用于基于血液成分制备药物制剂的方法

背景技术

条件血清(CS)是从条件外周全血制备的生物药物组合物。自体条件血清(ACS)是向同一血液供体的人给药的CS。CS具有抗炎和可能的软骨保护特性。使用CS(ACS)的疗法依赖于细胞因子和在导致某些因子积累的血液调节(即血液的与表面接触的培育)时形成的其他因子。这通常是在玻璃珠存在的情况下进行的。自1990年代以来，ACS已经开始使用，最初主要用于骨关节炎和其他骨科疾病，诸如类风湿性关节炎和(退行性)脊柱障碍，在这些疾病中，ACS已经显示出对病症和疾病进展的有益疗效。通常，将来自患者的血液抽入容纳有玻璃珠的无热源注射器中，以开始细胞(特别是白细胞，诸如单核细胞)的激活。在培育后，回收血液并通过离心除去细胞。所得血清富含抗炎细胞因子，诸如白介素(IL)-1受体拮抗剂(IL-1Ra)、IL-4、IL-10和IL-13，以及多种生长因子，包括胰岛素类生长因子-1，血小板衍生生长因子和转化生长因子-β1，并且血清诸如通过关节内注射返回至同一患者，例如进入受影响区域。IL-1Ra是细胞因子IL-1的天然存在的抑制剂。IL-1被认为是炎症、疼痛和组织破坏的重要介质。

在骨科疾病的发病中，生物力学因子发挥了作用。此外，在发病机理中，整个细胞因子级联的激活是重要的。一个关键的过程是影响透明软骨破坏的细胞因子的局部释放。这导致促炎因子和破坏性因子的额外产生，并因此进一步导致透明软骨破坏。由于IL-1β是许多炎症和退行性疾病的关键介质，因此治疗策略着重于抵消其生物活性。抑制IL-1β作用的制剂具有高的治疗潜力。各种方法是施用例如IL-1Ra、可溶形式的IL-1受体和抗炎细胞因子，诸如IL-4、IL-10和IL-13，其抑制IL-1的合成，增加IL-1Ra的合成，或两者。IL-1Ra有竞争力地抑制IL-1β，并且对I和II型IL-1受体具有亲和力。重组IL-1Ra被美国FDA批准用于类风湿性关节炎的治疗。假设在退行性疾病中局部IL-1Ra浓度过低，无法抑制软骨、肌肉、脊柱组织和其他关节结构的破坏。

ACS是一种可以改变骨关节炎发展过程(DMOAD)的药物，因此可能延迟甚至阻止对手术干预(诸如全关节置换)的需求。ACS已经显示出在骨关节炎的临床益处，骨关节炎诸如膝骨关节炎、颞下颌关节骨关节炎、髋骨关节炎和髋关节病等，并且在前交叉韧带重建手术后减小骨隧道拓宽。在动物模型和研究以及人类临床研究中，将ACS注射进入患病组织中也已经显示出对于治疗腰椎管狭窄、椎间盘突出和肌肉损伤的临床有效性和安全性。它在许多发炎病症(诸如神经炎症)中具有潜力。因此，它是减少疼痛，抑制组织退化和支持组织恢复的有用的非手术技术。

已有越来越多的证据表明，不仅IL-1Ra，而且其他因子也可能涉及CS(ACS)的临床疗效。IL-1Ra与IL-1的比例作为条件血液的质量控制参数也是有用的，该比例应至少为10：1，优选地至少为100：1。假设ACS的临床的和临床前的疗效可能归因于ACS中存在的多种因子的协同作用。疗效可能部分是由于通过将血细胞暴露于异体表面而激活内源性伤口愈合机制、诱导机制，诸如凝血级联和组织修复。可以通过重新建立健康的关节稳态来试验性地解释在骨关节炎中的长期疗效(例如，延长超过例如两年)。由于ACS的自体性质，因此风险/益处比例极佳，且无副作用必定是预料中的。

众所周知，全血和条件全血都包含外泌体。外泌体是小囊泡，其中细胞分泌至小囊泡的环境中。例如，诸如血清、尿液、唾液、腹膜液、脑脊液和滑膜液的生物液包含外泌体。CS也包含外泌体。已研究的大多数类型的细胞都能分泌外泌体。分泌通过穿过/从细胞的质膜释放而发生。根据制备它们的细胞类型，外泌体尤其包含蛋白质的可变组合。用于制备和施用外泌体的方法被描述于例如WO 2006/007529 A2中。

将ACS、来自ACS的外泌体和/或从ACS获得的不含外泌体的制剂合在一起在以下一种或更多种中是已知的：衰老的治疗或在作为抗衰老制剂使用中(WO 2018/033227 A1)，在治疗与衰老相关的障碍中(WO 2017/080668 A1)或用于通过注射进入皮肤的使用(WO2018/033226 A1)，在治疗一种或更多种选自肌肉疾病、肌腱疾病、食物不耐受、药物不耐受、涉及免疫系统的疾病、牛皮癣、慢性伤口(诸如糖尿病性溃疡)、神经性皮炎、神经系统的炎症和刺激、子宫内膜异位症、马的慢性眼部炎症(WO 2007/090569 A1)、风湿病、骨关节炎、关节病症和疾病、背部疼痛(例如由于神经系统的原因)、神经骨科病症、神经根的病症、椎间盘的病症、骨科病症(WO 00/46249 A1)、腰椎根部疼痛、青少年类风湿性关节炎、类风湿性关节炎、青少年斯蒂尔症(Morbus Still)和过敏(WO 2006/007529 A2)中。ACS还广泛用于马的骨关节炎，可大大改善临床跛行并保护软骨免于退化。

与年龄相关的常见特定障碍是动脉粥样硬化、心血管疾病、癌症、听力缺陷、视力缺陷、白内障、视网膜退化(例如黄斑退化)、骨质疏松、2类型糖尿病、高血压、肝衰竭、恶病质、脊柱后凸、步态障碍、震颤、共济失调、肌张力障碍、握力下降、肌肉消瘦和头发变灰。年龄还促进神经退化和类似障碍，诸如轻度认知缺陷、阿尔茨海默氏病、脑血管疾病、帕金森氏病和肌萎缩性侧索硬化症。

尽管到目前为止取得了成功，但是仍然需要上述疾病和其他障碍的新的药物治疗。

发明内容

本发明的问题是提供用于制备药物制剂的新的方法。优选地，相对于现有技术的药物制剂，所制备的药物制剂例如在活性物质的水平或期望的因子与其他因子(诸如非期望的因子)的比例方面进行了改进。有利地，能够根据本发明制备的药物制剂具有以下中的一种或更多种：制备快、易于制备、成本有效并且本体高度兼容。

以上说明以及本文中示例性实施方式的任何描述不构成对某些实施方式或特征的任何放弃。

该问题通过用于制备药物组合物的方法来解决，该方法包括以下步骤：

(a)提供从哺乳动物收集的液体，该液体包含血液的细胞成分，

(b)提供具有内表面的容器，

(c)使所述液体与所述内表面接触，

(d)将与所述内表面接触的所述液体培育持续一培育时间，其中在所述培育时间期间使用搅拌装置将所述液体搅拌至少一次，以及

(e)在经过所述培育时间之后，通过包括(1)收集所述液体或(2)从所述液体中除去部分或全部的所述细胞成分并收集其余部分的步骤获得所述药物组合物。

在下文中，该方法也称为“本发明的方法”。

优选的“哺乳动物”是农场动物(诸如牛)、运动动物(诸如马或骆驼)、宠物(诸如猫或狗)或灵长类动物。最优选的哺乳动物是人类。

“血液的细胞成分”是指全血的任何细胞成分，无论是大量存在还是少量存在。血液的优选细胞成分是白细胞(特别是嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、淋巴细胞、B细胞、T细胞、NK细胞、树突状细胞或单核细胞)。血液的特别优选的细胞成分是单核细胞。

优选地，“液体”是血液样品。在特别优选的实施方式中，液体是血液样品，其是(i)全血样品或(ii)已经耗尽(部分地、基本上完全地或完全地)某些细胞的全血样品。在本文中，已经被耗尽的细胞优选地选自红细胞、白细胞(特别是嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、淋巴细胞、B细胞、T细胞、NK细胞、树突状细胞和/或单核细胞)和血小板。更优选地，已经被耗尽的细胞是红细胞(是缺少细胞核并因此缺少基因表达能力的细胞)，在这种情况下，液体优选地包括血小板和白细胞。在液体是已经耗尽红细胞的全血样品的情况下，优选在本发明的方法的步骤(e)中选择替代方案(1)，即在经过培育时间之后，通过收集所述液体而获得药物组合物。可选地，优选方法，其中血液的所述细胞成分包括血小板，并且步骤(e)是在经过所述培育时间之后，通过添加钙离子和/或凝血酶使所述血小板脱粒，并之后收集所述液体而获得所述药物组合物的步骤。作为脱粒的替代方案，可以使血小板溶解。

容器的“内表面”是指容器本身的内表面。特别地，容器中可能容纳有的任何颗粒(宏观颗粒、微观颗粒和/或纳米颗粒)的表面。

不需要以及最好不要添加任何外部刺激物或激活剂。在提供步骤之前，本发明的方法另外包括从所述哺乳动物收集所述液体(优选为血液样品，更优选为全血样品)的步骤。

在本发明的实施方式被描述为“包含”或“包括”某些主题，例如方法、步骤、成分或其他特征的情况下，应当理解，优选的实施方式由所述主题组成，除非上下文另有规定。

应当理解，“治疗”还包括预防。

如本文所用的“障碍”是指正常功能或外观的障碍，并且包括疾病、并发症和病症。

在与表面接触培育(调节)时，血液的细胞成分是细胞因子、外泌体和其他因子的形成和积累的原因。在液体中诱导的这些因子及其组合具有药物作用。因此，所形成的组合物是药物组合物。该组合物可以用于药物治疗。在此之前，可以从组合物中除去细胞，尽管这不是强制性的。术语“外泌体”优选另外包含其他细胞外囊泡(EV)。如上所述，调节导致外泌体的额外形成。

现在已经令人惊奇地发现，当通过培育从哺乳动物收集的包含与容器内表面接触的血液的细胞成分的液体制备药物组合物时，与静态培育(即在没有搅拌的情况下)相比，在培育期间的搅拌导致组合物的含量的差异变化。例如，许多期望的因子比非期望的因子更强烈或更快速地被诱导，这可能导致期望的因子与其他因子的比例更有利。因此，搅拌的作用是特定作用，这是意想不到的发现。活性物质(特别是期望的因子)的水平可以增加。

因此，提供了一种用于制备药物制剂的新颖且可替代的方法，其导致了与现有技术的制剂不同的制剂。该方法使制备相对于现有技术在活性物质的水平、期望因子与其他因子(诸如非期望的因子)的比例方面或其他方面改进的药物制剂成为可能。因此，新的药物治疗可用于上述或其他障碍。甚至有可能避免现有技术中由于期望因子与其他因子的不利的比例或活性物质水平太低而导致的潜在问题。

在一些实施方式中，可以设想缩短培育时间，因为具有期望特性(诸如一定水平的活性物质)的药物组合物可以更快地形成。因此，本发明方法的某些实施方式在该药物组合物快速制备方面可能是有利的。可以选择简单和现成的设备和组件来实施本发明的方法。因此，可以以容易和/或成本有效的方式制备药物组合物。由于使用了从哺乳动物收集的物质，因此可以制备具有本体高度兼容性的药物组合物，因为可以避免对本体是外来的成分。

例如，如果液体是全血样品，则由本发明的方法得到的药物组合物是某种类型的条件全血。例如，如果从条件全血中去除全部的细胞成分，则其余部分是某种类型的条件血清(优选是某种类型的自体条件血清)。由于与静态培育相比，搅拌导致组合物的含量的变化，因此这些制剂不同于现有技术的制剂。

在本发明的优选方法中，在所述药物组合物中

-在其他条件相同的情况下，外泌体的浓度高于没有搅拌的情况的浓度，优选地至少1.1倍、1.2倍、1.3倍、1.4倍、1.5倍、1.6倍、1.7倍、1.8倍、1.9倍或特别地至少2倍高，

-在其他条件相同的情况下，凝溶胶蛋白的浓度高于没有搅拌的情况的浓度，优选地至少1.1倍、1.2倍或特别地至少1.3倍高，

-在其他条件相同的情况下，消退素的浓度高于没有搅拌的情况的浓度，优选地至少1.1倍高，

-在其他条件相同的情况下，IL-1Ra的浓度高于没有搅拌的情况下的浓度，优选地至少1.1倍、1.2倍或特别地至少1.3倍高，

-在其他条件相同的情况下，抗炎介质(优选IL-1Ra)和炎症介质(优选IL-1β)的浓度中的至少一个比例高于没有搅拌的情况下的比例，优选地至少1.1倍、1.2倍、1.3倍、1.4倍、1.5倍、1.6倍、1.7倍、1.8倍、1.9倍或特别地至少2倍高，或

-炎症介质(优选IL-5或IFN-γ)的至少一个浓度与所述培育之前的炎症介质基本相同。

在另一方面，本发明涉及通过本发明的方法(特别是在本文所述的优选实施方式之一中)制备的药物组合物。下文，该药物组合物也称为“本发明的药物组合物”。

由于血液的细胞成分分泌外泌体，因此本发明的药物组合物包含外泌体。如上所述，外泌体具有治疗疗效。

借助透射电子显微镜确定的外泌体的平均直径优选在30和200nm之间，特别在50和190nm之间、在70和180nm之间、在90和160nm之间或在100和150nm之间。这种大小的外泌体是特别高疗效的基础，较大的囊泡大小可能表明有包含受损的外泌体和聚集体的成团物。然而，较大的外泌体也可能起作用。这适用于具有直径范围为200至5000nm或100至800nm的外泌体。这些较大的外泌体可以通过差速离心获得。

本发明的另一方面涉及一种制备外泌体的方法，该方法包括通过本发明的方法(特别是在本文所述的优选实施方式之一中)制备药物组合物，以及收集在该药物组合物中包含的外泌体。该方法也称为“本发明的外泌体制备方法”。

因此，在另一方面，本发明涉及通过本发明的外泌体制备方法(特别是在本文所述的优选实施方式之一中)制备的外泌体。这些外泌体也称为“本发明的外泌体”。

可以通过浓缩或分离外泌体来收集，其可以例如通过在2000至1000000g、10000至800000g、20000至600000g、50000至400000g、80000至200000g以及特别是100000g下的离心而实现，因为取决于浓缩或分离外泌体的大小，这种加速度特别适合于它们。这种离心优选地进行至少10分钟、至少30分钟、特别地至少60分钟。然后通过离心形成的沉淀物包含外泌体。然后优选地将浓缩或分离的外泌体吸收在流体(优选缓冲溶液，诸如PBS，或替代地例如血浆或血清)中。然后任选地将它们例如通过0.2μm的过滤器过滤。

不含外泌体的制剂也具有治疗疗效。因此，本发明的额外方面涉及用于制备不含外泌体的制剂的方法，该方法包括通过本发明的方法(特别是在本文所述的优选实施方式之一中)制备药物组合物，以及从药物组合物中除去包含在药物组合物中的外泌体，从而获得所述不含外泌体的制剂。本文中，该方法也称为“本发明的不含外泌体的制剂的制备方法”。

在再一方面，本发明涉及通过本发明的不含外泌体的制剂制备方法(特别是在本文所述的优选实施方式之一中)制备的不含外泌体的制剂。该制剂也称为“本发明的不含外泌体的制剂”。

本发明的组合物、本发明的外泌体和/或本发明的不含外泌体的制剂优选地包含细胞因子和/或生长因子。

本发明的另一方面涉及一种用于制备组合物的方法，该方法包括：(i)通过本发明的方法制备药物组合物；(ii)通过本发明的外泌体制备方法制备外泌体；或(iii)通过本发明的不含外泌体的制剂的制备方法制备不含外泌体的制剂，以及分别用其储存装置、其施加至哺乳动物的装置或赋形剂将所述药物组合物、外泌体和不含外泌体的制剂组合。该方法也称为“本发明的组合物制备方法”。

储存装置与上述容器不同。优选的储存装置选自小药瓶、多个小药瓶、安瓿、多个安瓿、瓶子、多个瓶子、药液袋和多个药液袋。

优选的施加至哺乳动物的装置选自注射器和多个注射器。

赋形剂的实例是载体、稀释剂、媒介物、防腐剂、稳定剂、等渗剂和溶剂。优选的赋形剂选自盐水(优选氯化钠溶液，特别是0.9％氯化钠溶液)和缓冲液(优选磷酸盐缓冲液)。

另一个方面涉及通过本发明的组合物制备方法(特别是在本文所述的优选实施方式之一中)制备的组合物。该组合物也称为“本发明的组合物”。

附加地，本发明涉及一种试剂盒，包括：

-容器，具有用于与从哺乳动物收集的液体接触的内表面，其中液体包括血液的细胞成分，

-搅拌装置，用于在培育时间期间将所述液体搅拌至少一次，其中所述液体在与所述内表面接触中进行培育，以及优选地

-用于将药物组合物施加至哺乳动物的装置，其中所述药物组合物通过从所述液体中除去部分或全部的所述细胞成分并在所述培育时间后收集其余部分而获得。

本文中，该试剂盒也称为“本发明的试剂盒”。

进一步地，本发明涉及本发明的药物组合物、本发明的外泌体、本发明的不含外泌体的制剂、本发明的组合物或本发明的试剂盒作为化妆品的用途。

本发明的再一方面涉及本发明的方法(特别是在如本文所述的优选实施方式之一中)中的容器或搅拌装置的使用。

本发明还涉及用于作为药物使用的本发明的药物组合物、本发明的外泌体、本发明的不含外泌体的制剂、本发明的组合或本发明的试剂盒。尽管这种使用可以是通过施加至与已经收集所述液体的哺乳动物不同的哺乳动物，但是优选地通过施加至与已经收集所述液体相同的哺乳动物，即，治疗优选地是自体的(特别是出于安全原因)。优选地，该用途与一种或更多种其他有效制剂组合。

本发明的另一方面是用于在治疗选自骨科病症、关节病症、肌腱病症、疼痛、退行性脊柱疾病(优选椎间盘突出)、椎间盘的病症、神经骨科病症、神经根的病症、神经系统的刺激、神经系统的炎症、神经性病症、涉及免疫系统的疾病、自身免疫性疾病、牛皮癣、慢性伤口(优选糖尿病性溃疡)、肌肉疾病、食物不耐受、药物不耐受、子宫内膜异位症、细胞凋亡起作用的病症、衰老和与衰老相关的障碍的病症中使用的、作为抗衰老制剂使用的或作为通过注射进入皮肤的药物使用的本发明的药物组合物、本发明的外泌体、本发明的不含外泌体的制剂、本发明的组合物或本发明的试剂盒。

本发明的该方面的替代用语是：

-用于制造治疗选自骨科病症、关节病症、肌腱病症、疼痛、退行性脊柱疾病(优选椎间盘突出)、椎间盘的病症、神经骨科病症、神经根的病症、神经系统的刺激、神经系统的炎症、神经性病症、涉及免疫系统的疾病、自身免疫性疾病、牛皮癣、慢性伤口(优选糖尿病性溃疡)、肌肉疾病、食物不耐受、药物不耐受、子宫内膜异位症、细胞凋亡起作用的病症、衰老和与衰老相关的障碍的病症的药物、作为抗衰老制剂使用的或作为通过注射进入皮肤的药物使用的本发明的药物组合物、本发明的外泌体、本发明的不含外泌体的制剂、本发明的组合物或本发明的试剂盒，

-在治疗选自骨科病症、关节病症、肌腱病症、疼痛、退行性脊柱疾病(优选椎间盘突出)、椎间盘的病症、神经骨科病症、神经根的病症、神经系统的刺激、神经系统的炎症、神经性病症、涉及免疫系统的疾病、自身免疫性疾病、牛皮癣、慢性伤口(优选糖尿病性溃疡)、肌肉疾病、食物不耐受、药物不耐受、子宫内膜异位症、细胞凋亡起作用的病症、衰老和与衰老相关的障碍的病症中使用、作为抗衰老制剂使用或作为通过注射进入皮肤的药物使用本发明的药物组合物、本发明的外泌体、本发明的不含外泌体的制剂、本发明的组合物或本发明的试剂盒，

-用于治疗需要治疗选自骨科病症、关节病症、肌腱病症、疼痛、退行性脊柱疾病(优选椎间盘突出)、椎间盘的病症、神经骨科病症、神经根的病症、神经系统的刺激、神经系统的炎症、神经性病症、涉及免疫系统的疾病、自身免疫性疾病、牛皮癣、慢性伤口(优选糖尿病性溃疡)、肌肉疾病、食物不耐受、药物不耐受、子宫内膜异位症、细胞凋亡起作用的病症、衰老和与衰老相关的障碍的病症，需要用抗衰老制剂治疗或需要通过注射进入皮肤的治疗的患者的方法，该方法包括向所述患者施加有效量的本发明的药物组合物、本发明的外泌体、本发明的不含外泌体的制剂、本发明的组合物或本发明的试剂盒，从而治疗所述患者的所述病症，用抗衰老制剂治疗所述患者或通过注射进入皮肤治疗所述患者，或者

-用于治疗选自骨科病症、关节病症、肌腱病症、疼痛、退行性脊柱疾病(优选椎间盘突出)、椎间盘的病症、神经骨科病症、神经根的病症、神经系统的刺激、神经系统的炎症、神经性病症、涉及免疫系统的疾病、自身免疫性疾病、牛皮癣、慢性伤口(优选糖尿病性溃疡)、肌肉疾病、食物不耐受、药物不耐受、子宫内膜异位症、细胞凋亡起作用的病症、衰老和与衰老相关的障碍的病症，作为抗衰老制剂使用或作为通过注射进入皮肤的药物使用的药物，该药物包含本发明的药物组合物、本发明的外泌体、本发明的不含外泌体的制剂、本发明的组合物或本发明的试剂盒。

以下说明与本发明的该方面的用语无关。

优选的关节病症选自骨关节炎、关节炎(arthritis)、关节发炎、软骨的炎症损失和风湿病。骨关节炎可能由过度劳损引起，具有先天性或创伤性原因，或者是另一种疾病(诸如发炎)的结果。骨关节炎优选是活化性的骨关节炎或炎症性的骨关节炎。骨关节炎或关节炎可以存在于任何关节中，例如膝关节、髋关节、踝关节、肩关节、椎骨关节、手指关节、肘关节、脚趾关节、颞下颌关节和腕关节。关节炎可以是由感染引起的关节炎，诸如细菌性关节炎，或者不是由感染引起的关节炎，诸如类风湿性关节炎、牛皮癣性关节炎或痛风性关节炎。优选的是类风湿性关节炎、青少年类风湿性关节炎和青少年斯蒂尔症(MorbusStill)。特别优选的关节病症是骨关节炎和类风湿性关节炎。

优选的疼痛选自背部疼痛(优选由于神经系统的原因)、关节炎性疼痛和腰部神经根性疼痛。

涉及免疫系统的疾病优选是慢性眼睛炎症(特别是在马中)或过敏。在一个优选的实施方式中，该用途是用于炎症消退。在另一个优选的实施方式中，用途是用于抑制TNF-α的表达。

自身免疫疾病优选为关节的自身免疫疾病，诸如白赫铁列夫症(MorbusBechterew)、类风湿性关节炎和系统性红斑狼疮。其他优选的自身免疫性疾病是神经皮炎或斑秃。

本发明的药物组合物、本发明的外泌体和本发明的不含外泌体的制剂可以通过静脉内的、肌内的、关节内的、经皮的、皮下的、鼻内的、经口的、经神经周的或鞘内的给药或通过局部注射或滴注或这些中的任何的组合而施用。它们优选意欲用于局部给药。因此，在优选的实施方式中，它们意欲用于注射，特别是注射进入要治疗的身体区域中，特别是进入患病关节、进入患病神经根或进入患病椎间盘或进入其局部环境中。因此，药物组合物特别地意欲用于关节内的和/或根周的注射。替代地，可以将本发明的药物组合物、本发明的外泌体和本发明的不含外泌体的制剂配制成用于局部给药，特别是作为乳膏或凝胶，或用于全身给药，特别是以片剂，胶囊剂或锭剂的形式口服给药。给药类型尤其取决于要治疗的疾病。在局部骨关节炎或退行性脊柱疾病中，局部给药是优选的。本发明的药物组合物，本发明的外泌体和本发明的不含外泌体的制剂以本领域技术人员已知的方式适当地配制用于不同类型的给药。因此，适合于注射的药物组合物优选地具有溶液或分散液的形式，或者也具有干燥的形式，例如如粉末或冷冻干产物，在注射前必须将其溶于适当的溶剂(诸如水)中。

在治疗上述病症中作为抗衰老制剂或作为通过注射进入皮肤的药物使用的一个优选实施方式是与一种或更多种附加有效制剂联合治疗。附加有效制剂也可以存在于本发明的药物组合物、本发明的外泌体、本发明的不含外泌体的制剂、本发明的组合物和本发明的试剂盒，或附加有效制剂可以存在于不同的组合物，其可以同时或依次给药。

在液体与内表面接触之后进行搅拌。当所述接触是通过将液体填充到容器中时，这意味着在将液体填充到容器中之后进行搅拌。

在本发明的方法中，优选通过搅动容器来搅拌液体。优选地，通过搅拌液体，将其混合。

液体优选为

(1)在全部的所述培育时间期间搅拌，

(2)在所述培育时间期间搅拌两次或更多次，

(3)搅拌持续总共至少5分钟(优选总共至少10、15、30或45分钟或1、2、3、4、5或6小时)，

(4)在所述培育时间开始后的晚于10分钟(优选15分钟、30分钟或1小时以上)的某个时间点搅拌，

(5)在培育时间的前10分钟期间不搅拌，或

(6)由选自以下的一种或更多种搅拌：围绕容器的轴线旋转容器、沿闭合轨迹移动容器的轴线、移位容器、倾斜容器、倒置容器、振动容器、使液体旋转、使液体移位和搅拌液体，其中搅拌优选是均匀的。

优选地，上述选项(6)与选项(1)至(5)中的任何一个组合。

优选地，将围绕容器的轴线旋转容器与沿闭合轨迹移动容器的轴线组合。特别优选地，将围绕容器的纵向轴线旋转容器(优选地以10至20rpm，特别地以15rpm)与以相同的频率沿闭合的(优选连续的，更优选椭圆形的，最优选圆形的)轨迹移动容器的纵向轴线组合。

围绕容器的轴线旋转容器的优选实施方式是：围绕容器的纵向轴线旋转容器，围绕垂直于容器的纵向轴线的轴线旋转容器，或两者。容器优选地围绕其轴线以1至30rpm、5至25rpm、10至20rpm，特别以15rpm旋转。当轴线是纵向轴线时，通常可以选择比当轴线是垂直于纵向轴线的轴线时更高的速度。特别优选的是围绕纵向轴线以10至20rpm，特别以15rpm的速度旋转。

沿闭合轨迹移动容器的轴线优选地是其纵向轴线或垂直于其纵向轴线的轴线。优选地，闭合轨迹是连续的，更优选地是椭圆形的，并且最优选地是圆形的。优选地以每分钟重复10至200次(更优选每分钟重复20至180次、40至160次、60至140次和80至120次)进行移动。当轴线是纵向轴线时，通常可以选择比当轴线是垂直于纵向轴线的轴线时更高的速度。替代地，在沿闭合轨迹移动容器的轴线与围绕容器的轴线旋转容器组合的情况下，前者的频率可以被选择为与后者的频率相同。闭合轨迹的直径(或者，如果其具有一个以上的直径，则其最长的直径)优选地具有0.1至20cm、0.2至10cm或0.3至5cm的长度。

移位是指平移运动。优选以每分钟重复10至200次(更优选每分钟重复20至180次、40至160次、60至140次和80至120次)重复的双向移位是优选的。平移路径优选具有0.1至20cm、0.2至10cm或0.3至5cm的长度。

振动容器优选每分钟重复进行10至200次(更优选每分钟重复20至180次、40至160次、60至140次和80至120次)。

所述搅拌装置优选地选自

-轮状或螺旋桨状的装置，该装置用于使容器围绕其轴线旋转(并且优选地同时沿闭合的，优选是连续的，更优选地是椭圆形，最优选地是圆形的轨迹移动容器的轴线)，其中，优选地，该装置具有垂直于重力方向或倾斜高达90度(特别地高达80、70、60、50、45、40、35、30、25、20、15、10或5度)的角度的旋转轴线，以及

-振动装置，该振动装置优选地适于进行圆周运动或平移运动(特别地具有0.1至20cm的平移路径和0.2至10cm或0.3至5cm的直径)。

在振动装置适于进行圆周运动的情况下，它还是用于使容器的轴线沿闭合轨迹运动的装置。在振动装置适于进行平移运动的情况下，它还是用于移位容器的装置。振动运动优选地在水平面上进行。

搅拌装置优选地适于以上文所指出的频率移动。

液体(优选血液样品，更优选全血样品)的培育优选地进行如下的培育时间：15分钟至24小时、1小时至6小时、1小时至5小时、1.5分钟至24小时、2小时至少于24小时、2小时至5小时、至少3小时、3小时至5小时、3小时至少于24小时、3小时至20小时、3小时至16小时、4小时至12小时、至少5小时、5小时至10小时、5小时至7小时、高达6小时、至少6小时或至少7小时。替代地，将培育进行一培育时间，在该培育时间后，某一参数相对于该参数(诸如细胞因子的浓度、细胞因子拮抗剂(特别是IL-1Ra)的浓度，外泌体的浓度和/或生长因子的浓度)的培育前的值和/或正常值的可测量的变化已经发生。在某些实施方式中，较长的培育持续时间可以是优选的，诸如24小时以上，例如30小时、36小时或更长。

培育优选地在0℃至45℃的温度下进行，特别地在10℃至43℃、20℃至41℃、30℃至40℃、35℃至39℃、36℃至38℃或37℃的温度下进行。这些温度确保最佳疗效。

培育可以在存在或不存在添加的抗凝剂(优选地选自华法林、醋硝香豆素、苯丙香豆素、苯茚二酮、肝素、低分子量肝素、因子Xa的合成抑制剂和凝血酶抑制剂、最优地肝素)的情况下进行。优选地在不存在添加的肝素的情况下进行，更优选地在不存在任何添加的抗凝剂的情况下进行。

当所述培育时间与所述内表面之间的关系为根据以下方程式，即：t＝f*A时，疗效是特别有利的，其中t表示培育时间，A表示内表面，并且f小于或等于0.5h/cm

内表面的优选范围是10至300cm

本发明的方法中的“容器”可以与所述液体已经被收集在其中的容器相同，或者是不同的容器。

合适的容器例如是皮下注射针、注射器、诸如真空管或试管的管、微量滴定板、注射器和输液袋。容器可以例如具有0.4至5cm、0.9至4cm或1.4至3.5cm的直径，和/或3至30cm、5至20cm、7至15cm或8至12cm的长度。优选地，容器是圆柱形的。优选的容器具有如下体积，即1ml至1000ml、3ml至750ml、5ml至500ml、7ml至300ml、8ml至200ml、9ml至150ml、10ml至100ml、11ml至80ml，特别是12ml至70ml，然而其也可以具有15ml至65ml、20ml至60ml、25ml至50ml或30至40ml的体积。优选地，内表面与体积的比例为0.01至10cm

容器优选地具有包括由选自玻璃、塑料、刚玉和石英中的一种或更多种制成的表面的内表面(用于接触液体，优选血液样品，更优选全血样品)。优选地，玻璃是硼硅酸盐玻璃。优选的塑料为选自聚苯乙烯、聚碳酸酯、聚乙烯和聚丙烯。优选地，用于接触容器的液体的内表面创建完全封闭的空间。优选的容器具有以下特征中的一个或更多个：关于平面对称、关于轴线对称和圆柱形。

根据一个优选的实施方式，容器容纳有用于接触所述液体的颗粒，该颗粒为选自宏观颗粒、微观颗粒和纳米颗粒中的一种或更多种。为了本申请的目的，宏观颗粒被限定为当用肉眼观察时可见的颗粒，微观颗粒被限定为当通过肉眼观察时太小而不可见但当用显微镜观察时可见的颗粒，以及纳米颗粒被限定为当用显微镜观察时太小而不可见的颗粒(并且优选大于1nm)。这样的颗粒达到增大用于与液体(血液样品)接触的表面的目的(例如增大0.3至90cm

附图说明

图1示出了在两种不同条件下IL-1β和IL-1Ra的浓度的时间曲线：静态培育和使用慢速旋转的培育(x轴：以分钟计的培育时间；y轴：以pg/ml计的IL-1β和IL-1Ra各自的浓度)。

图2示出了在三种不同条件下IL-1Ra与IL-1β的浓度比例的时间曲线(x轴：以小时计的培育时间；y轴：均以pg/ml计的IL-1Ra和IL-1β的浓度的比例)。

图3示出了在三种不同条件下IL-1Ra的浓度的时间曲线(x轴：以小时计的培育时间；y轴：以pg/ml计的IL-1Ra的浓度)。

图4示出了在三种不同条件下IL-1β的浓度的时间曲线(x轴：以小时计的培育时间；y轴：以pg/ml计的IL-1β的浓度)。

图5示出了在三种不同条件下消退素D1的浓度的时间曲线(x轴：以小时计的培育时间；y轴：以pg/ml计的消退素D1的浓度)。

图6示出了在三种不同条件下外泌体浓度的时间曲线(x轴：以小时计的培育时间，其中T0表示没有培育；y轴：外泌体浓度，以每毫升的外泌体计数表示)。

图7示出了在三种不同条件下凝溶胶蛋白的浓度的时间曲线(x轴：以小时计的培育时间，其中T0表示没有培育；y轴：以ng/ml计的凝溶胶蛋白的浓度)。

图8示出了在三种不同条件下IL-1Ra与IL-1β的浓度比例的时间曲线(x轴：以小时计的培育时间；y轴：均以pg/ml计的IL-1Ra和IL-1β的浓度的比例)。

图9示出了在三种不同条件下IL-1Ra浓度的时间曲线(x轴：以小时计的培育时间；y轴：以pg/ml计的IL-1Ra的浓度)。

图10示出了在三种不同条件下IL-1β的浓度的时间曲线(x轴：以小时计的培育时间；y轴：以pg/ml计的IL-1β的浓度)。

具体实施方式

下列实施例表明，根据本发明，可以制备出在各个方面都比现有技术优越的药物制剂。

实施例1：在培育期间由于搅拌引起的IL-1β和IL-1Ra的差异产量，一个测试对象

通过本发明的方法如下制备药物制剂，即：

从健康的男性身上收集外周全血。将血液抽入无热原的10ml塑料注射器中(内长度：约84.5mm，内直径：约14.3mm，内表面：约4100mm

将容纳有样品的注射器在不添加CO

将一部分样品在没有搅拌的情况下进行培育(静态培育)。

在培育期间，搅拌另一部分样品。搅拌通过螺旋桨状的装置实现，该装置用于使容器围绕其轴线旋转并同时沿圆形轨迹移动容器的轴线(Thermo Scientific TubeRevolver,catalogue number 88881001,Thermo Fisher Scientific,Germany)，其设置为15rpm。该装置具有被校准至垂直于重力方向的旋转轴线。因此，将容器围绕其纵向轴线以15rpm旋转，同时以相同的频率沿圆形轨迹移动容器的纵向轴线。本文中，该运动也称为“慢速旋转”。

在培育后，通过离心除去不溶成分。收集得到的条件血清，并通过ELISA检测IL-1Ra和IL-1β的浓度。

结果在图1中示出。描绘了四个曲线，如表1中解释的：

表1：图1中示出的曲线。

可见，当培育是静态的时并且当使用慢速旋转进行培育时，IL-1β的浓度保持忽略不计。然而，与静态培育相比，慢速旋转导致IL-1Ra浓度随时间显著增加。因此，搅拌，特别是慢速旋转，改善了期望的因子IL-1Ra的水平，而不会影响非期望的因子IL-1β的水平。

实施例2：在培育期间由于搅拌引起的IL-1β和IL-1Ra的差异产量，四个测试对象

如上所述，IL-1(例如IL-1β)是炎症、疼痛和组织破坏的介质。IL-1Ra是其天然存在的抑制剂和重要的抗炎细胞因子。

通过本发明的方法如下制备药物制剂，即：

从四个健康的人身上收集外周全血。如实施例1描述的将血液抽入容纳有玻璃珠的注射器中。

将容纳有样品的注射器在不添加CO

将一部分样品在没有搅拌的情况下进行培育(静态培育)。

在培育期间，使用振动装置以100rpm进行3mm直径的圆周运动(IKA MTS 4shaker,IKA-Werke,Staufen,Germany)搅拌另一部分样品。将注射器以水平位置固定在附接至振动器的塑料板中。振动是在水平面上进行的。因此，将容器的垂直于容器的纵向轴线的轴线以每分钟重复100次沿圆形轨迹移动。闭合的圆形轨迹的直径(各个圆的直径)因此为0.3cm。本文中，该运动也称为“快速振动”。

在培育期间通过如实施例1中限定的慢速旋转来搅拌另一部分样品。

在培育后，通过离心除去不溶成分。收集得到的条件血清，并通过ELISA检测IL-1Ra和IL-1β的浓度。

图2示出了IL-1Ra与IL-1β的平均比例，图3示出了IL-1Ra的平均浓度，图4示出了IL-1β的平均浓度。曲线为：静态培育(三角形符号，虚线)、使用快速振动的培育(方形符号，虚线)、使用慢速旋转的培育(菱形符号，实线)。

可见，搅拌导致IL-1Ra浓度的增加。相比之下，在有搅拌和没有搅拌的情况下，IL-1β的浓度大致相同，或者在慢速旋转的情况下甚至更低。由此，搅拌能够导致IL-1Ra与IL-1β的比例增加，这在慢速旋转的情况下尤其明显。需要牢记的是，如果IL-1β水平很低，则计算出的比例更容易出错，因为测量这样的浓度可能不太准确。

表2示出了IL-1Ra与IL-1β的测量比例，表3示出了IL-1Ra的测量浓度，表4示出了IL-1β的测量浓度。如上文所限定的，以静态培育、使用快速振动或使用慢速旋转进行培育。

表2：在指定的培育时间后测量的IL-1Ra浓度与IL-1β浓度的比例(参见图2)。

表3：在指定的培育时间后测量的以pg/ml计的IL-1Ra浓度(参见图3)。

表4：在指定的培育时间后测量的以pg/ml计的IL-1β浓度(参见图4)。

综上，已被证实搅拌改善期望因子IL-1Ra的水平，但没有不利地影响或有利地影响非期望因子IL-1β的水平。如从IL-1Ra与IL-1β的浓度比例特别显而易见的是，与根据现有技术使用静态培育所制备的那些药物相比，根据本发明可以制备出的药物制剂作为抗炎制剂甚至更有价值。

实施例3：由于不同的搅拌方式引起的消退素D1的增加的产量

某些从二十碳五烯酸(20：5(n-3)，也称为“EPA”)、二十二碳五烯酸(22：5(n-3))和特别地二十二碳六烯酸(22：6(n-3)，也称为“DHA”)衍生的以及称为(神经)保护素、消退素和maresins的代谢物，在纳摩尔和皮摩尔范围内的浓度下具有有效的抗炎和免疫调节作用。消退素D1是自限制炎症消退的介质，其被评估为这种生物活性的多不饱和脂肪酸代谢物的一个例子。它导致TNF-α表达的抑制。消退素还是关节炎和神经性疼痛的有效止痛药。

通过本发明的方法如下制备药物制剂：

从四个健康的人身上收集外周全血。如实施例1描述的将血液抽入容纳有玻璃珠的注射器中。

将容纳有样品的注射器在不添加CO

将一部分样品在没有搅拌的情况下进行培育(静态培育)。

在培育期间通过如实施例2中限定的快速振动来搅拌另一部分样品。

在培育期间还通过如实施例1中限定的慢速旋转来搅拌另一部分样品。

在培育后，通过离心除去不溶成分。收集得到的条件血清，并通过ELISA检测不同因子的浓度，包括消退素D1。

图5示出了消退素D1随时间的平均浓度。描绘了以下曲线：静态培育(三角形符号，虚线)、使用快速振动的培育(方形符号，虚线)、使用慢速旋转的培育(菱形符号，实线)。

可见，培育导致时间依赖性浓度的增加。培育期间的搅拌导致比静态培育更明显的增加。与通过快速振动搅拌样品时相比，使用慢速旋转的效果甚至更强。

表5示出了测量出的浓度。如上文所限定的，以静态培育、使用快速振动或使用慢速旋转进行培育。

表5：在指定的培育时间后测量的以pg/ml计的消退素D1浓度。没有培育的时间称为0h。

IL-5和IFN-γ的浓度低于检测的阈值。

因此，搅拌能够导致在消炎、TNF-α表达的抑制和镇痛的消退方面可以更有效的药物制剂。

实施例4：由于不同的搅拌方式引起的外泌体的增加的产量

如上所述，外泌体在多种病症的治疗中是已知的。因此，可以预期包含外泌体的药物制剂的治疗价值取决于外泌体的浓度。

在如与实施例3中描述的相同试验中，还通过ELISA检测外泌体的浓度。

图6示出了外泌体随时间的平均浓度。描绘了以下曲线：静态培育(三角形符号，虚线)、使用快速振动的培育(方形符号，虚线)、使用慢速旋转的培育(菱形符号，实线)。

显然，培育导致时间依赖性外泌体浓度的增加。搅拌甚至能够进一步增加外泌体的浓度。

表6示出了测量出的浓度。如上文所限定，以静态培育、使用快速振动或使用慢速旋转进行培育。

表6：在指定的培育时间后测量的以外泌体/ml计的外泌体浓度。没有培育的时间称为0h(图6中的T0)。

这意味着根据本发明，可以制备出在上述病症的治疗中具有增加的价值的药物制剂。

实施例5：由于不同的搅拌方式引起的凝溶胶蛋白的增加的产量

凝溶胶蛋白可以通过稳定线粒体来抑制细胞凋亡。更具体地，它抑制细胞色素C的释放，并由此阻止导致细胞凋亡的信号放大级联。它进一步是肌动蛋白结合(加帽)蛋白，其还有助于肌动蛋白聚合。

在如与实施例3中描述的相同试验中，还通过ELISA检测凝溶胶蛋白的浓度。

图7示出了凝溶胶蛋白随时间的平均浓度。描绘了以下曲线：静态培育(三角形符号，虚线)、使用快速振动的培育(方形符号，虚线)、使用慢速旋转的培育(菱形符号，实线)。

已经发现培育导致凝溶胶蛋白浓度的时间依赖性增加。搅拌甚至能够进一步增加凝溶胶蛋白的浓度。

表7示出了测量出的浓度。如上文所限定，以静态培育、使用快速振动或使用慢速旋转进行培育。

表7：在指定的培育时间后测量的以ng/ml计的凝溶胶蛋白浓度。没有培育的时间称为0h(图7中的T0)。

因此，本发明允许制备在抑制凋亡方面具有增加的疗效的药物制剂。这对于细胞凋亡在其中起作用的病症具有影响。

实施例6：培育期间由于搅拌引起的IL-1Ra的差异生量，三个测试对象

通过本发明的方法如下制备药物制剂：

从四个健康的人身上收集外周全血。将血液抽入无热原的10ml塑料注射器中(内长度：约84.5mm，内直径：约14.3mm，内表面：约4100mm

将容纳有样品的注射器在不添加CO

将一部分样品在没有搅拌的情况下进行培育(静态培育)。

在培育期间通过如实施例2所限定的快速振动来搅拌另一部分样品。

在培育器具还通过如实施例1中限定的慢速旋转来搅拌另一部分样品。

在培育后，通过离心除去不溶成分。收集得到的条件血清，并通过ELISA检测IL-1Ra的浓度。

图8示出了IL-1Ra与IL-1β的平均比例，图9示出了IL-1Ra的平均浓度，图10示出了IL-1β的平均浓度。曲线为：静态培育(三角形符号，虚线)、使用快速振动的培育(方形符号，虚线)、使用慢速旋转的培育(菱形符号，实线)。

可见，在不存在用于与液体接触的颗粒的情况下，搅拌还导致IL-1Ra浓度的增加。

相比之下，在有和没有搅拌的情况下，IL-1β的浓度大致相同，或者在慢速旋转的情况下甚至更低。同样在不存在颗粒的情况下，并且潜在地取决于培育时间，因此搅拌能够导致IL-1Ra与IL-1β的比例增加，这可能在慢速旋转的情况下尤其明显。需要牢记的是，如果IL-1β水平很低，则计算出的比例更容易出错，因为测量这样的浓度可能不太准确。

表8示出了IL-1Ra与IL-1β的测量比例，表3示出了IL-1Ra的测量浓度，表4示出了IL-1β的测量浓度。如上文所限定的，以静态培育、使用快速振动或使用慢速旋转进行培育。

表8：在指定的培育时间后测量的IL-1Ra浓度与IL-1β浓度的比例(参见图8)。

表9：在指定的培育时间后测量的以pg/ml计的IL-1Ra浓度(参见图9)。

表10：在指定的培育时间后测量的以pg/ml计的IL-1β浓度(参见图10)。

在不存在玻璃珠或其他颗粒的情况下，搅拌也可提高期望因子IL-1Ra的水平。与它们存在的情况相比，IL-1Ra的水平略低，这与这种颗粒增加了与液体接触的表面并改善诱导的解释相一致。在不存在颗粒的情况下，也可以实现IL-1Ra与IL-1β的极好的比例和IL-1β的低水平。