一种贝莱斯芽孢杆菌及其在改善水体中铜污染的应用

技术领域

本发明涉及污水处理技术领域，尤其是涉及一种贝莱斯芽孢杆菌及其在改善水体中铜污染的应用。

背景技术

近年来，随着工农业的飞速发展，人类对环境开发资源利用活动的日益增加，许多富含铜铅锌等重金属的废水未经合理处理而直接输入水体，从而导致我国地表水体重金属污染现象日趋严重。铜作为重金属污染的重要性因子，采用合理方法降低污水中铜含量已成为重中之重。目前已知的对重金属废水的治理方法主要有:物理法、化学法、物理化学法。比如物理法中的吸附法和萃取法；化学法包含化学沉淀法，氧化还原法，电化学法；物理化学法中的离子交换法和膜分离法。但是上述方法不仅投入成本高，且不能达到治本的目的，同时易引起对水体的二次污染。

相比于物理和化学方法，利用微生物自身的降解、吸收和转化等途径除去铜的方法，因具有在除去水体中铜的同时，还可以修复已经受损的水体生态平衡，并且微生物去铜所需成本低，操作简单容易掌控，且具有长期的治理效果等优点，而逐渐成为研究热点。红树林是陆地向海洋过渡的处于潮间带环境的特殊生态系统，其土壤因受海潮搬运等原因而兼有海洋和陆地两者的性质却又与二者不同，生活着多种具有治理水体重金属污染能力的微生物。

耐铜菌，又称耐受铜离子的微生物。是指一类能够吸收铜并将铜聚集和储存在细胞上的微生物，包括芽孢杆菌属、假单胞菌属等。耐铜菌在适宜的状态下会吸附铜，从而降低水体或环境中铜离子的浓度。

发明内容

基于此，本发明的一个目的在于，提供一种新的红树林土壤来源的贝莱斯芽孢杆菌Bacillus velezensis H18。该菌株能够吸附水体中的铜，从而能够有效降低水体中铜的含量，解决水体重金属污染严重的问题。

本发明采用的技术方案如下：

一种贝莱斯芽孢杆菌Bacillus velezensis H18，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M2020557。

相对于现有技术，本发明所述的贝莱斯芽孢杆菌Bacillus velezensis H18具有吸附铜的功能，当其处于条件适宜状态时，其在水体样品中的铜去除率高达81.7％，且去除铜的速度快，在污水铜污染治理中具有广阔的应用前景。

本发明的另一个目的在于提供所述的贝莱斯芽孢杆菌Bacillus velezensis H18在改善水体、土壤等环境中的铜污染的应用。

本发明的另一个目的在于提供所述的贝莱斯芽孢杆菌Bacillus velezensis H18的培养方法，包括以下步骤：

S1接种：所述贝莱斯芽孢杆菌Bacillus velezensis H18以1.0×10

S2培养：将接种有所述贝莱斯芽孢杆菌Bacillus velezensis H18的培养基，于25-37℃，以180～220rpm速度振荡，恒温培养16～48小时。

进一步地，所述培养基为2216E液体培养基，包括以下重量份的原料：蛋白胨5份、酵母浸粉1份、柠檬酸铁0.1份、氯化钠19.45份、氯化镁5.98份、硫酸钠3.24份、氯化钙1.8份、氯化钾0.55份、碳酸钠0.16份、溴化钾0.08份、氯化锶0.034份、硼酸0.022份、硅酸钠0.004份、氟化钠0.0024份、硝酸钠0.0016份、磷酸氢二钠0.008份、无菌水1000份。

进一步地，步骤S1中的接种浓度为2.5×10

进一步地，步骤S1中的菌液与培养基体积比接种量为1:100。

进一步地，步骤S2中的培养时长为28小时。

为了更好地理解和实施，下面结合附图详细说明本发明。

附图说明

图1为基于本发明所述的贝莱斯芽孢杆菌Bacillus velezensis H18在2216E琼脂固体培养基上培养48h后的菌落形态图；

图2为本发明所述的贝莱斯芽孢杆菌Bacillus velezensis H18在含铜培养基上培养48h后的菌落形态图；

图3为本发明所述的贝莱斯芽孢杆菌Bacillus velezensis H18的16SrRNA序列的PCR扩增核酸电泳图；

图4为本发明所述的贝莱斯芽孢杆菌Bacillus velezensis H18与贝莱斯芽孢杆菌Bacillus velezensis strain CBMB205(NR116240.1)的16S rRNA序列比对结果。

具体实施方式

本发明所述的贝莱斯芽孢杆菌菌株，命名为贝莱斯芽孢杆菌Bacillusvelezensis H18，于2020年9月29日保藏于中国典型培养物保藏中心(地址：中国湖北省武汉市武汉大学校内中国典型培养物保藏中心)，保藏编号为CCTCC NO:M2020557。

以下实施例便于理解本发明，但并不限定本发明。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

实施例一：分离纯化方法

本发明所述的贝莱斯芽孢杆菌Bacillus velezensis H18的分离纯化方法，步骤如下：

S1：称取10g的土壤样品，所述土壤样品来自广东省海陵岛红树林国家湿地公园的红树林土壤；然后，于超净工作台中，向土壤样品中添加90mL无菌水，置于振荡器上振荡60min，使土样均匀地分散在稀释液中成为土壤悬液；待土壤分散后，吸取100uL土壤悬液到900uL无菌水中得到10倍稀释液，然后依次稀释10倍，得到10

S2：取100uL的10倍稀释液、10

S3：培养结束后，根据菌落生长情况从适当稀释梯度平板一一挑取形状、颜色、大小等不同的单菌斑进行平板划线，分离出本发明所述的贝莱斯芽孢杆菌Bacillusvelezensis H18。本发明所述的贝莱斯芽孢杆菌Bacillus velezensis H18在2216E琼脂固体培养板上培养48h的形态，如图1所示，本发明贝莱斯芽孢杆菌Bacillus velezensis H18菌落呈白色不规则状，质地较软，表面粗糙，菌落向周围扩散。

S4：从2216E挑取已纯化培养的菌株，接种于内含200ml 2216E液体培养基的500ml锥形瓶中，在28℃、180rpm恒温摇床培养条件下培养28h，制得种子液。所述种子液与甘油按照1:4的体积比装管并混匀得到浓度为1.0×10

所述2216E琼脂固体培养基的配方按照以下重量份组成：蛋白胨5份、酵母浸粉1份、柠檬酸铁0.1份、氯化钠19.45份、氯化镁5.98份、硫酸钠3.24份、氯化钙1.8份、氯化钾0.55份、碳酸钠0.16份、溴化钾0.08份、氯化锶0.034份、硼酸0.022份、硅酸钠0.004份、氟化钠0.0024份、硝酸钠0.0016份、磷酸氢二钠0.008份、琼脂15份、无菌水1000份。配制方法为：称取和量取上述各组分后，将各组分搅拌溶解在无菌水中后分装至锥形瓶中，将锥形瓶用灭菌纸封口后，置于灭菌锅内121℃、101KPa高压蒸汽灭菌20min，待灭菌锅温度降至70℃以下，压力恢复至0KPa时取出，于超净台上倒入培养皿中，每个培养皿约倒入20mL培养基，冷却凝固后，将固体培养板于4℃保存。

所述2216E液体培养基的配方按照以下重量份组成：蛋白胨5份、酵母浸粉1份、柠檬酸铁0.1份、氯化钠19.45份、氯化镁5.98份、硫酸钠3.24份、氯化钙1.8份、氯化钾0.55份、碳酸钠0.16份、溴化钾0.08份、氯化锶0.034份、硼酸0.022份、硅酸钠0.004份、氟化钠0.0024份、硝酸钠0.0016份、磷酸氢二钠0.008份、无菌水1000份。称取和量取上述各组分后，将各组分搅拌溶解在无菌水中后分装至锥形瓶中，然后将锥形瓶用灭菌纸封口后，置于灭菌锅内121℃、101KPa高压蒸汽灭菌20min，待灭菌锅温度降至70℃以下，压力恢复至0KPa时取出，保存备用。

实施例二：贝莱斯芽孢杆菌H18耐铜能力的鉴定

S1接种：取实施例一中-20℃保存的甘油种子液以1：100菌液与培养基体积比接种量接种到2216E液体培养基中，置于恒温摇床中28℃恒温振荡培养28h，获得已活化的菌液；

S2培养基鉴定：吸取20ul已活化的菌液涂布于耐铜菌固体培养基上，置于生化培养箱中28℃恒温培养2～4天，观察耐铜菌培养基上是否有菌生长，若有菌生长，则表明菌株具有一定的耐铜功能；若无菌生长，则表明菌株无耐铜能力。

结果如图2所示：本发明的贝莱斯芽孢杆菌Bacillus velezensis H18在耐铜菌培养基上生长良好，培养48h后菌落呈白色、圆形、表面光滑状态。表明本发明的贝莱斯芽孢杆菌Bacillus velezensis H18具有一定的耐铜能力，有初步应用于降解污水中铜的潜力。

所述2216E液体培养基配方与实施例一相同。

所述耐铜菌固体培养基的配方按照以下重量份组成：胰蛋白胨10份、酵母浸粉5份、氯化钠10份、1000mg/L铜离子标准溶液200份、琼脂粉15份、无菌水1000份。称取和量取上述各组分后，将各组分搅拌溶解在无菌水中后分装至锥形瓶中，然后将锥形瓶用灭菌纸封口后，置于灭菌锅内121℃、101KPa高压蒸汽灭菌20min，待灭菌锅温度降至70℃以下，压力恢复至0KPa时取出，保存备用。

实施例三：贝莱斯芽孢杆菌H18的发酵培养

过程如下所示：

培养前活化：取实施例一中-20℃保存的甘油种子液以1：100菌液与培养基体积比接种量接种到2216E液体培养基中，置于恒温摇床中28℃恒温振荡培养28h，获得已活化的菌液。

S1接种：取已活化的菌液按照1：100菌液与培养基体积比接种于500ml 2216E液体培养基中；

S2培养：将接种有所述贝莱斯芽孢杆菌Bacillus velezensis H18的培养瓶，置于恒温摇床中28℃、以180rpm速度恒温振荡培养28h，菌密度达到10

所述2216E液体培养基配方与实施例一相同。

实施例四：贝莱斯芽孢杆菌H18基因组的提取及16S rRNA的扩增及序列鉴定

S1：取基因组DNA

采用Omega Bacterial DNAKit(D3350-01)试剂盒提取基因组DNA。首先，取实施例一中所述的种子液2mL于无菌的2ml离心管中，12000rpm离心2min，弃上清保留沉淀；然后，向沉淀中加入100uL1×TE Buffer，涡旋混匀，加入10uL溶菌酶混匀，37℃温浴10min；加入100uL BTL Buffer和20uL蛋白酶K，混匀，55℃温浴1h，中间振荡混匀三次；加入5uL RNaseA酶，混匀，室温静置5min后，10000rpm离心2min，取200uL上清液转移至新的无菌的1.5ml离心管中；加入200uL BTL Buffer，混匀，置于65℃温浴10min；加入200uL无水乙醇，涡旋混匀，将样品全部转移至吸附柱中，10000rpm离心2min，弃上清和吸附柱，将吸附柱放入新的收集管中；向吸附柱中加入500uL HBC Buffer，10000rpm离心2min，弃上清；向吸附柱上加入700uL DNA Wash Buffer，10000rpm离心2min，弃上清，重复两次；将空的吸附柱重新放入收集管中，10000rpm离心2min；向吸附柱中加入用30uL～50uL Elution Buffer(已于65℃预热)溶解DNA沉淀，即得到基因组DNA，-20℃保存备用。

S2：PCR扩增16SrRNA序列

以步骤S1所得基因组DNA为模板，Eubac27F和Eubac1492R为引物进行PCR扩增，PCR反应体系(50μl)如下：

PCR反应程序为：94℃预变性5min；94℃变性30s、55℃复性30s、72℃延伸1min，变性、复性和延伸的过程反复循环30次；72℃再延伸10min，4℃保存PCR扩增产物。

所述上游引物Eubac27F的序列为：agagtttgat cctggctcag

所述下游引物Eubac1492R的序列为：ggttaccttg ttacgactt

S3：PCR产物进行核酸电泳

取5uL步骤S2所得的PCR产物点样后于120V电压下进行核酸电泳25min。电泳结果如附图3所示，以本发明所述的贝莱斯芽孢杆菌Bacillus velezensis H18的基因组DNA为模板扩增出的16S rRNA片段条带单一且亮度高，且16S rRNA序列长度约为1500bp。

S4：16S rRNA序列进行测序

步骤S2所得的PCR产物经纯化回收后，取30uL纯化产物送广州擎科生物技术有限公司进行序列双向测通测定，测序结果显示本发明所述贝莱斯芽孢杆菌菌株的16S rRNA序列长度为1442bp，具体序列如下所示：

实施例五：构建系统进化树

将实施例四所得的本发明所述的贝莱斯芽孢杆菌菌株H18的16S rRNA序列输入NCBI中，进行BLAST比对。如附图4所示，根据本发明所得的贝莱斯芽孢杆菌菌株H18的16SrRNA序列与贝莱斯芽孢杆菌Bacillus velezensis strain CBMB205(NR116240.1)的序列相似度为99％，但不完全性相同，本发明所得的菌株在分类上属于贝莱斯芽孢杆菌Bacillus velezensis，且为一个新种，暂时命名为贝莱斯芽孢杆菌Bacillus velezensisH18。

实施例六：贝莱斯芽孢杆菌Bacillus velezensis H18菌体降低水体铜离子浓度

S1菌种活化：取实施例一中-20℃保存的甘油种子液以1：100体积比接种量接种到2216E液体培养基中，置于恒温摇床中28℃恒温振荡培养24h，获得已活化的菌液；

S2制备菌悬液：取已活化的菌液按照1:50菌液与培养基体积比接种于500mL2216E液体培养基中，置于恒温摇床中28℃、180rpm恒温振荡培养24h，可获得贝莱斯芽孢杆菌Bacillus velezensis H18发酵液；

S3制得菌体：将发酵液以12000r/min转速离心10min去除上清，保留沉淀；然后用无菌水吹打清洗沉淀，并以12000r/min转速离心10min，去上清留沉淀，反复清洗三次，得到菌体沉淀；

S4投放菌体：将一定量的菌体直接投入到配制的含有铜离子的水体样品中，设置条件：条件一：水体铜离子浓度分别为：50mg/L，75mg/L和100mg/L；条件二：水体PH值分别为2、3、4、5和6，条件三：菌体投加量分别为2g/L，4g/L，6g/L和8g/L，利用正交软件设计不同的组合条件，从而进行投加菌体吸附水体样品铜离子的实验。

在本实施例中，将菌体投放在水体中之后，将菌体按照组合条件投入到内含100mL含有铜离子的水体样品玻璃锥形瓶容器中，搅拌混匀，然后保藏容器用400目纱布与报纸封口。按照震荡速度为220r/min，28℃的条件下，在不同的处理时间点(0.5h、1h、1.5h、2h)取水样，再将水样以12000r/min的转速离心10min，取上清液，测定此时上清液(即水样)中的总铜的浓度，并计算其去除率，不同条件下的铜离子去除率结果见表1。

表1不同条件下贝莱斯芽孢杆菌的铜离子的去除率(％)

其中，所述不同组合条件中，贝莱斯芽孢杆菌Bacillus velezensis H18菌体的投加量为8g/L、水体pH值为5、水体铜离子含量为50mg/L时，贝莱斯芽孢杆菌Bacillusvelezensis H18处理对铜离子的吸附效果为最好，吸附1小时水体上清液的铜离子浓度由50mg/L降为9.15mg/L，说明该菌对于水体铜离子的去除率可以达到81.7％，且吸附速度快，其在水体及环境重金属铜污染的治理中具有良好的应用前景。

本实施例中，采用火焰原子吸收分光光度计测定吸附实验后水体样品的上清液中的铜含量。具体方法如下：

a.样品预处理：取20mL吸附实验后的水体样品,利用冷冻离心机以12000r/min转速离心10min，取上清液4mL置于100mL容量瓶中，加入适量的去离子水到刻度线，混匀后。立即取50mL稀释完毕的样品进行火焰原子吸收分光光度计检测；

b.本实验采用火焰原子吸收分光光度法来测定水体样品中的铜离子浓度，原子吸收分光光度计的组成部分有光源、试样原子化器、数据处理系统及单色仪，当待测样进入仪器中后，铜离子的浓度将按照吸收特征辐射光的大小程度来计算。反应原理为:待测样品通过雾化器后形成雾状并被出口处的乙炔火焰灼烧形成蒸汽，空心阴极灯在辐射过程中产生的特征谱线能在通过蒸汽时被基态原子所吸收，通过这种减弱的程度能够测出所需元素的浓度。

c.测量参数(如表2)

表2参数的相关条件

d.铜离子标准曲线：使用从国家有色金属及电子材料分析测试中心购买的浓度为1000mg/L的铜标准溶液，分别取铜标准使用溶液0、0.05mL、0.1mL、0.15mL、0.2mL、0.25mL，加去离子水定容至50mL；采用火焰原子吸收分光光度法，从而得到吸光度与铜离子含量关系的标准曲线。

e.当吸附处理后，样品水体中铜离子浓度呈直线下降，当吸附处理为1h时，水体中总铜离子浓度仅为9.15mg/L，铜去除率高达81.7％，说明本发明的贝莱斯芽孢杆菌Bacillus velezensis H18菌体具有良好的去除水体铜离子能力，因此在除去水体中的铜离子污染领域有良好的应用前景。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。

序 列 表

<110> 华南农业大学

<120> 一种贝莱斯芽孢杆菌及其在改善水体中铜污染的应用

<160> 13

<170> Patent In version 3.1

<210> 1

<211> 1442

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 本发明所述的贝莱斯芽孢杆菌Bacillus velezensis H18的16S rRNA序列

<400> 1

CGTACCTTCG GCGGCTGGCT CCTAAAGGTT ACCTCACCGA CTTCGGGTGT TACAAACTCT 60

CGTGGTGTGA CGGGCGGTGT GTACAAGGCC CGGGAACGTA TTCACCGCGG CATGCTGATC 120

CGCGATTACT AGCGATTCCA GCTTCACGCA GTCGAGTTGC AGACTGCGAT CCGAACTGAG 180

AACAGATTTG TGGGATTGGC TTAACCTCGC GGTTTCGCTG CCCTTTGTTC TGTCCATTGT 240

AGCACGTGTG TAGCCCAGGT CATAAGGGGC ATGATGATTT GACGTCATCC CCACCTTCCT 300

CCGGTTTGTC ACCGGCAGTC ACCTTAGAGT GCCCAACTGA ATGCTGGCAA CTAAGATCAA 360

GGGTTGCGCT CGTTGCGGGA CTTAACCCAA CATCTCACGA CACGAGCTGA CGACAACCAT 420

GCACCACCTG TCACTCTGCC CCCGAAGGGG ACGTCCTATC TCTAGGATTG TCAGAGGATG 480

TCAAGACCTG GTAAGGTTCT TCGCGTTGCT TCGAATTAAA CCACATGCTC CACCGCTTGT 540

GCGGGCCCCC GTCAATTCCT TTGAGTTTCA GTCTTGCGAC CGTACTCCCC AGGCGGAGTG 600

CTTAATGCGT TAGCTGCAGC ACTAAGGGGC GGAAACCCCC TAACACTTAG CACTCATCGT 660

TTACGGCGTG GACTACCAGG GTATCTAATC CTGTTCGCTC CCCACGCTTT CGCTCCTCAG 720

CGTCAGTTAC AGACCAGAGA GTCGCCTTCG CCACTGGTGT TCCTCCACAT CTCTACGCAT 780

TTCACCGCTA CACGTGGAAT TCCACTCTCC TCTTCTGCAC TCAAGTTCCC CAGTTTCCAA 840

TGACCCTCCC CGGTTGAGCC GGGGGCTTTC ACATCAGACT TAAGAAACCG CCTGCGAGCC 900

CTTTACGCCC AATAATTCCG GACAACGCTT GCCACCTACG TATTACCGCG GCTGCTGGCA 960

CGTAGTTAGC CGTGGCTTTC TGGTTAGGTA CCGTCAAGGT GCCGCCCTAT TTGAACGGCA 1020

CTTGTTCTTC CCTAACAACA GAGCTTTACG ATCCGAAAAC CTTCATCACT CACGCGGCGT 1080

TGCTCCGTCA GACTTTCGTC CATTGCGGAA GATTCCCTAC TGCTGCCTCC CGTAGGAGTC 1140

TGGGCCGTGT CTCAGTCCCA GTGTGGCCGA TCACCCTCTC AGGTCGGCTA CGCATCGTCG 1200

CCTTGGTGAG CCGTTACCTC ACCAACTAGC TAATGCGCCG CGGGTCCATC TGTAAGTGGT 1260

AGCCGAAGCC ACCTTTTATG TCTGAACCAT GCGGTTCAAA CAACCATCCG GTATTAGCCC 1320

CGGTTTCCCG GAGTTATCCC AGTCTTACAG GCAGGTTACC CACGTGTTAC TCACCCGTCC 1380

GCCGCTAACA TCAGGGAGCA AGCTCCCATC TGTCCGCTCG ACTGCATTAT AGCACCCGTA 1440

CG 1442

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 上游引物Eubac27F

<400> 2

agagtttgat cctggctcag 20

<210> 3

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 下游引物Eubac1492R

<400> 3

ggttaccttg ttacgactt 19