一种用于烟草根结线虫防治的坚强芽孢杆菌的发酵制备及应用

技术领域

本发明属于农业生物防治领域，具体涉及一种用于烟草根结线虫防治的坚强芽孢杆菌的发酵制备及应用。

背景技术

根结线虫是一种土传植物寄生性线虫，会引起植物根形成根结根瘤、严重时造成根系腐烂，同时还可以引发植物感染其他真菌和细菌性病害。根结线虫寄主范围非常广泛，可寄生于200多种不同的农作物上，特别是是在烟草上危害更重，常常造成35％损失，严重时可以造成毁田。

根结线虫病属于土壤传播，防治难度非常大。国际上主要采用化学农药来防治根结线虫，通过放学农药来防治根结线虫，防效低，持效期短，而且会造成严重的环境污染以及对植物本身造成严重的伤害，对于长期使用化学农药，根结线虫会产生出抗药性，从而使得防治变得更加困难。随着大批化学农药在烟草上被禁止使用后，亟待寻找一些环境友好型的生物菌剂来防治根结线虫病。

基于此，本发明设计了一种用于烟草根结线虫防治的坚强芽孢杆菌的发酵制备及应用，以解决上述问题。

发明内容

本发明的目的在于提供一种固体发酵及其处理工艺，以解决上述背景技术中提出的问题。

为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

一种用于烟草根结线虫防治的坚强芽孢杆菌，坚强芽孢杆菌已经保存在中国微生物保藏管理委员会普通微生物中心，分类命名：坚强芽孢杆菌；Bacillus firmus；保藏号：CGMCC No.20169；保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号；保藏日期：2020年7月1日。

一种用于烟草根结线虫防治的坚强芽孢杆菌的发酵制备，包括以下制备步骤：

①菌体活化，将低温保存的坚强芽孢杆菌至于斜面培养基在23℃下进行恒温活化培养1d，制得坚强芽孢杆菌的活化菌株；

②种子液制备，挑取活化的坚强芽孢杆菌菌株，接入灭菌后的液体培养基中，130r/min，25℃下恒温培养48h，制得种子液；

③发酵培养，将步骤②制得的种子液按照体积比为2％接种于灭菌后的发酵罐中在固体培养基中，在120r/min，25℃的恒温条件下培养72h，当活孢数≥1000亿/g时，停止发酵，得到发酵液；

④成品制备，将步骤③制备得到的坚强芽孢杆菌的发酵液，经过细菌计数后，筛选后将活孢子数≥1000亿/g的进行包装保存。

优选地，所述步骤①所述的斜面培养基组分如下均为重量百分比：胰蛋白胨2.5％，酵母浸粉2.0％，氯化1.0％。

优选地，所述步骤②中所述的培养基组分如下，均为重量百分比：胰蛋白胨3.5％，酵母提取物1.0％，氯化钠1.0％，琼脂粉3.5％，葡萄糖0.5％，余量为水，PH：7.1。

优选地，所述步骤③中所述的固体培养基组分如下，均为重量百分比：小麦麸3.0％，牛肉膏3.0％，氯化钠0.5％，磷酸二氢钾0.3％，葡萄糖1.0％，醋酸钠0.3％，酵母膏1.0％，余量为水PH：7.2。

优选地，发酵过程采用了固体发酵技术，该技术能够缩短发酵时间，提高发酵效率，芽孢成功率提高。

一种用于烟草根结线虫防治的坚强芽孢杆菌菌剂的应用，本发明菌剂能够高效的防治烟草根结线虫，但又不仅限于烟草根结线虫。

优选地，该菌剂的主要使用方法为，将其在使用前需要稀释600倍即就是按照600：1的比例将其稀释，同时使用灌根结合土壤无虫化处理进行烟草培育。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

与目前主流的防治方式相比较，本发明具有以下的有益效果：本发明通过固体发酵的方式制得，其发酵过程能够缩短且芽孢成孢率高，是一种便利简单的发酵方式，且本发明成品是一种有益微生物菌剂，不仅能够高效的防治烟草根结线虫等根结线虫病，而且能够减少化学农药的使用，以此来达到减少环境污染的问题，其还能够做到高效、安全、便利的防治烟草根结线虫等根结线虫病，本发明能够通过有益微生物的快速在土壤中繁殖、定植，使土壤活力逐渐恢复且相对提高土壤肥力。坚强芽孢杆菌的进一步研发提供了一株优良的菌株，其能够被广泛的应用在不同农作物的根结线虫防治上，而且能够扩大经济效益、提高土壤肥力、减少环境污染和农业可持续发展具有重大意义。

附图说明

图1为本发明制备的工艺流程图。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1

一种用于烟草根结线虫防治的坚强芽孢杆菌，坚强芽孢杆菌已经保存在中国微生物保藏管理委员会普通微生物中心，

分类命名：坚强芽孢杆菌；Bacillus firmus；

保藏号：CGMCC No.20169；

保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号；

保藏日期：2020年7月1日。

一种用于烟草根结线虫防治的坚强芽孢杆菌的发酵制备，包括以下制备步骤：

①菌体活化，将低温保存的坚强芽孢杆菌至于斜面培养基在23℃下进行恒温活化培养1d，制得坚强芽孢杆菌的活化菌株，斜面培养基组分如下均为重量百分比：胰蛋白胨2.5％，酵母浸粉2.0％，氯化1.0％；

②种子液制备，挑取活化的坚强芽孢杆菌菌株，接入灭菌后的液体培养基中，培养基组分如下，均为重量百分比：胰蛋白胨3.5％，酵母提取物1.0％，氯化钠1.0％，琼脂粉3.5％，葡萄糖0.5％，余量为水，PH：7.1，130r/min，25℃下恒温培养48h，制得种子液；

③发酵培养，将步骤②制得的种子液按照体积比为2％接种于灭菌后的发酵罐中在固体培养基中，固体培养基组分如下，均为重量百分比：小麦麸3.0％，牛肉膏3.0％，氯化钠0.5％，磷酸二氢钾0.3％，葡萄糖1.0％，醋酸钠0.3％，酵母膏1.0％，余量为水PH：7.2，在120r/min，25℃的恒温条件下培养72h，当活孢数≥1000亿/g时，停止发酵，得到发酵液；

发酵过程采用了固体发酵技术，该技术能够缩短发酵时间，提高发酵效率，芽孢成功率提高；

④成品制备，将步骤③制备得到的坚强芽孢杆菌的发酵液，经过细菌计数后，筛选后将活孢子数≥1000亿/g的进行包装保存。

一种用于烟草根结线虫防治的坚强芽孢杆菌菌剂的应用，本发明菌剂能够高效的防治烟草根结线虫，但又不仅限于烟草根结线虫，该菌剂的主要使用方法为，将其在使用前需要稀释600倍即就是按照600：1的比例将其稀释，同时使用灌根结合土壤无虫化处理进行烟草培育。

通过发酵比对发现，本实施例1所采用的发酵技术、发酵培养基等为制备本发明一种用于烟草根结线虫防治的坚强芽孢杆菌菌剂的优选方案，此技术便捷，且通过该制备方案得出的本发明成品具有更加高效的防治效果.

实施例2

一种用于烟草根结线虫防治的坚强芽孢杆菌菌剂的应用

试验地点：试验地点位于陕西省汉中烟草种植区。

试验材料：

①本发明坚强芽孢杆菌菌剂的600倍稀释液；②解淀粉芽孢杆菌菌剂的600倍稀释液；③枯草芽孢杆菌菌剂的600倍稀释液；④普通市售化学杀虫剂，⑤清水(CK)；烟草品种为普通烤烟。

试验处理：此次我们将田中的烟草数量控制为300株，每种处理方式划分3个小组试验田，每组100株烟草苗株，便于试验调查及统计；在进行移栽前，我们将剔除带虫苗以及根瘤，将剔除后的烟苗按照每株3ml剂量浸泡在各个溶液中，充分浸泡后将烟草移栽种植进行观察，通过对烟草的地上部分调查的病情发病率，以及对二龄幼虫的减退率进行调查得出结论。具体试验数据见表一和表二。

病情分级：

生长期地上部观察：除生长正常的0级植株外，其余各级植株拔根检查确证为根结线虫病后分级记载.

0级：植株生长正常；

1级：病株生长基本正常，叶缘或叶尖部分变黄但不干尖；

3级：病株比健株矮1/4至1/3，或叶片轻度干尖、干边；

5级：病株比健株矮1/3至1/2，或大部分叶片干尖、干边或有枯黄斑；

7级：病株比健株矮1/2以上，全部叶片干尖、干边或有枯黄斑；

9级：植株严重矮化，全株叶片基本干枯.

收获期检查植株根部并进行分级.

0级：根部正常，无可见根结；

1级：1/4以下根上有少量根结；

3级：1/4至1/3根上有少量根结；

7级：1/2以上根上有根结，少量次生根产生根结；

9级：所有根上，包括次生根上亦长满根结.

发病率＝发病株数/调查总株数×100％

病情指数＝(发病株数×该病级代表值)/(调查总株数×最高代表值)×100％

防治效果＝(对照病情指数-处理病情指数)/对照病情指数×100％

表一 不同处理对烟草根结线虫的防治

(注：以上数据均采用平均数值，下同)

表二 不同处理对烟草根结线虫的防治

通过上述二表所示，本发明坚强芽孢杆菌菌剂在烟草根结线虫的防治中具有明显且稳定的效果，能够很好的抑制烟草根结线虫的繁殖以及扩散。

实施例3

一种用于烟草根结线虫防治的坚强芽孢杆菌菌剂的应用

试验材料：

①本发明坚强芽孢杆菌菌剂的600倍稀释液；②解淀粉芽孢杆菌菌剂的600倍稀释液；③枯草芽孢杆菌菌剂的600倍稀释液；④普通市售化学杀虫剂，⑤清水(CK)；烟草品种为普通烤烟。

试验处理：

在进行移栽前，我们将剔除带虫苗以及根瘤，将剔除后的烟苗按照每株3ml剂量浸泡在各个溶液中，充分浸泡后将烟草移栽种植进行观察，将收获后的烟草的各方面数据进行统计进行比较。

通过上述试验发现本发明一种用于防治烟草根结线虫的坚强芽孢杆菌菌剂不仅能够防治烟草根结线虫，还能够很好的促进烟草品质等，详细数据如下表三所示。

表三 不同处理对烟草品质的提升

在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“示例”、“具体示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。

以上公开的本发明优选实施例只是用于帮助阐述本发明。优选实施例并没有详尽叙述所有的细节，也不限制该发明仅为所述的具体实施方式。显然，根据本说明书的内容，可作很多的修改和变化。本说明书选取并具体描述这些实施例，是为了更好地解释本发明的原理和实际应用，从而使所属技术领域技术人员能很好地理解和利用本发明。本发明仅受权利要求书及其全部范围和等效物的限制。