靶式凝胶电泳分离微纳尺度物质的方法

技术领域

本发明涉及一种靶式凝胶电泳分离微纳尺度物质的方法，具休利用靶式凝胶电泳对多种细胞、蛋白质、DNA、和核酸等微纳尺度物质进行高效分离、浓缩的方法。

背景技术

目前，针对微纳尺度物质如细胞、蛋白质、DNA和核酸等物质的分离以及浓缩在生物医疗领域以及化学领域一直是研究热点。根据微纳尺度物质表面的带电特性，从而利用电泳技术将其进行分离已成为分析化学、生物化学、临床医学等领域常用的技术。其中凝胶电泳是利用电泳来对不同蛋白质以及不同DNA分子按照相对分子质量大小不同来检测其数量和质量的技术，是一种分离鉴定蛋白质和DNA分子的重要实验手段，其中琼脂糖和聚丙烯酰胺凝胶电泳是最主要的方式，根据目标物通过凝胶时因自身尺寸差异及电泳迁移率不同，从而实现分离。该技术能够用于分离、鉴定和纯化DNA片段，操作简单而迅速，已经成为许多通用的分子生物学研究方法，如DNA重组、DNA核苷酸序列分析、DNA限制性内切酶分析及限制性酶切作图等的技术基础。然而传统的水平板琼脂糖凝胶以及聚丙烯酰胺凝胶电泳装置难以实现多种物质的快速分离和高度浓缩，此外对于样品的纯化解析需要繁冗复杂的后续样品处理步骤，因此在传统的凝胶电泳基础上，利用凝胶作为电介质开发一种新型凝胶电泳装置实现对微纳尺度物质的一步分离和浓缩尤为必要。。

发明内容

本发明的目的是为了解决传统水平板凝胶电泳上样量低、难以在同一个凝胶上实现对微纳尺度物质的一步分离浓缩、纯化的步骤复杂等缺点，从而提出的一种靶式凝胶电泳分离微纳尺度物质方法。

为了实现上述目的，提供如下技术方案：

1、一种靶式凝胶电泳分离微纳尺度物质的方法，包括如下步骤：

①提供靶式凝胶分离装置槽，将一定浓度的凝胶放入制备好的圆盘配胶板中，插入样品槽模具，凝胶自然冷却形成圆盘型凝胶，然后拔掉样品槽模具；

②在制备好的圆盘型凝胶中放置外环电极和中心电极，电极与电源连接，使圆盘凝胶中形成非匀强电场；

③加入电泳缓冲溶液后，进行上样并电泳分离，微纳尺度物质在碱性缓冲溶液条件下表面带负电荷，在凝胶中向中心正电极运动；

④调节所施加的电参数调控目标物的泳动速度及路径，较小分子量的目标分子将率先到达中心电极附近进行浓缩，较大分子量的目标分子将最后到达中心电极处浓缩；调节凝胶浓度调控分离条带展宽；调节加电时间实现样品组分分步在圆心处进行浓缩；调节缓冲溶液浓度来调控离子强度控制目标分子的带电量及运动速度。

进一步的，所述的非均匀电场，在圆盘凝胶圆心处的电场强度最大。

进一步的，所述的圆盘配胶板的直径范围在1 cm-30 cm。

进一步的，外环电极和中心电极材质为铂、银或铜材质。

进一步的，凝胶为琼脂糖凝胶，凝胶浓度在0.5-3.0％。

进一步的，所述的样品槽模具是圆环形状样品槽模具或者是锯齿形样品槽模具。

进一步的，电参数为：电源为直流电源或交流电源，直流电压1-200 V，交流电压0-200V、频率0-100Hz、Duty值1-99％、时间1-90 min。

进一步的，不同的微纳尺度物质目标分子在一定的电泳条件下，在非均匀电场条件下分离并形成靶式分布条带，随着电泳时间增加将先后到达中心电极附近进行浓缩。

本发明通过利用圆盘模具制备凝胶，使目标样品在靶式凝胶电泳中根据自身大小及电泳迁移率不同在凝胶中形成靶式条带，通过在凝胶内形成的非均匀电场调控实验参数从而实现对同种及不同种类微纳尺度物质的分离、浓缩的方法。由此不同分子量的目标分子在一定的电泳条件下形成靶式分布条带，随着电泳时间增加将先后到达中心电极附近进行浓缩。相比于垂直板凝胶电泳， 相同尺寸的靶式凝胶电泳可以同时实现分离和浓缩，且浓缩量以及分离效率是垂直板装置的三倍。所以，该装置可实现对同种微纳尺度物质的分离、浓缩和纯化，也可实现对不同种类微纳尺度物质的同时分离。

由于采用上述技术方案，本发明提供的靶式凝胶电泳分离微纳尺度物质方法具有如下优点：利用非匀强电场来实现对样品的分离和浓缩，通过调控电场参数，实现带电目标分子的定向运动并形成靶式分布条带，实现同时分离和浓缩。且电泳装置和凝胶可根据不同的目标分子进行更换，分离方法简单，高通量，无需繁琐的处理步骤，经济安全。

本发明以琼脂糖凝胶为例，该技术利用琼脂糖凝胶对DNA和核酸等微纳尺度物质进行分离。其中琼脂糖凝胶具有亲水性，且不带电荷，是一种很好的电泳支持物。不同的DNA、病毒和酶复合物等在碱性缓冲液条件下带有负电荷，以DNA为例，在受到圆环外电极指向圆心内电极所形成的非均匀电场作用下，DNA通过凝胶介质向正极移动。由于DNA之间的分子量和构型不同，在电场中泳动速率不同，通过琼脂糖凝胶的孔径路径存在差异从而实现分离。该方法形成的非均匀电场在凝胶内形成电场梯度，在圆心处电场强度强于外环电场强度，利用电场方向指向圆心即可将点样环内样品集中富集到圆心处进行浓缩，达到对不同目标组分进行聚焦浓缩处理，实现同时分离和浓缩的目的。该方法可实现对同种微纳尺度物质的分离、浓缩和纯化，也可实现对不同种类微纳尺度物质的同时分离。通过调节电参数（电压施加方式、电压大小、频率、Duty值）、凝胶的浓度、加电时间等参数实现组分的分离和浓缩。

下面结合附图和实例对本发明进一步说明。

附图说明

图1是制备琼脂糖凝胶样品槽所用的样品槽模具俯视图。

图2是制备同种目标物的圆环形状样品槽模具截面图。

图3是制备不同种目标物的锯齿形状样品槽模具截面图。

图4是靶式凝胶装置在缓冲液中加电示意图。

图5是靶式凝胶电泳在圆环样品槽内进样装置示意图。

图6是目标物在圆环进样加电后形成的靶式分布的运动情况示意图。

图7是靶式凝胶电泳在锯齿样品槽内进样装置示意图。

图8是不同目标物在锯齿形进样加电后形成的靶式分布的运动情况示意图。

图1-3中，1、手把，2、挖孔模具，3、样品槽模具，4、圆环形样品模具，5、锯齿形样品模具。

图4-8中，6、中心电极，7、外环电极，8、DNA等微纳尺度物质，9、凝胶，10、缓冲溶液，11、电源，12、组分A-1，13、组分A-2，14、组分A-3，15、组分A-4，16、组分A-5，17、组分B，18、组分C, 19、组分D，20、组分E，21、组分F，22、组分G，23、组分H，24、组分I。

具体实施方式

一种靶式凝胶电泳分离微纳尺度物质的方法，其具体实施方式如图1至图8所示，其中包括如下步骤：

①提供靶式凝胶分离装置：准备手持手把1附带挖孔模具2和电泳槽所用的样品槽模具3，如图1所示，样品槽模具3可以制备成圆环形样品模具4（如图2）和锯齿形样品模具5（如图3），其中挖孔模具2的高度比圆环形样品模具4和锯齿形样品模具5高1mm。根据待分离的样品组分的最佳线性DNA分辨范围（bp）来选择琼脂糖浓度0.5%~3.0%后将琼脂糖按照比例配置在TAE或TAB缓冲液中，用沸水浴或微波炉配制，低浓度用于进行大片段核酸的电泳，高浓度的用来进行小片段分析，待胶冷却至50-60℃时，加入凝胶溶液的1/10微升核酸染色剂（Gelview）轻轻摇匀，避免产生气泡。之后将配置的溶液灌入圆盘配胶板或垂直胶膜，所述的圆盘配胶板的直径范围在1 cm-30 cm，插入样品槽模具3，自然冷却。样品制备与加样品时，将DNA、蛋白质、核酸等样品在缓冲液中加入样品槽孔内，如图5和7所示。

②在圆盘凝胶电泳装置中圆心处放置中心电极6与外环电极7，所述的外环电极和中心电极材质为铂、银或铜材质，将电极装置的正极连接中心电极6，负极连接外环电极7，施加电源11使其内部形成非匀强电场，在圆盘凝胶圆心处的电场强度最大，在缓冲溶液10中，DNA等微纳尺度物质8在凝胶9内加电装置示意图如图4所示。

③ 具体的靶式凝胶电泳分离方法对DNA、核酸和病毒分离时，由于DNA等微纳尺度物质8在碱性缓冲溶液10条件下带有负电荷，受到电场的影响，不同样品组分受到指向圆心的电场力，根据分子量大小不同，目标分子从小到大在凝胶9内部依次展开。如图5和6所示，DNA等微纳尺度物质8在电场的作用下根据分子大小形成以组分A-1 12，组分A-2 13，组分A-3 14，组分A-4 15，组分A-5 16的靶式分布条带。其中小分子量的组分A-1 12优先到达中心电极6，较大分子量组分A-5 16最后到达中心电极6处进行浓缩。不同分子量的各个组分按照加电时间的不同，在非匀强电场作用下，依次在圆心处进行浓缩。

④ 对于不同种类微纳尺度物质如组分B 17、组分C 18、组分D 19、组分E 20、组分F 21、组分G 22、组分H 23、组分I 24，可以在凝胶9上设计如图7的上样装置。在控制电泳的条件下，最终形成如图8的靶式分布条带，实现对多种微纳尺度物质的高效分离。

⑤ 针对DNA等微纳尺度样品，通过调节所施加的电参数（电场方式、电压、频率、Duty值、时间）调控目标物的泳动速度及路径；通过调节凝胶浓度调控分离条带展宽的问题；通过调节加电时间实现样品组分分步在圆心处进行浓缩；通过调节缓冲溶液调控离子强度控制目标分子的带电量及运动速度。所述的电参数为：电源为直流电源或交流电源，直流电压1-200 V，交流电压0-200V、频率0-100Hz、Duty值1-99％、时间1-90 min。

综上，不同分子量的目标分子在一定的电泳条件下形成靶式分布条带，随着电泳时间增加将先后到达中心电极附近，并实现同时分离和浓缩。该方法可实现对同种微纳尺度物质的分离、浓缩和纯化，也可实现对不同种类微纳尺度物质的同时分离。

以上所述仅为本发明的优选实施例，本发明也不限于上述举例。本技术领域的普通技术人员在本发明的实质范围内，做出的修改、变化或替换，均应包含在本发明的保护范围之内。