合至其中引入有氨基的二氧化硅颗粒，从而改变带正电荷的颗粒以具有不同的表面性质，但是不限于此。

多孔人工伴侣颗粒与烷氧基硅烷的反应可以例如在加热下进行。加热可以在80至180℃，例如，在上述范围内的80至160℃、80至150℃、100至160℃、100至150℃、110至150℃等下进行，但是不限于此。

多孔人工伴侣颗粒与烷氧基硅烷的反应可以进行4至20小时，例如，在上述范围内的4至18小时、4至16小时、6至18小时、6至16小时、8至18小时、8至16小时、8至14小时、10至14小时等，但是不限于此。

可以根据表面修饰的程度根据期望来选择反应温度、时间和用于表面修饰的化合物的量。换言之，反应条件将取决于多肽的亲水性、疏水性和电荷水平而变化。具体地，通过控制多孔人工伴侣颗粒的亲水性、疏水性和/或电荷水平，可以控制多肽的释放速率。例如，如果多肽在中性pH下具有强的负电荷，则可以提高反应温度、可以延长反应时间或者可以增加所处理的化合物的量，从而使多孔人工伴侣颗粒具有强的正电荷，但是不限于此。

此外，本发明的多孔人工伴侣颗粒可以通过例如小孔颗粒的制备、孔扩张、表面修饰和孔内部修饰来制造。

小孔颗粒的制备和孔扩张可以通过上述工序来进行，并且，在小孔颗粒的制备之后和孔扩张之后，可以进行清洗工序和干燥工序。

如果需要，可以在清洗之前将未反应的材料分离，并且可以通过借助离心将上清液分离来进行未反应的材料的分离。

可以以6,000至10,000rpm进行离心，并且离心时间可以为3至60分钟，例如，在上述范围内的3至30分钟、3至30分钟、5至30分钟等，但是不限于此。

小孔颗粒的制备之后的清洗可以通过在上述范围内的方法/条件来进行，但是不限于此。

孔扩张之后的清洗可以在比上述实施方案更宽松的条件下进行。例如，清洗可以进行三次以下，但是不限于此。

表面修饰和孔内部修饰可以分别通过上述工序来进行。本文中，表面修饰和随后的孔内部修饰可以依次进行，并且可以在上述两个工序之间进一步进行清洗工序。

当在小孔颗粒的制备和孔扩张之后在更宽松的条件下进行清洗时，例如用于颗粒制备和孔扩张的表面活性剂等反应溶液填充在孔中，以使在表面修饰期间不会使孔的内部被修饰，而是仅可以修饰颗粒的表面。此后，可以将在孔的内部的反应溶液洗去并除去。

表面修饰工序与孔内部修饰工序之间的颗粒清洗可以使用水和/或有机溶剂来进行。具体地，由于不同的物质溶解于不同的溶剂中，因此水和有机溶剂可以交替使用一次或数次，或者可以单独用水或有机溶剂进行清洗一次或数次。上述数次可以为2次以上且10次以下，例如，3次以上且10次以下、4次以上且8次以下、4次以上且6次以下。

可以在例如以6,000至10,000rpm进行的离心下进行清洗，并且离心时间可以为3至60分钟，例如，在上述范围内的3至30分钟、3至30分钟、5至30分钟等，但是不限于此。

可选地，可以在不离心的情况下通过使颗粒通过过滤器滤出来进行清洗。过滤器可以具有尺寸小于或等于多孔人工伴侣颗粒的直径的孔。当用如上所述的此类过滤器来过滤反应溶液时，只有颗粒保留在过滤器上，所述颗粒可以通过在过滤器上倒水和/或有机溶剂来清洗。

在清洗中，水和有机溶剂可以交替使用一次或数次，或者可以单独用水或有机溶剂进行清洗一次或数次。上述数次可以为2次以上且10次以下，例如，3次以上且10次以下、4次以上且8次以下、4次以上且6次以下。

可以例如在20至100℃下进行干燥，但是不限于此，并且还可以在真空状态下进行干燥。

可以使多肽负载在多孔人工伴侣颗粒的表面上和/或孔的内部。本文中，可以例如通过将多孔人工伴侣颗粒与多肽在溶剂中混合来进行负载。

溶剂可以为水和/或有机溶剂，并且溶剂可以包括例如：醚类，例如1,4-二噁烷(特别是环醚)；卤代烃类，例如氯仿、二氯甲烷、四氯化碳、1,2-二氯乙烷、二氯乙烯、三氯乙烯、全氯乙烯、二氯丙烷、戊基氯、1,2-二溴乙烷等；酮类，例如丙酮、甲基异丁基酮、环己酮等；芳香族碳基材料，例如苯、甲苯、二甲苯等；烷基酰胺，例如N,N-二甲基甲酰胺、N,N-二丁基甲酰胺、N,N-二甲基乙酰胺、N-甲基吡咯烷酮等；醇类，例如甲醇、乙醇、丙醇、和丁醇等。具体地，可以使用醇，更具体地为甲醇，但是不限于此。

此外，可以使用PBS(磷酸盐缓冲盐水溶液(phosphate buffered salinesolution))、SBF(模拟体液(simulated body fluid))、硼酸盐缓冲盐水、tris缓冲盐水作为溶剂。

负载在多孔人工伴侣颗粒上的多肽可以在延长的时间内逐渐释放。此类持续释放可以是连续或不连续的、或者线性或非线性的。此外，该释放可以取决于多孔人工伴侣颗粒的特性和/或多孔人工伴侣颗粒与多肽之间的相互作用而变化。

当多孔人工伴侣颗粒被生物降解时，负载在多孔人工伴侣颗粒上的多肽释放。具体地，根据本发明的多孔人工伴侣颗粒缓慢地降解，从而使得以持续的方式释放所负载的多肽。此类释放可以通过例如调整多孔人工伴侣颗粒的表面积、粒径、孔径、在颗粒的表面上和/或孔的内部的取代基、表面致密性等来控制，但是不限于此。

负载在多孔人工伴侣颗粒上的多肽可以在从多孔人工伴侣颗粒分离并且扩散的同时释放。由于释放受到多孔人工伴侣颗粒、多肽及其释放环境之间的关系的影响，因此，调节该关系可以控制多肽的释放。例如，通过借助表面修饰来增强或减弱多孔人工伴侣颗粒与多肽的结合力，可以控制多肽的释放。

更具体地，在所负载的多肽难溶(疏水)的情况下，颗粒的表面和/或孔的内部具有疏水性取代基，从而增加多孔人工伴侣颗粒与多肽的结合力，由此可以以持续的方式释放多肽。例如，可以用具有疏水性取代基的烷氧基硅烷对多孔人工伴侣颗粒进行表面修饰。

如本文中所使用的，术语“难溶”意指不溶、几乎不溶或仅微溶(在水中)，其为“Pharmaceutical Science”第18版(由U.S.P.、Remington和Mack Publishing Company发行)中定义的词语。

难溶性物质在1个大气压和25℃下可以具有例如小于10g/L、具体地小于5g/L、并且更具体地小于1g/L的水溶解度，但是不限于此。

当所负载的多肽是水溶性的(亲水性的)时，颗粒的表面和/或孔的内部具有亲水性取代基，从而增加多孔人工伴侣颗粒与多肽的结合力，由此可以以持续的方式释放多肽。例如，可以用具有亲水性取代基的烷氧基硅烷对多孔人工伴侣颗粒进行表面修饰。

例如，水溶性物质在1个大气压和25℃下可以具有10g/L以上的水溶解度，但是不限于此。

在所负载的多肽带电荷的情况下，颗粒的表面和/或孔的内部带有相反的电荷，从而增加多孔人工伴侣颗粒与多肽的结合力，由此可以以持续的方式释放多肽。例如，可以用具有酸性基团或碱性基团的烷氧基硅烷对多孔人工伴侣颗粒进行表面修饰。

具体地，如果多肽在中性pH下带正电荷，则颗粒的表面和/或孔的内部可以在中性pH下带负电荷，从而增加多孔人工伴侣颗粒与多肽的结合力，由此可以以持续的方式释放多肽。例如，可以用具有例如羧基(-COOH)、磺酸基(-SO

此外，如果多肽在中性pH下带负电荷，则颗粒的表面和/或孔的内部可以在中性pH下带正电荷，从而增加多孔人工伴侣颗粒与多肽的结合力，由此可以以持续的方式释放多肽。例如，可以用具有例如氨基或任何其它含氮基团等碱性基团的烷氧基硅烷对多孔人工伴侣颗粒进行表面修饰。

多肽可以释放例如7天至1年以上的时间，这取决于所需处理的类型、释放环境和要使用的多孔人工伴侣颗粒的类型。

此外，如果本发明的多孔人工伴侣颗粒是可生物降解的，则其可以100％降解。因此，其上负载的多肽可以100％释放。

本发明的药物组合物可以进一步包含药学上可接受的载体，并且可以与此类载体一起配制。如本文中所使用的，术语“药学上可接受的载体”是指不刺激生物体并且不抑制所给予的化合物的生物学活性和性质的载体或稀释剂。在配制为液体溶液的组合物中可接受的药用载体是无菌的且生物相容的，并且可以包括盐水、无菌水、林格氏溶液、缓冲盐水、白蛋白注射液、右旋糖溶液、麦芽糖糊精溶液、甘油、乙醇、和这些组分中的一种或多种的混合物。此外，如果需要，可以添加其它通常的添加剂，例如抗氧化剂、缓冲剂和抑菌剂。还可以添加稀释剂、分散剂、表面活性剂、粘合剂和润滑剂，以将药物组合物配制成可注射制剂例如水溶液剂、悬浮液和乳剂等，丸剂，胶囊剂，颗粒剂或片剂。

本发明的药物组合物适用于任意制剂形式，并且可以以口服制剂或肠胃外制剂来制备。本发明的药物制剂可以包括适合于口服给药、直肠给药、经鼻给药、局部(包括脸颊和舌下)给药、皮下给药、阴道给药或肠胃外(肌内、皮下)给药的形式。可选地，还可以包括适合于通过吸入或吹入来给药的形式。

本发明的药物组合物以药学有效量来给药。可以取决于患者的疾病类型、严重程度、药物的活性、对药物的敏感性、给药时间、给药途径和释放速率、治疗持续时间、包括同时存在的药物的因素、和在医学领域众所周知的其它因素来确定有效剂量水平。本发明的药物组合物可以作为单独的治疗剂或与其它治疗剂组合来给药，可以与常规治疗剂顺序或同时给药，并且可以以单剂量或多剂量给药。考虑到所有上述因素，重要的是以可以以最小量达到最大效果而没有副作用的量来给予药物组合物，这可以由本领域技术人员容易地确定。

根据本发明的药物组合物的剂量可以取决于患者的体重、年龄、性别、健康状况或饮食、给药时间、给药方法、排泄率和疾病的严重程度而有很大变化，并且合适的剂量取决于例如蓄积在患者体内的药物量和/或所使用的本发明的载体的特定功效而变化。通常，可以基于在体内动物模型中和体外通常确定为有效的EC50来计算所述量，例如，每kg体重0.01μg至1g。此外，本发明的药物组合物可以在例如每天、每周、每月或每年等单位时间周期期间每单位时间给药一次或数次，或者可以使用输液泵长时间连续给药。考虑到药物在体内的保留时间、体内的药物浓度等来确定重复给药的次数。根据疾病治疗的过程，即使在治疗后也可以进一步给予组合物以防止复发(recurrence)，即，疾病的复发(relapse)。

此外，可以使用本领域已知的任何方法来配制本发明的药物组合物，以允许在对哺乳动物给药后活性成分的快速释放、持续释放或延迟释放。可以以散剂、颗粒剂、片剂、乳剂、糖浆剂、气雾剂、软或硬明胶胶囊剂、无菌注射液、无菌粉末的形式来生产制剂。

下文中，将参考以下实施例详细地描述本发明。

实施例1.基于多孔纳米颗粒的人工伴侣(ACPN)的制备

1.多孔人工伴侣颗粒的制备

(1)多孔人工伴侣颗粒的制备

1)小孔颗粒的制备

将960ml蒸馏水(DW)和810ml MeOH置于2L圆底烧瓶中。将7.88g CTAB添加至烧瓶中，然后在搅拌下快速添加4.52ml 1M NaOH。在搅拌10分钟的同时添加均匀的混合物之后，进一步添加2.6ml TMOS。在搅拌6小时以均匀地混合之后，将反应溶液老化24小时。

然后，将反应溶液在8000rpm和25℃下离心10分钟以除去上清液，在8000rpm和25℃下离心10分钟，并且用乙醇和蒸馏水交替清洗五次。

此后，将所得产物在70℃的烘箱中干燥以收获1.5g粉末状小孔多孔人工伴侣颗粒(孔平均直径为2nm并且粒径为200nm)。

2)孔扩张

将1.5g小孔多孔人工伴侣颗粒粉末添加至10ml乙醇中并且进行超声分散，并且进一步添加10ml水和10ml TMB(三甲基苯)，然后进行超声分散。

此后，将分散液置于高压釜中，并且在160℃下反应48小时。

反应在25℃下开始并且在使温度以10℃/min的速率升高的同时进行，然后在高压釜中以1至10℃/min的速率缓慢地冷却。

将冷却的反应溶液在25℃下以8000rpm离心10分钟以除去上清液，在25℃下以8000rpm离心10分钟，并且用乙醇和蒸馏水交替清洗五次。

然后，将产物在70℃的烘箱中干燥以收获粉末状多孔人工伴侣颗粒(孔径为10至15nm，并且粒径为200nm)。

3)煅烧

将在2)中制备的多孔人工伴侣颗粒放入玻璃小瓶中，在550℃下加热5小时，并且在反应完成之后缓慢地冷却至室温以制备颗粒。

(2)多孔人工伴侣颗粒的制备

除了将孔扩张时的反应条件改变为140℃和72小时以外，通过与实施例1-1-(1)相同的方法来制备多孔人工伴侣颗粒。

(3)多孔人工伴侣颗粒的制备(10L规模)

除了使用大5倍的容器并且每种物质以5倍容量使用以外，通过与实施例1-1-(1)相同的方法来制备多孔人工伴侣颗粒。

(4)多孔人工伴侣颗粒(粒径为300nm)的制备

除了使用920ml蒸馏水和850ml甲醇来制备小孔颗粒以外，通过与实施例1-1-(1)中相同的方法来制备多孔人工伴侣颗粒。

(5)多孔人工伴侣颗粒(粒径为500nm)的制备

除了使用800ml蒸馏水、1010ml甲醇和10.6g CTAB来制备小孔颗粒以外，通过与实施例1-1-(1)相同的方法来制备多孔人工伴侣颗粒。

(6)多孔人工伴侣颗粒(粒径为1000nm)的制备

除了使用620ml蒸馏水、1380ml甲醇和7.88g CTAB来制备小孔颗粒以外，通过与实施例1-1-(1)相同的方法来制备多孔人工伴侣颗粒。

(7)多孔人工伴侣颗粒(孔径为4nm)的制备

除了使用2.5ml TMB用于孔扩张以外，通过与实施例1-1-(1)相同的方法来制备多孔人工伴侣颗粒。

(8)多孔人工伴侣颗粒(孔径为7nm)的制备

除了使用4.5ml TMB用于孔扩张以外，通过与实施例1-1-(1)相同的方法来制备多孔人工伴侣颗粒。

(9)多孔人工伴侣颗粒(孔径为17nm)的制备

除了使用11ml TMB用于孔扩张以外，通过与实施例1-1-(1)相同的方法来制备多孔人工伴侣颗粒。

(10)多孔人工伴侣颗粒(孔径为23nm)的制备

除了使用12.5ml TMB用于孔扩张以外，通过与实施例1-1-(1)相同的方法来制备多孔人工伴侣颗粒。

(11)多孔人工伴侣颗粒的制备(双重修饰)

1)小孔颗粒的制备

通过与实施例1-1-(1)-1)相同的方法来制备小孔颗粒。

2)孔扩张

通过与实施例1-1-(1)-2)相同的方法，使小孔颗粒与TMB反应、冷却并且离心以除去上清液。此后，将剩余的溶液在与实施例1-1-(1)-2)相同的条件下离心，用乙醇和蒸馏水交替清洗三次，然后在与实施例1-1-(1)-2)相同的条件下干燥，由此收获粉末状多孔人工伴侣颗粒(孔径为10至15nm，并且粒径为200nm)。

3)表面修饰

在将0.8g至1g具有扩张的孔的多孔人工伴侣颗粒分散在50ml甲苯中之后，将5ml(3-氨基丙基)三乙氧基硅烷添加至其中，然后在120℃下回流加热12小时。该过程之后是上述清洗和干燥过程，然后将1ml三甘醇(PEG3，2-[2-(2-甲氧基乙氧基)乙氧基]乙酸)、100mgEDC(1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺)和200mg N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)分散在30ml PBS中并且使其在搅拌下在室温下反应12小时。然后将产物进行清洗和干燥。

由于前一步骤的反应溶液保留在孔的内部，因此孔的内部未被修饰。

4)清洗孔内部

将800mg表面修饰的颗粒粉末溶解于40ml 2M HCl/乙醇中并且在剧烈搅拌下回流12小时。

此后，将冷却的反应溶液以8000rpm离心10分钟以除去上清液，在8000rpm和25℃下离心10分钟，并且用乙醇和蒸馏水交替清洗五次。

此后，将产物在70℃的烘箱中干燥，由此收获粉末状多孔人工伴侣颗粒。

5)修饰孔内部

①通过与下述实施例1-2-(2)-1)相同的方法将丙基引入至孔中。

②通过与下述实施例1-2-(2)-2)相同的方法将辛基引入至孔中。

2.多孔人工伴侣颗粒的表面修饰

(1)带正电荷

1)粒径为300nm的颗粒

使实施例1-1-(4)的多孔人工伴侣颗粒与(3-氨基丙基)三乙氧基硅烷(APTES)反应，以使其带正电荷。

具体地，用浴超声仪(bath sonicator)将100mg多孔人工伴侣颗粒分散在100ml圆底烧瓶中的10ml甲苯中。然后，添加1ml APTES并且在400rpm和130℃下搅拌12小时。

反应后，将产物缓慢地冷却至室温并且以8000rpm离心10分钟以除去上清液，进一步在8000rpm和25℃下离心10分钟，然后用乙醇和蒸馏水交替清洗五次。

此后，将产物在70℃的烘箱中干燥以收获在颗粒的表面上和孔的内部具有氨基的粉末状多孔人工伴侣颗粒。

2)粒径为200nm的颗粒

①通过使实施例1-1-(1)的多孔人工伴侣颗粒与(3-氨基丙基)三乙氧基硅烷(APTES)反应来使颗粒带正电荷，并且除了添加0.4ml APTES和反应时间为3小时以外，以与实施例1-2-(1)-1)的方法相同的方式进行修饰。

②通过使实施例1-1-(9)的多孔人工伴侣颗粒与(3-氨基丙基)三乙氧基硅烷(APTES)反应来使颗粒带正电荷，并且以与实施例1-2-(1)-1)的方法相同的方式进行修饰。

③通过使实施例1-1-(10)的多孔人工伴侣颗粒与(3-氨基丙基)三乙氧基硅烷(APTES)反应来使颗粒带正电荷，并且以与实施例1-2-(1)-1)的方法相同的方式进行修饰。

(2)疏水基团的引入

1)丙基

使实施例1-1-(1)的多孔人工伴侣颗粒与三甲氧基(丙基)硅烷反应以将丙基引入至颗粒的表面和孔的内部，并且除了添加0.35ml三甲氧基(丙基)硅烷来代替APTES、然后进行反应12小时以外，通过与实施例1-2-(1)相同的方法进行修饰。

2)辛基

使实施例1-1-(1)的多孔人工伴侣颗粒与三甲氧基正辛基硅烷反应以将辛基引入至颗粒的表面和孔的内部，并且除了添加0.5ml三甲氧基正辛基硅烷来代替APTES、然后进行反应12小时以外，通过与实施例1-2-(1)相同的方法进行修饰。

(3)带负电荷

1)羧基

通过使实施例1-1-(1)的多孔人工伴侣颗粒与琥珀酸酐(succinic anhydride)反应来使颗粒带负电荷。此外，除了使用DMSO(二甲亚砜)来代替甲苯、添加80mg琥珀酸酐来代替APTES以使反应在搅拌下在室温下进行24小时、和在清洗时使用DMSO来代替蒸馏水以外，以与实施例1-2-(1)-1)的方法相同的方式对带电荷的颗粒进行修饰。

2)硫醇基

除了使用1.1ml MPTES来代替APTES以外，以与实施例1-2-(1)-1)的方法相同的方式对颗粒进行修饰。

3)磺酸基

将100mg实施例1-2-(3)-2)的多孔二氧化硅纳米颗粒分散在1ml 1M硫酸水溶液和20ml 30％过氧化氢溶液中，并且在室温下搅拌以引发氧化反应，从而将硫醇基氧化为磺酸基。此后，以与实施例1-2-(1)-1)的方法相同的方式将产物进行清洗和干燥。

3.颗粒形成和孔扩张的鉴定

在显微镜下观察在实验例1-1-(1)至(3)中制备的小孔颗粒和多孔人工伴侣颗粒，以确定小孔颗粒是否均匀形成或者孔是否充分扩张以均匀地形成多孔人工伴侣颗粒(图1至4)。

图1为实施例1-1-(1)中的多孔人工伴侣颗粒的照片，并且图2为实施例1-1-(2)中的多孔人工伴侣颗粒的照片，并且从这些图可以看出，均匀地形成了具有充分扩张的孔的球形多孔人工伴侣颗粒。

图3为实施例1-1-(1)中的小孔颗粒的照片，并且图4为实施例1-1-(1)和1-1-(3)的小孔颗粒的比较照片，并且从这些图可以看出，均匀地形成了球形小孔颗粒。

4.BET表面积和孔体积的计算

计算实施例1-1-(1)中的小孔颗粒和实施例1-1-(1)、(7)、(8)和(10)的多孔人工伴侣颗粒的表面积和孔体积。通过Brunauer-Emmett-Teller(BET)法来计算表面积，并且通过Barrett-Joyner-Halenda(BJH)法来计算孔径分布。

颗粒的显微照片在图5中示出，并且计算结果在下表1中示出。

[表1]

5.生物降解性的鉴定

为了鉴定实施例1-1-(1)中的多孔人工伴侣颗粒的生物降解性，在0小时、120小时和360小时在显微镜下观察在37℃下在SBF(pH 7.4)中的生物降解性，并且其结果在图6中示出。

参照图6，可以看出多孔人工伴侣颗粒被生物降解并且在360小时之后几乎完全降解。

6.吸光度比的测量

根据下式1来测量随时间推移的吸光度比。

[式1]

A

(其中A

使15ml与悬浮液相同的溶剂与渗透膜的外部接触，并且在60rpm和37℃下水平地搅拌渗透膜的内部和外部，并且

A

具体地，将5mg多孔人工伴侣颗粒粉末溶解于5ml SBF(pH 7.4)中。此后，将5ml多孔人工伴侣颗粒溶液置于图7中示出的具有孔径为50kDa的孔的渗透膜中。将15ml SBF添加至外膜，并且每12小时更换外膜的SBF。多孔人工伴侣颗粒的降解在37℃下、在60rpm的水平搅拌下来进行。

然后，吸光度通过UV-可见光谱法来测量并且在λ＝640nm处分析。

(1)吸光度比的测量

根据上述方法来测量实施例1-1-(1)中的多孔人工伴侣颗粒的吸光度比，并且其结果在图8中示出。

参照图8，可以看出，在吸光度比达到1/2时，t为约58小时，以证明非常缓慢的降解。

(2)粒径

根据上式1来测量实施例1-1-(1)、(5)和(6)中的多孔人工伴侣颗粒的吸光度，并且其结果在图9中示出(SBF用作悬浮液和溶剂)。

参照图9，可以看出t随着粒径的增加而降低。

(3)平均孔径

根据上式1来测量实施例1-1-(1)和(9)中的多孔人工伴侣颗粒和作为对照的实施例1-1-(1)中的小孔多孔人工伴侣颗粒的吸光度，并且其结果在图10中示出(SBF用作悬浮液和溶剂)。

参照图10，可以看出，本发明实施例的多孔人工伴侣颗粒具有比对照显著更大的t。

(4)pH

测量实施例1-1-(4)中的多孔人工伴侣颗粒针对每种pH的吸光度。在pH 2、5和7.4下在SBF和Tris中测量吸光度，并且其结果在图11中示出。

参照图11，可以看出，虽然针对各pH，t存在差异，但是在所有吸光度比达到1/2时，t为24以上。

(5)带电荷

测量实施例1-2-(1)-1)中的多孔人工伴侣颗粒的吸光度，并且其结果在图12中示出(Tris(pH 7.4)用作悬浮液和溶剂)。

参照图12，可以看出，在带正电荷的颗粒的吸光度比达到1/2时，t为24以上。

实施例2.多肽的钉合

1.多孔人工伴侣颗粒的设计和特性的评价

作为多孔人工伴侣颗粒，使用未经表面修饰的实施例1-1-(1)的多孔人工伴侣颗粒、其中引入有丙基的实施例1-2-(2)-1)的颗粒、和其中引入有辛基的实施例1-2-(2)-2)的颗粒。

将各ACPN(10mg)悬浮于100μl尼罗红溶液(1mg/ml甲醇溶液)中并且搅拌1小时。通过离心来收集这些复合物并且用甲醇和水交替清洗数次以除去吸附至颗粒表面的尼罗红。使用UV/vis吸收测量，将各ACPN-尼罗红复合物溶液制备为具有恒定的尼罗红含量。测量包封在颗粒内部的孔中的尼罗红的荧光发射光谱(λex＝510nm)并且比较各复合物溶液的相对发射强度。

通过TEM图像和动态光散射(DLS)证实，在使p53肽(式1)负载至颗粒前后，粒径和粒度分布没有显著变化(图14)。

[式1]

FAM-GGQSQQTF*KNLWRLL**KQN-NH

(*K：缀合有d-赖氨酸的戊炔酸，**K：2-氨基-5-叠氮基-戊酸)

2.根据表面修饰的差异评价多肽的钉合程度

使用J-810分光偏振计(JASCO，日本)来测量CD光谱。使用光程长度(path length)为1cm的比色杯在范围为250至190nm的波长处记录光谱。测试重复五次并且取平均值。ACPN悬浮液浓度为0.2mg/ml(p53浓度：20μΜ)。在CD测量之前，使所有样品悬浮液在室温下稳定至少2天。在25至75℃的温度范围内以10℃的间隔来扫描光谱，从而进行相对于温度的CD实验。使用CONTIN-LL算法来计算肽的α-螺旋度。

当被辛基取代时，显示最高的α螺旋水平稳定度(图15)。

3.细胞实验

人肝癌细胞系HepG2和人宫颈癌细胞系HeLa在37℃、5％CO

进行半胱天冬酶-3活性分析来鉴定ACPNP-C8@点击的p53诱导细胞凋亡的作用。将HepG2细胞分别用ACPNP-C8、ACPNP-C8@点击的p53(12.5μM、25μM)和PBS处理4小时，然后用新鲜的培养基温育20小时。将细胞进行清洗，用裂解缓冲液(Promega，USA)处理并且在4℃下离心10分钟。将收集的裂解物在37℃的湿润的培养箱中用半胱天冬酶-3底物(Ac-DEVD-pNA，100μM)温育2小时。然后测量荧光强度(λex＝400nm，λem＝505nm)。

参照图16，可以看出ACPNP-C8@点击的p53具有显著优异的活性。

4.体内实验

对五周龄的Balb/c雄性裸鼠皮下注射HepG2细胞(6×10

参照图17，可以看出ACPNP-C8@点击的p53具有显著优异的活性。

5.多肽释放

从ACPN-C8释放经点击的p53肽的实验分别在PBS缓冲液和含有10％FBS的PBS缓冲液中进行。将载有经点击的p53的ACPN-C8(1mg/ml)各自分散在PBS缓冲溶液和含有10％FBS的PBS缓冲溶液中，然后在37℃下在搅拌下温育(N＝3)。在各时间点，通过离心来收集上清液，并且测量来自上清液的FAM标记的经点击的p53的荧光强度(λex＝480nm，λem＝520nm)以计算释放的肽的浓度。

参照图18，可以看出，多肽的释放速率在不含有FBS的缓冲溶液中显著较慢。