核酸组合物和检测试剂盒

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别是涉及一种核酸组合物和检测试剂盒。

背景技术

人乳头瘤病毒(Human Papilloma Virus，HPV)是一种小分子的、无被膜包被的环状双链DNA病毒，基因组长约8000碱基对(bp)，分为三个功能区，即早期转录区(E区)、晚期转录区(L区)和非转录区(长控制区，LCR)。

目前，HPV已被发现的有200多种型别，大部分型别感染人体后不表现出明显的症状，少数部分型别有病毒感染的表现，例如引起皮肤的多种乳头状瘤或疣及生殖道上皮增生性损伤。依据WHO国际癌症研究机构(IARC)及其他国际组织的研究成果，国家药品监督管理局医疗器械技术审评中心发布的《人乳头瘤病毒(HPV)核酸检测及基因分型、试剂技术审查指导原则》将HPV16、HPV18、HPV31、HPV33、HPV35、HPV39、HPV45、HPV51、HPV52、HPV56、HPV58、HPV59和HPV68列为高危型别，HPV26、HPV53、HPV66、HPV73、HPV82列为中等风险型别。其中，高危型别的HPV持续性感染是导致宫颈上皮内瘤变及宫颈癌的主要原因。

在临床上，HPV核酸检测主要用于ASC-US(意义未确定的非典型鳞状上皮细胞)人群分流、宫颈癌联合筛查和宫颈癌初筛，主要检测方法主要有杂交捕获、酶切信号放大法、实时荧光定量PCR法、HPVE6/E7表达检测法等。

其中，杂交捕获法是美国Digene公司的检测HPV-DNA的技术，是目前获得美国FDA批准可在临床使用的一种检测HPV-DNA的检测技术。杂交捕获法利用Hybrid Capture的液体杂交和普通引物PCR之后线性探针测试被认为是针对于诊断目的最合适的方法。商业化的Hybrid Capture试剂盒无须PCR扩增即可检出临床样品中的HPV-DNA，并且可区别出高危型和低危型。但是，使用RNA探针可能会影响试剂盒的稳定性，并且也不能排除交叉反应的可能。

酶切信号放大法是由美国HOLOGIC公司开发，被美国FDA批准应用于临床检测HPV的DNA的检测技术，该方法具有较高的敏感性，对子宫颈癌前病变的阴性预测值也较高，但方法无法判断病毒是否处于感染阶段及病毒是否致癌，容易导致过度医疗，同时也增加了对HPV不是很了解的患者的焦虑和担忧，且其特异性较差，容易误诊。

HPVE6/E7表达检测法是美国FDA已于2012年批准的全球第一个基于E6、E7 mRNA的高危型HPV检测试剂盒-AptimaHPV。E6和E7基因首先转录大量的mRNA，然后再由mRNA翻译成相应的致癌蛋白，该蛋白通过抑制抑癌蛋白p53和视网膜母细胞瘤蛋白(pRb)使被感染的细胞可无限增殖并恶性转变，所以E6和E7的mRNA的大量表达是细胞发生高级别病变的一个信号。此方法采用支链DNA技术测定所有患者HPV E6/E7 mRNA的表达情况。该方法敏感性较高，但特异性较低。

实时荧光定量PCR法具有快速简便，与杂交捕获相比，其检测范围更为广泛。目前已有不少厂家开发出基于实时荧光定量PCR法检测高危型HPV的产品，然而，在这些产品中，有的是针对每种高危型HPV设计一对型特异性引物和一条型特异性探针，这会急剧增加检测成本，同时大量探针的存在也会显著增加背景荧光信号；有的是进行多管检测，这会显著增加样品和检测试剂的用量，也会增加检测成本，并且这些产品的灵敏度和特异性也较低。

发明内容

基于此，有必要提供一种核酸组合物，该核酸组合物能够提高实时荧光定量PCR法检测HPV时的灵敏度和特异性，且应用于检测时，检测成本低。

一种核酸组合物，包括检测引物对，所述检测引物对包括如下四组引物对中的至少两组：

A组引物对：用于扩增HPV31、HPV35、HPV16、HPV33、HPV58和HPV52中至少两种病毒的同源保守区；

B组引物对：用于扩增HPV59、HPV45、HPV18、HPV39和HPV68中至少两种病毒的同源保守区；

C组引物对：用于扩增HPV51的基因L1上的核酸片段；及

D组引物对：用于扩增HPV56、HPV66和HPV53中至少两种病毒的同源保守区。

上述核酸组合物包括A组引物对、B组引物对、C组引物对及D组引物对中的至少两种，能够对高中危HPV病毒进行初筛，并且，与同一体系中一个型别对应一个探针的产品相比，上述核酸组合物在使用时每组引物对对应一条探针，不必每种型别一种探针，大大减少了体系中探针的量，降低了检测过程中各引物和探针相互干扰的风险，提高了检测的灵敏度和特异性；与多管检测的产品相比，检测所用的样品和试剂用量少，减少试剂成本。所以，上述核酸组合物用于检测HPV病毒时特异性好，灵敏度高且成本低。

在其中一个实施例中，所述A组引物对用于扩增核苷酸序列如SEQIDNo.1所示的核酸片段，所述B组引物对用于扩增核苷酸序列如SEQIDNo.2所示的核酸片段，所述C组引物对用于扩增所述基因L1上的核苷酸序列如SEQIDNo.3的核酸片段，所述D组引物对用于扩增核苷酸序列如SEQIDNo.4所示的核酸片段。

在其中一个实施例中，所述A组引物对包括：核苷酸序列如SEQIDNo.5及SEQIDNo.6所示的HPV31引物对、核苷酸序列如SEQIDNo.7及SEQIDNo.8所示的HPV35引物对、核苷酸序列如SEQIDNo.9及SEQIDNo.10所示的HPV16引物对、核苷酸序列如SEQIDNo.11及SEQIDNo.12所示的HPV33引物对、核苷酸序列如SEQIDNo.13及SEQIDNo.14所示的HPV58引物对、和核苷酸序列如SEQIDNo.15及SEQIDNo.16所示的HPV52引物对中的至少一种；

及/或，所述B组引物对包括：核苷酸序列如SEQIDNo.17及SEQIDNo.18所示的HPV59引物对、核苷酸序列如SEQIDNo.19及SEQIDNo.20所示的HPV45引物对、核苷酸序列如SEQIDNo.21及SEQIDNo.22所示的HPV18引物对、核苷酸序列如SEQIDNo.23及SEQIDNo.24所示的HPV39引物对、和核苷酸序列如SEQIDNo.25及SEQIDNo.26所示的HPV68引物对中的至少一种；

及/或，所述C组引物对的引物如SEQIDNo.27和SEQIDNo.28所示；

及/或，所述D组引物对包括：核苷酸序列如SEQIDNo.29及SEQIDNo.30所示的HPV56引物对、核苷酸序列如SEQIDNo.31及SEQIDNo.32所示的HPV66引物对、和核苷酸序列如SEQIDNo.33及SEQIDNo.34所示的HPV53引物对中的至少一种。

在其中一个实施例中，还包括与所述检测引物对对应的探针。

在其中一个实施例中，所述A组引物对的探针的核苷酸序列如SEQIDNo.35所示，所述B组引物对的探针的核苷酸序列如SEQIDNo.36所示，所述C组引物对的探针的核苷酸序列如SEQIDNo.37所示，所述D组引物对的探针的核苷酸序列如SEQIDNo.38所示；

所述A组引物对的探针、所述B组引物对的探针、所述C组引物对的探针和所述D组引物对的探针上均连接有荧光基团，且所述A组引物对的探针、所述B组引物对的探针、所述C组引物对的探针和所述D组引物对的探针上的荧光基团各不相同。

在其中一个实施例中，所述A组引物对的探针、所述B组引物对的探针、所述C组引物对的探针和所述D组引物对的探针上的荧光基团分别独立地选自FAM、TET、VIC、JOE、HEX、Cy3、Cy3.5、Cy5、Cy5.5、TAMRA、ROX和TexasRed中的一种。

在其中一个实施例中，所述A组引物对的探针上的荧光基团为FAM，所述B组引物对的探针上的荧光基团为VIC、所述C组引物对的探针上的荧光基团为TexasRed，所述D组引物对的探针上的荧光基团为Cy5。

在其中一个实施例中，所述核酸组合物还包括内标引物对和与所述内标引物对对应的探针，且所述内标引物对对应的探针上标记的荧光基团与其他探针也不同。

一种检测试剂盒，包括上述的核酸组合物。

在其中一个实施例中，还包括PCR反应缓冲液、DNA提取试剂、PCR稳定剂及PCR增强剂中的至少一种。

附图说明

图1为实施例1中的进化树；

图2～图5为测试一中的15种HPV病毒的扩增曲线；

图6～图7为测试二中的18种HPV病毒的扩增曲线；

图8为测试二中的其他病原体的扩增曲线；

图9～图10为测试三种的13种HPV病毒的扩增曲线。

具体实施方式

为了便于理解本发明，下面将对本发明进行更全面的描述，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使本发明公开内容更加透彻全面。

除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。

本发明一实施方式提供了一种核酸组合物，该组合物能够提高实时荧光定量PCR法检测HPV时的灵敏度和特异性。具体地。该核酸组合物包括检测引物对，检测引物对包括以下四组引物对中的至少两组：A组引物对、B组引物对、C组引物对和B组引物对。其中，A组引物对、B组引物对、C组引物对和B组引物对所扩增的核酸片段各不同。A组引物对、B组引物对、C组引物对和B组引物对所扩增的核酸片段的分组是通过对高中危型HPV(16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、68、53和66)的基因组进行比对，并构建进化树之后，将同源性较近的型别编在同一组的。

具体地，A组引物对用于扩增HPV31、HPV35、HPV16、HPV33、HPV58和HPV52中至少两种病毒的同源保守区。

在其中一个实施例中，A组引物对用于扩增核苷酸序列如SEQ ID No.1所示的核酸片段。核苷酸序列如SEQ ID No.1所示的核酸片段位于HPV31、HPV35、HPV16、HPV33、HPV58和HPV52的基因E1上，可以作为A组引物对扩增的目的核酸片段(靶点)。可选地，A组引物对包括：核苷酸序列如SEQ ID No.5及SEQ ID No.6所示的HPV31引物对、核苷酸序列如SEQ IDNo.7及SEQ ID No.8所示的HPV35引物对、核苷酸序列如SEQ ID No.9及SEQ ID No.10所示的HPV16引物对、核苷酸序列如SEQ ID No.11及SEQ ID No.12所示的HPV33引物对、核苷酸序列如SEQ ID No.13及SEQ ID No.14所示的HPV58引物对、和核苷酸序列如SEQ ID No.15及SEQ ID No.16所示的HPV52引物对中的至少一种。可以理解的是，针对核苷酸序列如SEQID No.1所示的核酸片段的HPV31引物对、HPV35引物对、HPV16引物对、HPV33引物对、HPV58引物对和HPV52引物对的引物序列不限于上述所列举，还可以是其他可行的引物序列，只要能扩增出HPV31、HPV35、HPV16、HPV33、HPV58和HPV52基因组上的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示的核酸片段即可。

另外，在此实施例中，A组引物对中的HPV31引物对、HPV35引物对、HPV16引物对、HPV33引物对、HPV58引物对和HPV52引物对扩增的目的片段均是核苷酸序列如SEQ ID No.1所示的核酸片段，也即是靶点均为核苷酸序列如SEQ ID No.1所示的核酸片段。当然，在其他实施例中，A组引物对的扩增的目的片段不限于核苷酸序列如SEQ ID No.1所示的核酸片段，还可以是HPV31、HPV35、HPV16、HPV33、HPV58和HPV52中至少两种病毒的其他同源保守区。

在其中一个实施例中，A组引物对包括：核苷酸序列如SEQ ID No.5及SEQ ID No.6所示的HPV31引物对、核苷酸序列如SEQ ID No.7及SEQ ID No.8所示的HPV35引物对、核苷酸序列如SEQ ID No.9及SEQ ID No.10所示的HPV16引物对、核苷酸序列如SEQ ID No.11及SEQ ID No.12所示的HPV33引物对、核苷酸序列如SEQ ID No.13及SEQ ID No.14所示的HPV58引物对、和核苷酸序列如SEQ ID No.15及SEQ ID No.16所示的HPV52引物对中的至少两种。

具体地，B组引物对用于扩增HPV59、HPV45、HPV18、HPV39和HPV68中至少两种病毒的同源保守区。

在其中一个实施例中，B组引物对用于扩增核苷酸序列如SEQ ID No.2所示的核酸片段。核苷酸序列如SEQ ID No.2所示的核酸片段位于HPV59、HPV45、HPV18、HPV39和HPV68的基因E2上，可以作为B组引物对扩增的目的片段(靶点)。可选地，B组引物对包括：核苷酸序列如SEQ ID No.17及SEQ ID No.18所示的HPV59引物对、核苷酸序列如SEQ ID No.19及SEQ ID No.20所示的HPV45引物对、核苷酸序列如SEQ ID No.21及SEQ ID No.22所示的HPV18引物对、核苷酸序列如SEQ ID No.23及SEQ ID No.24所示的HPV39引物对、和核苷酸序列如SEQ ID No.25及SEQ ID No.26所示的HPV68引物对中的至少一种。可以理解的是，针对核苷酸序列如SEQ ID No.2所示的核酸片段的HPV59引物对、HPV45引物对、HPV18引物对、HPV39引物对和HPV68引物对的引物序列不限于上述列举，还可以是其他的引物序列，只要能扩增出HPV59、HPV45、HPV18、HPV39和HPV68的基因组上核苷酸序列如SEQ ID No.2所示的核酸片段即可。

另外，在此实施例中，B组引物对中的HPV59引物对、HPV45引物对、HPV18引物对、HPV39引物对和HPV68引物对扩增的目的片段均是核苷酸序列如SEQ ID No.2所示的核酸片段。当然，在其他实施例中，B组引物对扩增的目的片段不限于核苷酸序列如SEQ ID No.2所示的核酸片段，还可以是HPV31、HPV35、HPV16、HPV33、HPV58和HPV52中至少两种病毒的其他同源保守区。例如，B组引物对用于扩增HPV31、HPV35、HPV16、HPV33、HPV58和HPV52上核苷酸序列如SEQ ID No.39所示的核酸片段，核苷酸序列如SEQ ID No.39所示的核酸片段位于HPV59、HPV45、HPV18、HPV39和HPV68的基因E2上，可以作为B组引物对扩增的另一个目的核酸片段(另一个靶点)。

在其中一个实施例中，B组引物对包括：核苷酸序列如SEQ ID No.17及SEQ IDNo.18所示的HPV59引物对、核苷酸序列如SEQ ID No.19及SEQ ID No.20所示的HPV45引物对、核苷酸序列如SEQ ID No.21及SEQ ID No.22所示的HPV18引物对、核苷酸序列如SEQ IDNo.23及SEQ ID No.24所示的HPV39引物对、和核苷酸序列如SEQ ID No.25及SEQ ID No.26所示的HPV68引物对中的至少两种。

具体地，C组引物对用于扩增HPV51的基因L1上的核酸片段。可选地，C组引物对用于扩增基因L1上的核苷酸序列如SEQ ID No.3的核酸片段。此时，C组引物对扩增的目的片段为核苷酸序列如SEQ ID No.3的核酸片段。在一个具体地的示例中，C组引物对的引物如SEQ ID No.27和SEQ ID No.28所示。当然，针对核苷酸序列如SEQ ID No.3的核酸片段的引物序列对不限于SEQ ID No.27～28，还可以是其他可行的引物序列，只要能扩增出HPV51的基因L1上的核苷酸序列如SEQ ID No.3的核酸片段即可。当然，在其他实施例中，C组引物对扩增的目的片段不限于核苷酸序列如SEQ ID No.3的核酸片段，还可以是基因L1上的其他核酸片段。

具体地，D组引物对用于扩增HPV56、HPV66和HPV53中至少两种病毒的同源保守区。

在其中一个实施例中，D组引物对用于扩增核苷酸序列如SEQ ID No.4所示的核酸片段。核苷酸序列如SEQ ID No.4所示的核酸片段位于HPV56、HPV66和HPV53的基因E6上，可以作为D组引物对扩增的目的核酸片段(靶点)。可选地，D组引物对包括：核苷酸序列如SEQID No.29及SEQ ID No.30所示的HPV56引物对、核苷酸序列如SEQ ID No.31及SEQ IDNo.32所示的HPV66引物对、和核苷酸序列如SEQ ID No.33及SEQ ID No.34所示的HPV53引物对中的至少一种。可以理解的是，针对核苷酸序列如SEQ ID No.4所示的核酸片段的HPV56引物对、HPV66引物对和HPV53引物对的引物序列不限于上述列举，还可以是其他可行的引物序列，只要能扩增出HPV56、HPV66和HPV53基因组上的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示的核酸片段即可。

另外，在此实施例中，D组引物对中的HPV56引物对、HPV66引物对和HPV53引物对的目的片段均是核苷酸序列如SEQ ID No.4所示的核酸片段。当然，在其他实施例中，D组引物对扩增的目的片段不限于核苷酸序列如SEQ ID No.4所示的核酸片段，还可以针对HPV56、HPV66和HPV53中的至少两种病毒的其他同源保守区。例如核苷酸序列如SEQ ID No.40～48所示的核酸片段中的任意一种。核苷酸序列如SEQ ID No.40～48所示的核酸片段均是HPV56、HPV66和HPV53的同源保守区。

在其中一个实施例中，D组引物对包括：核苷酸序列如SEQ ID No.29及SEQ IDNo.30所示的HPV56引物对、核苷酸序列如SEQ ID No.31及SEQ ID No.32所示的HPV66引物对、和核苷酸序列如SEQ ID No.33及SEQ ID No.34所示的HPV53引物对中的至少两种。

进一步地，检测引物对包括A组引物对、B组引物对、C组引物对和B组引物对中的至少三种。更进一步地，检测引物对包括A组引物对、B组引物对、C组引物对和B组引物对。

在一些实施例中，上述核酸组合物还包括与检测引物对对应的探针。进一步地，与检测引物对对应的探针为Taqman探针。具体地，A组引物对的探针的核苷酸序列如SEQ IDNo.35所示，B组引物对的探针的核苷酸序列如SEQ ID No.36所示，C组引物对的探针的核苷酸序列如SEQ ID No.37所示，D组引物对的探针的核苷酸序列如SEQ ID No.38所示。A组引物对的探针、B组引物对的探针、C组引物对的探针和D组引物对的探针上均连接有荧光基团，A组引物对的探针、B组引物对的探针、C组引物对的探针和D组引物对的探针上的荧光基团各不相同。更具体地，探针上的荧光基团位于探针的5’端。

可选地，A组引物对的探针、B组引物对的探针、C组引物对的探针和D组引物对的探针上的荧光基团分别独立地选自FAM、TET、VIC、JOE、HEX、Cy3、Cy3.5、Cy5、Cy5.5、TAMRA、ROX和Texas Red中的一种。当然，与检测引物对对应的探针上还连接有猝灭基团，猝灭基团位于探针的5’端。可选地，淬灭基团选自BHQ0、BHQ1、BHQ2、BHQ3、MGB、Dabcyl、Eclipse或NFQ。

在一个可选地具体示例中，A组引物对的探针上的荧光基团为FAM，B组引物对的探针上的荧光基团为VIC、C组引物对的探针上的荧光基团为Texas Red，D组引物对的探针上的荧光基团为Cy5。进一步地，A组引物对的探针、B组引物对的探针、C组引物对的探针及D组引物对的探针上的猝灭基团均为MGB。

在一些实施例中，上述核酸组合物还包括内标引物对和与内标引物对对应的探针。内标引物对和与内标引物对对应的探针用作内参，提高检验的可靠性。可选地，内标引物对对应的探针上标记的荧光基团与其他探针也不同。

上述核酸组合物至少具有如下优点：1)能够区分A组(HPV31、HPV35、HPV16、HPV33、HPV58和HPV52)、B组(HPV59、HPV45、HPV18、HPV39和HPV68)、C组(HPV51)和D组(HPV56、HPV66和HPV53)的HPV，实现对HPV16、HPV18、HPV31、HPV33、HPV35、HPV39、HPV45、HPV51、HPV52、HPV56、HPV58、HPV59、HPV68、HPV53和HPV66初筛；2)上述核酸组合物中的所有引物对和探针可以在同一个体系中进行PCR，且每组引物对对应一条探针，不必每种型别一种探针，大大减少了体系中探针的量，降低了检测过程中各引物和探针相互干扰的风险，提高了检测的灵敏度和特异性；同时检测所用的样品和试剂用量少，减少试剂成本，因此，上述核酸组合物的成本较低。

本发明一实施方式还提供了一种检测试剂盒，包括上述任一核酸组合物。在核酸组合物含有四组(A组～D组)引物对时，该检测试剂盒将HPV16、HPV18、HPV31、HPV33、HPV35、HPV39、HPV45、HPV51、HPV52、HPV56、HPV58、HPV59、HPV68、HPV53和HPV66分至少为两组，其中，HPV31、HPV35、HPV16、HPV33、HPV58和HPV52为A组，HPV59、HPV45、HPV18、HPV39和HPV68为B组，HPV51为C组，HPV56、HPV66和HPV53为D组。当待测样品中的HPV的型别为HPV31、HPV35、HPV16、HPV33、HPV58和HPV52中的至少一种时，在A组探针对应的荧光下可以见到扩增产物；当待测样品中的型别为HPV59、HPV45、HPV18、HPV39和HPV68中的至少一种时，在B组探针对应的荧光下可见到扩增产物；当待测样品中的型别为HPV51时，在C组探针对应的荧光下可以见到扩增产物；当待测样品中的型别为HPV56、HPV66和HPV53中的至少一种时，在D组探针对应的荧光下可以见到扩增产物。

上述检测试剂盒能够区分A组～D组的HPV，可以用于HPV型别的初筛，灵敏度和特异性好，准确性高。

在一些实施例中，上述检测试剂盒还包括PCR反应缓冲液、DNA提取试剂、PCR稳定剂及PCR增强剂中的至少一种。具体地，PCR反应缓冲液包括Tris-HCl、硫酸铵、氯化钾、Tween 20、硫酸镁、Taq DNA聚合酶、dNTPs及BSA。

具体实施例

以下结合具体实施例进行详细说明。以下实施例如未特殊说明，则不包括除不可避免的杂质外的其他组分。实施例中采用试剂和仪器如非特别说明，均为本领域常规选择。实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规条件，例如文献、书本中所述的条件或者生产厂家推荐的方法实现。

实施例1

(1)引物和探针的设计：

1)通过HPV核酸数据库PaVE(https://pave.niaid.nih.gov/)下载15种高中危型HPV(16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、68、53、66)基因组参考序列。

2)使用MAFFT多重比对工具(网络版：https://mafft.cbrc.jp/alignment/software/)对上述15种参考序列进行比对，构建进化树，结果如图1所示。

3)根据进化树，将同源性较近的HPV基因组编为一组，共编4种，即HPV31、HPV35、HPV16、HPV33、HPV58和HPV52为A组，HPV59、HPV45、HPV18、HPV39和HPV68为B组，HPV51为C组，HPV56、HPV66和HPV53为D组。

4)在A组、B组和D组组内分别进行多重比对，在各组内分别发现多个保守序列，具体如下表1所示。

表1

5)选取核苷酸序列如SEQ ID No.1所示的核酸片段作为A组扩增的目的片段，核苷酸序列如SEQ ID No.2所示的核酸片段作为B组扩增的目的片段，核苷酸序列如SEQ IDNo.4所示的核酸片段作为D组扩增的目的片段，采用Primer Express软件辅助MGB探针设计，得到各组的探针，具体如表2所示。

表2

为了采集荧光信息，在表2中的探针的5’端标记荧光基团，3’端标记淬灭基因。具体地，HPV_P_A探针5’标记FAM基团，3’端标记MGB基团，HPV_P_B探针5’标记VIC基团，3’端标记MGB基团，HPV_P_D探针5’端标记CY5基团，3’端标记MGB基团。

6)探针确定后，在各HPV病毒基因组的保守序列两侧设计引物。各HPV病毒的引物具体如表3所示。

表3

7)对于C组，组内仅一种基因型，即HPV51，在其保守基因L1进行引物设计。具体地，以核苷酸序列如SEQ ID No.3所示的核酸片段为扩增的目的片段进行引物和探针的设计，得到的引物和探针的核苷酸序列如表4所示。另外，为了采集荧光信息，在HPV51P探针的5’端标记TEXAS，3’端标记MGB。

表4

测试一

(1)收集15种单一型别的HPV病毒(高中危型)临床样本：HPV16、HPV18、HPV31、HPV33、HPV35、HPV39、HPV45、HPV51、HPV52、HPV56、HPV58、HPV59、HPV68、HPV53和HPV66。

(2)采用刚竹医疗的病毒提取试剂盒分别提取各临床样本中HPV的核酸，各型别的HPV的核酸提取具体步骤包括：1)1.5mL离心管内加入800μL裂解液LB；2)加入200μL样品，振荡混匀，静置2min，插入磁力架，静置2min，去除上清，尽量去除管盖和管内残液；3)加入800μL洗涤液W1，从磁力架取出离心管，混匀，放上磁力架，静置1min，去除上清，尽量去除管盖和管内残液；4)加入800μL洗涤液W2，从磁力架取出离心管，混匀，插入磁力架，静置1min，去除上清，尽量去除管盖和管内残液；5)加入100μL洗脱液EB，从磁力架取出离心管，混匀，静置2min，插入磁力架，静置1min，得到澄清的溶液，即为核酸溶液。

(3)配制PCR的预混液，预混液的组成如表5所示。表5中的引物的核苷酸序列、探针的核苷酸序列及标记基团如实施例1所示，“mM”表示mmol/L，“uM”表示μmol/L。

表5

预混液制备结束后，将预混液分装为15管，每管45μL，并在各管上标记不同的15种HPV病毒对应的型别。

(4)在步骤(3)得到的各管预混液中加入5μL步骤(2)制得的对应型别的HPV的核酸，混匀后放入荧光PCR仪中进行扩增，扩增程序如表6所示，结果如图2～图5所示，其中图2为A组的扩增曲线(FAM)，图3为B组的扩增曲线(VIC)，图4为C图的扩增曲线(Texas)，图4为D组的扩增曲线(CY5)。

表6

由图2～图5可知，15种HPV病毒均被检出。

测试二

(1)收集18种单一型别的含HPV病毒的临床样本及8种含有容易干扰HPV病毒检测的其他病原体临床样本，18种HPV病毒的型别为HPV6、HPV11、HPV26、HPV40、HPV42、HPV43、HPV44、HPV54、HPV61、HPV67、HPV58、HPV69、HPV70、HPV71、HPV72、HPV73、HPV81、HPV82和HPV83；8种其他病原体临床样本中分别含有含白色念珠菌、单纯疱疹病毒Ⅱ型、解脲支原体、淋病奈瑟菌(淋球菌)、梅毒螺旋体、人型支原体、沙眼衣原体和阴道毛滴虫。

(2)采用与测试一中相同的方法提取步骤(1)中的26个临床样本中的病原体的核酸，按照测试一种的配方配制各临床样本对应的预混液及按照测试一种的扩增程序进行PCR扩增，结果如图6～图8所示。图6～图7为18种HPV病毒的扩增曲线，图8为其他病原体的扩增曲线。

由图6～图8可知，实施例1的引物对和探针的特异性好，对于非目标型别的HPV病毒不扩增。

测试三

(1)按照测试一中的病毒核酸的提取方法提取含有分别含有HPV31、HPV33、HPV35、HPV39、HPV45、HPV51、HPV52、HPV56、HPV58、HPV59、HPV68、HPV53和HPV66的13个样本中的HPV病毒的核酸。

(2)将步骤(1)提取的各样本的核酸分别进行梯度稀释，得到浓度为40000000copies/mL、4000000copies/mL、400000copies/mL、40000copies/mL、4000copies/mL、400copies/mL、40copies/mL和4copies/mL的样本。

(3)按照测试一中的配方配制预混液，并将各个样本的不同浓度的样本分别与预混液混合后，按照测试一中的扩增程序进行扩增，结果如图9～图10所示。

由图9～图10可知，实施例1的引物对及探针在检测HPV病毒时的灵敏度可达到400copies/mL。

以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

序列表

<110> 深圳市刚竹医疗科技有限公司

<120> 核酸组合物和检测试剂盒

<160> 48

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 28

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 1

tggaaatcct ttttctcaag gacgtggt 28

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 2

tgactctatg tgcagtacca 20

<210> 3

<211> 91

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 3

gcattgtggc gcactaatga cagcaaggtg tatttgccac ctgcacctgt gtctcgaatt 60

gtgaatacag aagaatatat cacacgcacc g 91

<210> 4

<211> 17

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 4

gccacagcaa gctagac 17

<210> 5

<211> 28

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 5

aacggaaatc cagtatatga attaagtg 28

<210> 6

<211> 24

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 6

cctcttcctc gtgcaaattt aatc 24

<210> 7

<211> 24

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 7

gaaacccagt gtatgggctt aatg 24

<210> 8

<211> 25

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 8

cctcttcctc gtgcaaattt aatct 25

<210> 9

<211> 29

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 9

ccagtgtatg agcttaatga taagaactg 29

<210> 10

<211> 24

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 10

caaagagtct ccatcgtttt cctt 24

<210> 11

<211> 26

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 11

atttgatgaa aatggtaacc cagtgt 26

<210> 12

<211> 30

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 12

tgtcctcttc ctctattaaa tctaatttgc 30

<210> 13

<211> 25

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 13

ttccatttga tgcaaatggt aatcc 25

<210> 14

<211> 25

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 14

tcgttttcct tgtcctcttc ctcta 25

<210> 15

<211> 23

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 15

ccatttgatg aaaatggcaa tcc 23

<210> 16

<211> 31

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 16

cttgtcctct tcctgtatta aatctaattt g 31

<210> 17

<211> 24

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 17

ctacagacaa gtgggaagtg catt 24

<210> 18

<211> 26

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 18

ggtatgatag ttgctcagaa gatcca 26

<210> 19

<211> 28

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 19

tggaaatagt aatacgtggg aagtacaa 28

<210> 20

<211> 27

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 20

tgtctaacaa tctgagtagc ggatacc 27

<210> 21

<211> 29

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 21

ggaagtacat tttgggaata atgtaattg 29

<210> 22

<211> 25

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 22

tgtagctgtt taacaagctg agtag 25

<210> 23

<211> 23

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 23

aggtatggga ctagtggcaa atg 23

<210> 24

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 24

ggtcgcggtg gtgtttgat 19

<210> 25

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 25

tggaaaatgg gacgtgcatt a 21

<210> 26

<211> 22

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 26

ctgtaggtcg gcaacagatt ca 22

<210> 27

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 27

gcattgtggc gcactaatga c 21

<210> 28

<211> 24

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 28

cggtgcgtgt gatatattct tctg 24

<210> 29

<211> 26

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 29

gaggatgagg atgaagtaga ccattt 26

<210> 30

<211> 24

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 30

tccaactgca ccacaaactt acac 24

<210> 31

<211> 27

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 31

agaggatgag gatgaggatg aaataga 27

<210> 32

<211> 27

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 32

cacttacaac aaggtacgtg aattagg 27

<210> 33

<211> 26

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 33

gaggatgagg atgaggatga agtaga 26

<210> 34

<211> 27

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 34

caattaggta acaaggatgt tgttcgt 27

<210> 35

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 35

aaatcctttt tctcaaggac 20

<210> 36

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 36

tgactctatg tgcagtacca 20

<210> 37

<211> 16

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 37

tgcacctgtg tctcga 16

<210> 38

<211> 16

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 38

ccacagcaag ctagac 16

<210> 39

<211> 16

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 39

accaccaggt ggtgcc 16

<210> 40

<211> 24

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 40

gaccgaaaac ggtacatata aaag 24

<210> 41

<211> 29

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 41

acagctcaga ggatgaggat gaggatgaa 29

<210> 42

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 42

tcacctgaag gtacagatg 19

<210> 43

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 43

gacagcgggt atggcaatac 20

<210> 44

<211> 24

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 44

gaaataccta tgcaaacatt tgct 24

<210> 45

<211> 27

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 45

gaaattgaaa tgcagccatt attgtct 27

<210> 46

<211> 31

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 46

catttgatgg cctatatgat atttatgcaa a 31

<210> 47

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 47

cgtaaacgta ttccctattt t 21

<210> 48

<211> 28

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 48

cttttacgcg tggttgcata aactaagg 28