一种化妆品的重金属铅速测卡及其检测方法

技术领域

本发明涉及重金属检测领域，具体涉及一种化妆品的重金属铅速测卡及其检测方法。

背景技术

近年来随着人们对“美白”的需求，化妆品宣传往往注重美白养颜、抗衰老、保湿、防晒等功效，其中美白祛斑类化妆品的开发引起了国内外众多化妆品公司的高度重视，美白祛斑类化妆品也不断地推陈出新，目前已成为一类重要的护肤类化妆品。但某些企业在产品中非法添加了铅、汞等重金属，从而出现重金属超标现象，严重危害大众的健康。2016年底，国家食品药品监督管理总局通告(2016年第170号)在化妆品监督抽检中发现60批次祛斑类化妆品存在非法添加禁用物质问题，其中，31种产品重金属铅超标。2017年，国家食品药品监督管理总局通告(2018年第20号)在全国范围内组织抽检了祛斑/美白类化妆品3120批次，抽样检验项目不合格产品29批次，其中19种产品重金属铅含量超标。2017年315晚会也曝光了重金属铅、汞含量超标的多个知名化妆品，由此可知，一种简单、经济的化妆品重金属快速检测技术的研究、创新及应用对于切实保障我国的公民安全具有重要意义。

检测重金属的传统方法(原子吸收法、原子荧光光度法、电感耦合等离子体质谱法、电感偶和等离子发射光谱法等)应用比较成熟，但是其所需仪器受到很多限制，比如仪器价格昂贵、携带不方便、样品前处理周期长等。随着经济的发展和人们生活水平的改善，人们对安全性的要求不断提高，待测样品量迅速增加。找到一种具有快速、简便、对所分析的样品需要量少，适合现场检测的速测卡受到广泛关注。

发明内容

为解决现有技术中存在的问题，本发明提供采用了酶抑制法开发出一种前处理简单、操作便捷且灵敏度较高的化妆品重金属铅速测卡。

技术方案为：包括下盖及与下盖相扣合的上盖，下盖内固定有测试化妆品重金属铅的测试纸，测试纸包括底板，底板上从左到右依次设有样品垫、酶片、显色片和吸水垫，酶片上吸附有葡萄糖氧化酶、过氧化物酶，葡萄糖氧化酶和过氧化物酶的酶活力为0.02～0.05U，酶片上还固定有质量百分数为0.5～2％的酶保护剂，显色片上吸附有显色剂，显色片上吸附有TMB，显色片上还固定有大分子聚合物，大分子聚合物的量为0.2～0.5mg；样品垫、酶片、显色片和吸水垫均粘结在底板上，样品垫与酶片之间进行搭桥过渡，且样品垫搭接在酶片上，酶片和显色片之间进行搭桥过渡，显色片与吸水垫之间进行搭桥过渡，且吸水垫搭接在显色片上，上盖设有样品孔及观察孔，样品孔的位置对应样品垫的位置，观察孔的位置对应显色片的位置。

优选地，样品垫与酶片之间重叠1/7～1/4，酶片和显色片之间重叠1/5～1/2，显色片与吸水垫之间重叠1/7～1/5。

优选地，底板为带粘性的PVC板，长55～80mm，宽4～5mm。

优选地，样品垫采用玻璃纤维制成，样品垫长20～30mm，宽4～5mm，样品垫为白色。

优选地，酶片长10～20mm，宽4～5mm，酶片的材质可以为滤纸、层析纸、合成纤维素纸，酶片为白色。

优选地，显色片采用层析纸，显色片可以为滤纸、层析纸、合成纤维素纸，显色片为白色。

优选地，吸水垫采用吸水纸，吸水垫长5～7mm，宽4～5mm，吸水垫为白色。

优选地，酶保护剂为牛血清白蛋白，大分子聚合物可以为聚乙二醇、聚乙烯吡咯烷酮，葡聚糖的其中一种。

采用上述重金属铅速测卡对化妆品中重金属铅检测的方法，步骤为：

(A)、棉签用水润湿，薄薄涂于样品孔将测试纸润湿；

(B)、取米粒大小待测物通过样品孔均匀滴加或者涂抹于样品垫，待测物可为霜剂、膏剂、乳剂、溶液剂、口红；

(C)、通过滴管滴加提取液3滴，于10-45℃反应2-5min；

(D)、再通过滴管滴加铅反应液2滴，于10-45℃反应5-10min；

(E)、通过观察孔的颜色与比色卡对比判断是否存在重金属铅：在样品垫上滴加待测物及提取液后，待测物及提取液后通过侧向层析只能作用于酶片上，同时与酶片上固定的葡萄糖氧化酶、辣根过氧化物酶接触并反应，待测物中的铅可抑制酶片上葡萄糖氧化酶的活性，随后向样品孔滴加铅反应液后，铅反应液中的底物通过侧向层析与葡萄糖氧化酶反应，生成的过氧化物与辣根过氧化物酶继续反应，生成的产物继续层析与显色片上固定的显色剂TMB发生显色反应，生成有色物质，附着在显色片上，若样品中含有铅，使得反应生成物过氧化物减少，则显色片上颜色就会减弱，甚至无色，通过观察孔查看显色片显色程度与配套比色卡比色得到样品中铅含量，检出限为5ppm。

优选地，提取液为PBS或tris-HCl缓冲溶液，pH为6～8，铅反应液为0.1～0.5％的葡萄糖溶液。

本发明的有益效果：

1、本发明利用酶促显色反应原理研制出的快速检测化妆品中铅残留的酶层析速测卡，不但显色迅速，而且速测卡显色片底色和反应后的显色层次较大，颜色档次清楚，容易辨别，增加了检测的灵敏度，与市面上化妆品铅速测卡相比，灵敏度高，在0-10mg/L范围内色阶变化明显，结果易读；同时解决了反应物颜色结果的保存，这对于现场执法保存物证尤为重要，这也是其它同类产品所不具备的优势，因此本产品具有很强的市场竞争力；将显色剂与酶液固定在不同的区域并单独保存可延长酶的保质期；

2、本发明在酶片前固定样品垫，可对化妆品中的色素及大分子化合物起到过滤吸附的作用，有效地减少化妆品中的干扰物质对酶片的影响；

3、本发明操作简单、灵敏度高、技术适用、环保安全，简单培训或按照说明书便可直接操作，无需专业技术人员；

4、本发明可进行现场检测，操作安全、无毒无害、无有机试剂、无需仪器辅助，检测时间短、效率高，检测成本低；

5、本发明速测卡检出限为5ppm，小于国家规定的铅限量标准。

附图说明

图1：本发明提供化妆品重金属铅快速检测卡内部结构。

图2：本发明提供化妆品重金属铅快速检测卡外部结构。

图3：本发明提实施例十五中加标实验中比色卡示意图。

图中：1-底板、2-样品垫、3-酶片、4-显色片、5-吸水垫、6-样品孔、7-观察孔。

具体实施方式

为了更好的理解本发明，下面结合实施实例进一步阐述本发明的内容，但本发明的内容并不仅仅局限于下述的实施例。

实施例一、如图1所示，重金属铅速测卡，包括下盖及与下盖相扣合的上盖，下盖内固定有测试化妆品重金属铅的测试纸，测试纸包括底板1，底板1上从左到右依次设有样品垫2、酶片3、显色片4和吸水垫5，酶片3上吸附有葡萄糖氧化酶、过氧化物酶，葡萄糖氧化酶和过氧化物酶的酶活力为0.02～0.05U，酶片3上还固定有质量百分数为0.5～2％的酶保护剂，酶保护剂为牛血清白蛋白。显色片4上吸附有显色剂，显色片上吸附有TMB(四甲基联苯胺)，显色片4上还固定有大分子聚合物，大分子聚合物的量为0.2～0.5mg，大分子聚合物可以为聚乙二醇(PEG)、聚乙烯吡咯烷酮，葡聚糖的其中一种。

样品垫2、酶片3、显色片4和吸水垫5均粘结在底板1上，样品垫2与酶片3之间进行搭桥过渡，且样品垫2搭接在酶片3上，酶片3和显色片4之间进行搭桥过渡，显色片4与吸水垫5之间进行搭桥过渡，且吸水垫5搭接在显色片4上。样品垫2与酶片3之间重叠1/7～1/4，酶片3和显色片4之间重叠1/5～1/2，显色片4与吸水垫5之间重叠1/7～1/5。

底板1为带粘性的PVC板，长55～80mm，宽4～5mm。

样品垫2采用玻璃纤维制成，样品垫2长20～30mm，宽4～5mm，样品垫2为白色。

酶片3长10～20mm，宽4～5mm，酶片3的材质可以为滤纸、层析纸、合成纤维素纸，酶片3为白色。

显色片4采用层析纸，显色片4可以为滤纸、层析纸、合成纤维素纸，显色片4为白色。

吸水垫5采用吸水纸，吸水垫5长5～7mm，宽4～5mm，吸水垫5为白色。

上盖设有样品孔6及观察孔7，样品孔6的位置对应样品垫2的位置，观察孔7的位置对应显色片4的位置。

用上述重金属铅速测卡对化妆品中重金属铅检测的方法，步骤为：

(A)、棉签用水润湿，薄薄涂于样品孔6将测试纸润湿；

(B)、取米粒大小待测物通过样品孔6均匀滴加或者涂抹于样品垫2，待测物可为霜剂、膏剂、乳剂、溶液剂、口红；

(C)、通过滴管滴加提取液3滴，于10-45℃反应2-5min；

(D)、再通过滴管滴加铅反应液2滴，于10-45℃反应5-10min；

(E)、通过观察孔7的颜色与比色卡对比判断是否存在重金属铅：在样品垫2上滴加待测物及提取液后，待测物及提取液后通过侧向层析只能作用于酶片3上，同时与酶片3上固定的葡萄糖氧化酶、辣根过氧化物酶接触并反应，待测物中的铅可抑制酶片3上葡萄糖氧化酶的活性，随后向样品孔6滴加铅反应液后，铅反应液中的底物通过侧向层析与葡萄糖氧化酶反应，生成的过氧化物与辣根过氧化物酶继续反应，生成的产物继续层析与显色片4上固定的显色剂TMB发生显色反应，生成有色物质，附着在显色片4上，若样品中含有铅，使得反应生成物过氧化物减少，则显色片4上颜色就会减弱，甚至无色，通过观察孔7查看显色片4显色程度与配套比色卡比色得到样品中铅含量，检出限为5ppm。

其中，提取液为PBS或tris-HCl缓冲溶液，pH为6～8，铅反应液为0.1～0.5％的葡萄糖溶液。

实施例二、制备速测卡：按照实施例一的方法制备速测卡，其中，显色片4上固定TMB及PEG，量分别为0.3mg、0.4mg。

实施例三、制备速测卡：按照实施例一的方法制备速测卡，其中，显色片4上固定TMB及PEG，量分别为0.4mg、0.3mg。

实施例四、制备速测卡：按照实施例一的方法制备速测卡，其中，显色片4上固定TMB及PEG，量分别为0.5mg、0.2mg。

实施例五、制备速测卡：按照实施例一的方法制备速测卡，其中，样品垫2与酶片3、酶片3与显色片4重叠，分别重合1/6、1/5，吸水垫5在显色片4上面重叠，重合1/7。

实施例六、制备速测卡：按照实施例一的方法制备速测卡，其中，样品垫2与酶片3、酶片3与显色片4重叠，分别重合1/5、1/5，吸水垫5在显色片4上面重叠，重合1/7。

实施例七、制备速测卡：按照实施例一的方法制备速测卡，其中，样品垫2与酶片3、酶片3与显色片4重叠，分别重合1/4、1/5，吸水垫5在显色片4上面重叠，重合1/7。

实施例八、制备速测卡：按照实施例一的方法制备速测卡，其中，吸水垫5在显色片4上面重叠，重合1/6。

实施例九、制备速测卡：按照实施例一的方法制备速测卡，其中，吸水垫5在显色片4上面重叠，重合1/5。

实施例十、制备速测卡：按照实施例一的方法制备速测卡，其中，吸水垫5长5mm。

实施例十一、制备速测卡：按照实施例一的方法制备速测卡，其中，吸水垫5长7mm。

实施例十二、制备速测卡：按照实施例一的方法制备速测卡，其中，吸水垫5长10mm。

对比例一、制备速测卡：按照实施例一的方法制备速测卡，其中，显色片4上固定PEG，量为0.01mg。

对比例二、制备速测卡：按照实施例一的方法制备速测卡，其中，不粘贴样品垫。

对比例三、制备速测卡：按照实施例一的方法制备速测卡，其中，吸水垫5与显色片4不重叠。

对比例四、制备速测卡：按照实施例一的方法制备速测卡，其中，吸水垫长2mm。

对比例五、制备速测卡：按照实施例一的方法制备速测卡，其中，吸水垫长15mm。

上述实施例采用铅标准溶液用纯水配制标液0.5、5、10、15mg/L，按照实施例一中给出的重金属铅检测的方法进行检测。

表1不同条件下速测卡结果

检测结果见表1所示：表中(+)代表对空白对照显阳性，表示酶受抑制程度较大，颜色为白色或淡蓝色，表中(-)代表对空白对照显阴性，表示酶受抑制程度较小，颜色为蓝色或浅蓝色，由此可知，添加样品垫2时色阶明显，灵敏度高，有利于浓度范围判断。吸水垫5与显色片4重叠时由于吸水垫5的毛细作用有利于生成物向显色片4层析并抑制生成物反流，有利于显色及浓度范围和结果判断。在显色片4添加大分子聚合物聚乙二醇(PEG)后，可保证TMB固定在显色片4上，且大分子聚合物能有效的截留过氧化物酶的反应产物并与TMB反应，若不添加大分子聚合物，同样的反应时间内，显色片4上大量的蓝色产物被吸水垫5吸附，造成假阳性结果或显色不均匀，不利于观察结果。吸水垫5的长度对实验结果至关重要，吸水垫5过长或过短都会显著影响酶的受抑制程度。

实施例十三、制备速测卡：按照实施例一的方法制备速测卡，其中，酶片3上固定有0.03U的葡萄糖氧化酶及辣根过氧化物酶。

实施例十四、制备速测卡：按照实施例一的方法制备速测卡，其中，酶片3上固定有0.04U的葡萄糖氧化酶及辣根过氧化物酶。

对比例六、制备速测卡：按照实施例一的方法制备速测卡，其中，酶片3上固定有0.005U的葡萄糖氧化酶及辣根过氧化物酶。

对比例七、制备速测卡：按照实施例一的方法制备速测卡，其中，酶片3上固定有0.06U的葡萄糖氧化酶及辣根过氧化物酶。

上述实施例采用铅标准溶液用纯水配制标液0.5、5、10、15mg/L，按照实施例一中给出的重金属铅检测的方法进行检测。

表2不同条件下速测卡结果

对催化TMB显色的酶浓度进行试验，研究发现在较低酶浓度条件下，随着酶量的加大，显色后颜色梯度更加明显，但是当酶浓度大于0.05U后，任凭加大使用量，试纸的显色速度和显色梯度都不会有变化，即酶量达到饱和，因此确定酶量最佳使用浓度为0.02～0.05U。

实施例十五、用乳液、水溶液、粉底、口红、霜膏做加标实验，分别取3g上述样品进行加标0、5、10、15ppm进行混匀。混匀后按照上述实施例一中记载方法进行测试(结果判定在6min时判读，不要超过10min)。

表2加标实验结果与比色卡进行比对结果

由表2可知，加标实验结果与比色卡对应一致。

以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围。