一种基于低共熔溶剂制备冷冻电镜检测样品的方法

技术领域

本发明涉及冷冻电镜检测样品制备方法的技术领域，具体涉及一种基于低共熔溶剂制备冷冻电镜检测样品的方法。

背景技术

冷冻电镜技术是结构生物学领域重要的技术，它通常用于大分子量的、难以结晶的生物分子结构的解析。随着冷冻电镜技术的发展，已经可以解析原子级分辨率，逐渐成为一种与X-射线晶体学技术互补的生物大分子结构解析技术。尤其适于解析大分子之间或与小分子互作机理。

糖苷转移酶是一类在生物体内将UDP-葡萄糖等具有催化活化的糖连接到不同受体分子的酶，糖基化的产物具有很多生物学功能。天然药用活性物中的非极性化合物黄酮、联苯等类型化合物可以通过糖基化改变其极性实现极性翻转，进而促进其在生物体内的吸收与运输，提高其生物活性。

在研究糖苷转移酶的催化机理过程中，将使用冷冻电镜对其结构进行研究，但冷冻电镜的制样通常在水为主体的缓冲溶液环境中进行，易出现非极性底物溶解性不好而析出的问题，进而阻碍酶促反应的进行。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于运用低共熔溶剂作为酶的缓冲溶剂的助溶剂制成DES-缓冲溶剂，能够较大程度的促进底物的溶解。在冷冻电镜制备样品的过程中，解决了冷冻电镜制样时由于底物水溶性不好而造成结果背景不清晰的问题，并且提高了酶的催化活性、热稳定性、保存时间等酶活性质。本发明的DES-缓冲溶剂制作简单、反应条件温和、无毒、可降解，符合绿色化学的发展，具有广泛的工业生产前景。

本发明采用了如下技术方案:

一种基于低共熔溶剂制备冷冻电镜检测样品的方法，该制备方法包括如下制备步骤：

S01、将氢键供体试剂和氢键受体试剂按预设比例混合，加热至40-80℃，反应1-2h后至澄清溶液状态，得到低共熔溶剂。

S02、将酶、低共熔溶剂及缓冲溶液混合，即制备得到冷冻电子显微镜样本。

作为优选，酶选自糖苷转移酶、转氨酶、谷氨酸脱羧酶中的至少一种，以糖苷转移酶为例，上述制备方法具体为在试管中接种菌液，进行活化。将试管中的菌液倒入培养基中，扩大培养。18小时后加入诱导剂进行诱导，诱导后将菌液离心，弃上清液，取菌体。用咪唑对菌体重悬，在高压匀浆破胞机中将菌液破胞，再离心，取上清液分装得到粗酶液。粗酶液经滤膜过滤后采用Ni-NTA亲和层析柱分离纯化蛋白。将得到的酶液进行浓缩，以除去咪唑成分，并且浓缩过程中用DES-缓冲溶液替换原来的缓冲溶液，得到糖苷转移酶样品。

糖苷转移酶样品溶解在上述低共熔溶剂中，在铜网上滴加溶液状态下的样品，形成很薄的样品液层，然后再将铜网投放到液态乙烷中进行快速冷冻。将这样的冷冻样品保持低温放置在透射电子显微镜下观察，从而获得生物大分子的结构。

作为优选，氢键供体试剂氢键供体试剂选自多元醇、糖、有机酸及有机胺类化合物中的一种，或是它们的混合物；氢键受体试剂选自氯化胆碱、甜菜碱、L-脯氨酸类等季铵盐。

作为优选，氢键供体试剂和氢键受体试剂的摩尔比包括下述：1:1，1:2，1:4，2:1，2:3等。本发明中，所述的氢键受体和氢键供体的纯度都≥99％。

作为优选，在步骤S01中，加热温度为60℃。

作为优选，在步骤S01中，反应时间为1.5h。

作为优选，在步骤S02中，缓冲溶液选自氯化胆碱—甘油缓冲液、氯化胆碱—乙二醇缓冲液、氯化胆碱—1,2-丙二醇缓冲液中的至少一种。本发明提供的低共熔溶剂是由氯化胆碱:甘油、氯化胆碱:乙二醇、氯化胆碱:1,2-丙二醇按照一定比例混合，温度为70-80℃，加热搅拌2h以上，直到形成无色透明液体。待冷却至室温后，将这些透明液体存放在硅胶干燥器中，干燥至少两周。该低共溶剂具有廉价无毒、可降解、易于制备、反应产物易分离等优点，是一个符合绿色化学的重要应用。

作为优选，在步骤S02中，低共熔溶剂与缓冲溶液配比为1:3。

综上所述，由于采用以上方法，本发明的有益效果是：

本发明解决了底物溶解性对冷冻电镜制样的影响的问题，促进黄酮、联苯类等天然产物小分子的生物催化转化，使用低共熔溶剂对反应环境进行优化。

本发明与传统的缓冲溶剂相比，先进行了DES-缓冲溶剂的制备，然后将传统的缓冲溶剂换成DES-缓冲溶剂。低共熔溶剂制作简单、反应条件温和、无毒、可降解，符合绿色化学的发展，具有广泛的工业生产前景。

综上所述，本发明利用低共熔溶剂作为的缓冲溶剂的助溶剂制成DES-缓冲溶剂，解决了冷冻电镜制样时由于底物水溶性不好而造成结果背景不清晰的问题，并且很大程度的提高了酶的催化活性和热稳定性以及延长了酶的储存时间，采用本发明提高了酶更好的保存价值。

具体实施方式

下面的的实施例可以帮助本领域的技术人员更好的理解本发明，但不可以以任何方式限制本发明。

实施例1(本实施例以糖苷转移酶为例子)

一种基于低共熔溶剂制备冷冻电镜检测样品的方法，具体方法如下：

在试管5mL培养液中接种10μL菌液，加入5μL的卡那霉素，放入摇床中，温度37℃，转速为180-200r/min，菌体活化9h。将试管中的菌液倒入200mL培养基中，加入200μL卡那霉素。放入摇床中，温度为37℃，转速为200r/min，扩大培养3h。放入200μL诱导剂，半乳糖苷诱导剂(IPTG)，放入摇床中。温度为25℃，转速为150r/min，诱导19h。诱导后将菌液离心，弃上清液，取菌体。用咪唑对菌体重悬，在高压匀浆破胞机中将培养的细胞进行破胞，再进行离心，取上清液分装得到粗酶液。粗酶液经0.45μm滤膜过滤后采用Ni-NTA亲和层析柱分离纯化蛋白。将得到的酶液进行浓缩，以除去咪唑成分，并且浓缩过程中用DES-缓冲溶液替换原来的缓冲溶液，得到糖苷转移酶样品。

糖苷转移酶样品在低共熔溶剂中溶解，在铜网上滴加溶液状态下的样品，形成很薄的样品液层，然后再将铜网投放到液态乙烷中进行快速冷冻。将这样的冷冻样品保持低温放置在透射电子显微镜下观察，从而获得生物大分子的结构。

本发明的结果:

经检测，本发明解决底物溶解性对冷冻电镜制样的影响的问题，促进黄酮、联苯类等天然产物小分子的生物催化转化，使用低共熔溶剂对反应环境进行优化。并且很大程度的提高了糖苷转移酶的催化活性、热稳定性以及储存时间。本发明的应用:天然药用活性物中的非极性化合物黄酮、联苯等类型化合物可以通过糖基化改变其极性实现极性翻转，进而促进其在生物体内的吸收与运输，提高其生物活性。在研究糖苷转移酶的催化机理过程中，将使用冷冻电镜对其结构进行研究，但冷冻电镜的制样通常在纯水环境进行，造成底物溶解性不好而析出，阻碍了酶促反应的进行。为了解决非极性底物在水环境反应体系中难溶的问题，促进了黄酮、联苯类等天然产物小分子的生物催化转化，本发明使用低共熔溶剂对反应环境进行优化。