MDM2抑制剂在调控结肠癌化疗药物敏感性中的应用

技术领域

本发明涉及生物医药技术领域，具体涉及MDM2抑制剂与结肠癌化疗药物联合使用，用于增加结肠癌化疗敏感性。

背景技术

结直肠癌(colorectal cancer,CRC)是一种常见的胃肠道恶性肿瘤，是造成人类癌症相关死亡的第二大原因。目前对于结直肠癌的治疗仍以手术结合放化疗的方案为主，其中辅助化疗的敏感性是影响患者生存期的主要因素之一。研究显示，大多数患者在各种辅助化疗后3-12个月就会出现药物敏感性低、化疗耐受等现象。因此迫切需要寻找和补充新的更有效的克服耐药策略，从而实现更好的治疗效果。

MDM2(murine doubleminute 2，鼠双微体基因2)MDM2是一种E3泛素连接酶，通过与靶蛋白结合对其进行泛素化修饰介导蛋白质的降解，从而参与多种细胞生物学行为的调控。当细胞中MDM2高表达时，p53活性受到强烈抑制，导致p53无法发挥作用，造成细胞持续增殖从而诱导肿瘤的发生。对此，人们研发了多种MDM2抑制剂，其中Nutlin-3a是研究最为深入和广泛的一个靶向MDM2-p53相互作用的小分子抑制剂。

5-氟脲嘧啶(5-Fluorouracil,5-FU)作为胃肠道恶性肿瘤的一线治疗药物，单药或联合用药在结直肠癌的临床治疗中取得良好效果。然而，5-FU治疗的临床获益往往是短暂的，使用5-FU的患者易对其产生耐药性而使得总体有效率较低，大大降低化疗效果。

肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(tumor necrosis factor related apoptosisinducing ligand,TRAIL)能够选择性地诱导肿瘤细胞凋亡而对正常细胞无毒性作用，具有极大的临床应用前景。然而，相当多的肿瘤细胞对TRAIL具耐药阻碍了TRAIL的应用。

发明内容

本发明的目的是提供临床治疗结肠癌的新的用药趋势。发明人在临床实践中，发现MDM2抑制剂可改善结肠癌化疗药物的敏感性。在同等浓度下，将MDM2抑制剂与结肠癌化疗药物(5-FU及TRAIL)联合使用，可增强化疗药物对肿瘤细胞的抑制能力。

第一方面，本发明提供MDM2抑制剂在调控结肠癌对化疗药物敏感性中的应用。

第二方面，本发明提供MDM2抑制剂在制备提高结肠癌对化疗药物敏感性药物中的应用。所述MDM2抑制剂可用于制备提高结肠癌对TRAIL敏感性的药物；所述MDM2抑制剂用于制备提高结肠癌对5-氟脲嘧啶敏感性的药物。

在本发明所提供的应用中，Nutlin-3a通过诱导内质网应激从而增加结肠癌化疗敏感性，或Nutlin-3a通过诱导自噬增加结肠癌化疗敏感性。

第三方面，本发明提供一种组合物在制备治疗结肠癌药物中的应用，所述组合物包含MDM2抑制剂、5-氟脲嘧啶和/或肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(TRAIL)；在本发明所提供的药物组合物中，所述MDM2抑制剂为Nutlin-3a。

本发明提供的组合物，可抑制结肠癌细胞的生长、增殖或克隆；也可诱导结肠癌细胞的凋亡。

本发明提供的组合物，可抑制人结肠癌细胞RKO或人结肠癌细胞HCT116的生长、增殖或克隆；或抑制裸鼠结肠癌皮下实体瘤的生长。

第四方面，本发明还提供上述应用在制备提高结肠癌治疗效果的药物中的应用。具体地，为了制备提高结肠癌治疗效果的药物，将MDM2抑制剂与5-氟脲嘧啶或肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体联合使用。

本发明的有益效果至少在于：

(1)本发明通过实验证明，将Nutlin-3a和5-FU联合使用，可以显著增强5-FU的治疗效果；将Nutlin-3a和TRAIL联合使用，可以显著增强TRAIL的治疗效果，联合使用后显著抑制结肠癌细胞的生长、增殖，诱导结肠癌细胞的凋亡；

(2)本发明通过体外实验证实，将Nutlin-3a和5-FU联合使用或Nutlin-3a和TRAIL联合使用增强了裸鼠皮下瘤模型中的抗肿瘤效果，实现了协同增效的作用；

(3)本发明提供的Nutlin-3a和5-FU联用以及Nutlin-3a和TRAIL联合用药治疗结肠癌的新方案，为结肠癌的治疗提供了一种新的治疗药物和治疗途径，解决了临床治疗中结直肠癌患者经常发生化疗敏感性差的问题，还为MDM2抑制剂Nutlin-3a的应用提供了新的领域。

附图说明

图1为实施例1中不同浓度Nutlin-3a处理下的人结肠癌细胞存活率图。

图2为实施例1中不同浓度Nutlin-3a处理下的人结肠癌细胞克隆形成图。

图3为实施例1中不同浓度Nutlin-3a处理下的人结肠癌细胞凋亡情况图。

图4为实施例1中不同浓度Nutlin-3a处理人结肠癌细胞后的凋亡相关蛋白cleaved-caspase-3的Western blotting结果图。

图5为实施例2中应用CompuSyn软件分析得到的RKO细胞各联合实验组的联合指数CI图。

图6为实施例2中应用CompuSyn软件分析得到的HCT116细胞各联合实验组的联合指数CI图。

图7为实施例2中Nutlin-3a单独用药或联合5-FU或联合TRAIL处理时，人结肠癌RKO细胞中凋亡相关蛋白cleaved caspase-3的Western blotting结果图。

图8为实施例2中Nutlin-3a单独用药或联合5-FU或联合TRAIL处理时，人结肠癌HCT116细胞中凋亡相关蛋白cleaved caspase-3的Western blotting结果图。

图9为实施例2中MDM2抑制剂Nutlin-3a单独用药或联合5-FU或联合TRAIL处理下的结肠癌细胞RKO细胞凋亡情况图。

图10为实施例2中MDM2抑制剂Nutlin-3a单独用药或联合5-FU或联合TRAIL处理下的结肠癌细胞HCT116细胞凋亡情况图。

图11为实施例3中Nutlin-3a单独用药或分别与5-FU、TRAIL联合用药处理下，结肠癌细胞增殖情况图。

图12为实施例3中Nutlin-3a单独用药或分别与5-FU、TRAIL联合用药处理下，结肠癌细胞成瘤图。

图13为实施例3中Nutlin-3a单独用药或分别与5-FU、TRAIL联合用药处理下裸鼠皮下结肠癌模型实体瘤TUNEL检测凋亡情况图，图示标尺为100μm。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

下面结合具体实施例对本申请作出详细说明。本发明使用针对于MDM2的小分子抑制剂Nutlin-3a以及化疗药物5-FU以及TRAIL，以下所述实施例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径获得，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。本发明具体实施例中主要说明Nutlin-3a能够增强结肠癌细胞对化疗药物5-FU以及TRAIL的敏感性，为临床癌症治疗提供新型的药物联合使用的范例。

本发明进行实验所要用到的材料与试剂：

细胞来源：人源结肠癌细胞HCT116细胞和RKO细胞购自美国American typeculture collection(ATCC)公司。

本研究中用到的细胞有人结肠癌HCT1160细胞和RKO细胞，两种细胞用DMEM培养基培养。细胞培养基购买于Gibco公司，用于培养细胞前加入10％胎牛血清和1％的青霉素与链霉素。

本研究用到的抗体详细信息见表1。

表1抗体信息表

药物来源：MDM2抑制剂Nutlin-3a购自Sigma公司；5-FU和TRAIL均购自MCE公司。

MDM2抑制剂Nutlin-3a粉末用DMSO配成10mM初浓度，从MCE公司购买的5-FU粉末用DMSO配成10mM初浓度，TRAIL粉末用DMSO配成1mM初浓度。使用时加到培养基中的Nutlin-3a浓度范围为12.5-100μM，联合用药时，其中Nutlin-3a固定使用浓度为45uM，5-FU固定使用浓度为50ug/ml，TRAIL固定使用浓度为100ng/ml。

实施例1 MDM2抑制剂Nutlin-3a对结肠癌细胞存活、增殖和凋亡的影响

1、MDM2抑制剂Nutlin-3a对结肠癌细胞存活率的影响

选取人的结肠癌细胞HCT-116和人结肠癌细胞RKO，用含有10％FBS和1％双抗的DMEM培养基，常规培养于37℃、5％CO

细胞存活率(cell viability rate)＝A用药组/A对照组×100％。

结果如图1所示，结肠癌细胞RKO和HCT116经过不同浓度MDM2抑制剂Nutlin-3a后，细胞存活率明显下降。

Nutlin-3a浓度为12.5μM时，人结肠癌细胞RKO的存活率平均值为66.51％；Nutlin-3a浓度为25μM时，人结肠癌细胞RKO的存活率平均值为35.55％；Nutlin-3a浓度为50μM时，人结肠癌细胞RKO的存活率平均值为24.97％；Nutlin-3a浓度为100μM时，人结肠癌细胞RKO的存活率平均值为23.28％。

Nutlin-3a浓度为12.5μM时，人结肠癌细胞HCT-116的存活率平均值为92.77％；Nutlin-3a浓度为25μM时，人结肠癌细胞HCT-116的存活率平均值为82.16％；Nutlin-3a浓度为50μM时，人结肠癌细胞HCT-116的存活率平均值为28.08％；Nutlin-3a浓度为100μM时，人结肠癌细胞HCT-116的存活率平均值为15.09％。

表明MDM2抑制剂Nutlin-3a能够有效降低结肠癌细胞的存活率并且呈浓度依赖性。

2、MDM2抑制剂Nutlin-3a对结肠癌细胞增殖的影响

将处于对数生长期的结直肠癌细胞RKO、HCT-116弃去培养瓶中培养液，加入1ml0.25％胰蛋白酶消化细胞1～2分钟，制成细胞悬液，取每孔500个细胞均匀铺到六孔板中，待细胞完全贴壁后，更换含不同浓度Nutlin-3a的培养基，继续在37℃培养箱中孵育细胞，孔板中出现肉眼可见克隆时终止培养，吸去培养基，用PBS小心清洗，4％的组织固定液固定细胞20分钟，弃去固定液，用结晶紫染色20分钟，PBS清洗，在空气中风干后拍照。

结果如图2所示，结肠癌细胞RKO和HCT116经过不同浓度MDM2抑制剂Nutlin-3a后，克隆形成数目明显下降，表明MDM2抑制剂Nutlin-3a可以显著抑制结肠癌细胞RKO和HCT116克隆形成能力，抑制其增殖能力。

3、MDM2抑制剂Nutlin-3a对结肠癌细胞凋亡的影响

将对数生长期的RKO和HCT116细胞用胰酶消化后，取5×10

图3结果显示，对照组人结肠癌细胞RKO凋亡率为1.98％；Nutlin-3a浓度为35μM时，人结肠癌细胞RKO的凋亡率为3.73％；Nutlin-3a浓度为50μM时，人结肠癌细胞RKO的凋亡率为4.6％；Nutlin-3a浓度为75μM时，人结肠癌细胞RKO的凋亡率为14.43％；

对照组人结肠癌细胞HCT116凋亡率为2.48％；Nutlin-3a浓度为35μM时，人结肠癌细胞HCT116的凋亡率为3.13％；Nutlin-3a浓度为50μM时，人结肠癌细胞HCT116的凋亡率为8.72％；Nutlin-3a浓度为75μM时，人结肠癌细胞HCT116的凋亡率为11.13％。

Nutlin-3a处理组凋亡率高于对照组，并呈现剂量的依懒性。

取对数生长期的结肠癌细胞，常规胰酶消化细胞，消化后均匀接种到6cm的皿里，等到细胞完全贴壁后，换新鲜培养基并加药，Nutlin-3a浓度设置为：0μM、35μM、50μM、75μM；在显微镜下观察细胞形态，约20小时后，观察到最大加药浓度细胞大概有50％细胞皱缩、漂浮时，收集细胞，加入适量的裂解液使沉淀充分裂解，离心后取上清。按照说明书上的方法用BCA法测量蛋白浓度，根据蛋白浓度计算出上样体积，剩余蛋白样品加入适量5×的蛋白上样缓冲液，使5×的蛋白上样缓冲液在蛋白中稀释成1×，混匀，置于金属浴中，100℃加热10min变性，根据标准方法进行免疫印迹分析，相关抗体见抗体信息表。

结果如图4所示，Nutlin-3a浓度为0μM、35uM、50uM、75uM时，人结肠癌细胞RKO凋亡相关蛋白cleaved caspase-3灰度值与Tublin灰度比值分别为：0.20、0.51、0.75、0.95。人结肠癌细胞HCT116凋亡相关蛋白cleaved caspase-3灰度值与Tublin灰度比值分别为：0.06、0.13、0.57、1.52。

随着药物浓度的增加，Nutlin-3a诱导结肠癌细胞RKO和HCT116凋亡相关蛋白cleaved caspase-3表达逐渐增强。

实施例2 MDM2抑制剂Nutlin-3a分别与5-FU、TRAIL联合用药对结肠癌细胞存活、增殖和凋亡的影响

常规培养结肠癌细胞RKO、HCT116，消化后并将细胞以1.2×10

表2 RKO细胞不同药物处理组的联合指数CI

图5及表2结果显示，在RKO细胞中，5-FU与Nutlin-3a联用，其中给药浓度5-FU50ug/ml和Nutlin-3a 55uM时，CI<0.9，药物联合具有协同效果；TRAIL与Nutlin-3a联用，其中给药浓度TRAIL 100ng/ml和Nutlin-3a 55uM时，CI<0.9，药物协同效率最高。因此Nutlin-3a与5FU/TRAIL联用能够协同抑制RKO细胞的增殖，其中给药浓度为5-FU 50ug/ml、TRAIL 100ng/ml和Nutlin-3a 55uM。这表明在结肠癌细胞RKO中Nutli-3a对5-FU和TRAIL有很强的药物增敏作用。

Nutlin-3a与5FU/TRAIL联用在HCT116细胞中的协同增效探究结果如图6和表3所示。

表3结肠癌细胞HCT116不同药物处理组的联合指数CI

图6及表3结果显示，在HCT116细胞中5-FU与Nutlin-3a联用，大部分CI<0.9，因此5-FU与Nutlin-3a联用能够协同抑制HCT116细胞的存活率，其中给药浓度为5-FU 60ug/ml和Nutlin-3a 55uM时，药物协同效率最高。TRAIL与Nutlin-3a联用，其中给药浓度TRAIL100ng/ml和Nutlin-3a 55uM时，CI<0.9，二者具有协同作用。因此Nutlin-3a与5FU/TRAIL联用能够协同抑制HCT116细胞的增殖，其中给药浓度为5-FU 60ug/ml、TRAIL 100ng/ml和Nutlin-3a 55uM。这表明在结肠癌细胞HCT116中Nutli-3a对5-FU和TRAIL有很强的药物增敏作用。

将RKO和HCT116细胞以5×10

图7结果显示，结肠癌RKO中：对照组，5-FU，Nutlin-3a，Nutlin-3a+5-FU凋亡相关蛋白cleaved caspase-3灰度值与Tublin灰度比值分别为：0.04、0.07、0.18、1.05；对照组，TRAIL，Nutlin-3a，Nutlin-3a+TRAIL凋亡相关蛋白cleaved caspase-3灰度值与Tublin灰度比值分别为：0.05、0.03、0.35、1.08。

图8结果显示结肠癌HCT116中：对照组，5-FU，Nutlin-3a，Nutlin-3a+5-FU凋亡相关蛋白cleaved caspase-3灰度值与Tublin灰度比值分别为：0.06、0.22、0.28、1.12；对照组，TRAIL，Nutlin-3a，Nutlin-3a+TRAIL凋亡相关蛋白cleaved caspase-3灰度值与Tublin灰度比值分别为：0.09、0.33、0.16、0.77。

合加药组结肠癌RKO和HCT116细胞的凋亡相关蛋白Cleaved caspase-3蛋白水平均比单独加药组明显要高，这提示Nutlin-3a与5-FU和TRAIL联合使用能够显著增强5-FU和TRAIL诱导结肠癌细胞凋亡的能力。

将RKO和HCT116细胞用胰酶消化，以4×10

图9结果显示，结肠癌RKO中：对照组，5-FU，TRAIL，Nutlin-3a，Nutlin-3a+5-FU，Nutlin-3a+TRAIL分别处理细胞后，RKO的凋亡率分别为：2.41％、10.18％、4.95％、5.9％，17.59％，17.69％。

图10结果显示，结肠癌HCT116中：对照组，5-FU，TRAIL，Nutlin-3a，Nutlin-3a+5-FU，Nutlin-3a+TRAIL分别处理细胞后，HCT116的凋亡率分别为：2.49％、5.36％、4.72％、10.85％，23.75％，18.24％。

5-FU和TRAIL联合药物组结肠癌RKO和HCT116细胞的凋亡相关蛋白Cleavedcaspase-3蛋白水平均比单独加药组明显要高，这提示Nutlin-3a与5-FU和TRAIL联合使用，显著增强了5-FU和TRAIL诱导细胞凋亡的效果。

实施例3 Nutlin-3a分别与5-FU和TRAIL联合使用在动物水平的抗肿瘤作用

实施例2的体外实验证明了在细胞水平上，Nutlin-3a分别与5-FU和TRAIL联合使用对RKO细胞和HCT116细胞具有明显的肿瘤杀伤作用。

本实施例进行动物水平的实验，具体步骤如下：

大量培养HCT116细胞，通过皮下注入约5周大的裸鼠体内，每只裸鼠皮下约注射1×10

图11的结果显示随着注射药物天数的增加，PBS组的裸鼠肿瘤体积增长的最快，其次是5-FU组，再是TRAIL组，而Nutlin-3a与5-FU和TRAIL药物联合组经过15天的测量，肿瘤体积几乎没有增长，说明药物联合处理对裸鼠体内的肿瘤具有很好的抑制作用。待药物处理15天时，我们把每组每只裸鼠的肿瘤组织切下并按组按大小排好，可以清楚的看到药物联合组对肿瘤的抑制作用非常明显(图12)。肿瘤的石蜡组织切片TUNEL染色显示药物联用的肿瘤组织中TUNEL荧光强度明显增强，凋亡率增加(图13)。这些与体外的细胞实验结果一致。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。