一种稳定高产石斛碱的内生菌与金钗石斛原球茎共培养方法

技术领域

本发明涉及内生菌与金钗石斛原球茎共培养技术领域，具体为一 种稳定高产石斛碱的内生菌与金钗石斛原球茎共培养方法。

背景技术

植物组织培养包括单细胞培养、胚培养、根尖培养、茎尖培养、 愈伤组织培养、细胞悬浮培养、花药培养、原生质体培养等不同方法， 而在石斛组织培养中，大多数石斛属植物的种子、茎、叶诱导出愈伤 组织、原球茎、幼苗等组培材料，其中，原球茎来源广泛，可从种子、 茎、叶、拟原球茎等组织诱导而来，同时也具有优良脱分化能力，在 脱分化能力上仅低于种子，高于愈伤、拟原球茎、茎等，容易在激素 的作用下改变分化途径。

目前石斛碱是金钗石斛内生菌与植物均能自行独立合成的次生 代谢产物，由此推知石斛碱的代谢通路可能是两个材料代谢通路的汇 通点。然而，石斛碱在两个材料中的合成路径如何，这些通路如何协 调统一、机制如何，我们要解答这些问题关键就在于建立高产石斛碱 的金钗石斛原球茎与内生菌共培养体系，并对该体系进行转录组学分 析，因此我们提出了一种稳定高产石斛碱的内生菌与金钗石斛原球茎 共培养方法。

发明内容

本发明解决的技术问题在于克服现有技术的缺陷，提供内生真菌 与原球茎共培养高产石斛碱的方法。

为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：内生菌与金钗石斛 原球茎共培养方法，所述高产石斛碱的内生菌与金钗石斛原球茎共培 养方法包括以下步骤：

S1：对金钗石斛原球茎制备，选用金钗石斛蒴果，并建立种子诱 导原球茎与增值培养体系，并在此基础上绘制原球茎生长曲线，利用 GC/MS方法鉴定其中石斛碱的含量；

S2：较高繁殖系数金钗石斛原球茎制备，培养基成分与激素类型、 用量是影响植物组织培养最主要的因素之一，对生长状态进行描述和 绘制生长曲线；

S3：金钗石斛原球茎中石斛碱含量测定，以标品石斛碱作为对照， 并进行标准曲线制作；

S4：分离金钗石斛内生菌并鉴定其次生代谢产物，将纯化后的菌 种划线取样、涂片，在显微镜下观察形态，记录；

S5：金钗石斛中内生菌次生代谢产物鉴定，同时将菌种转至真菌 液体培养基中,28℃培养7-15d,将菌样、培养液分别提取产物，进行 GC/MS分析，并与金钗石斛茎段次生代谢产物、石斛碱标品进行比较 分析，挑选次生代谢产物中含有石斛碱的菌种作为共培养的候选菌株；

S6：建立金钗石斛原球茎与内生菌的共培养体系选用在生长曲线 中处于上升期的原球茎，转入植物生物反应器中，接种金钗石斛的内 生菌，添加液体培养基，温度25℃，采用间歇式浸没法进行共培养， 在共培养前后检测金钗石斛原球茎的干湿重变化，检测其中的石斛碱 含量；

S7：优良菌株筛选，将S6得到的候选菌株转入添加有金钗石斛 原球茎的培养瓶中，分别记录接种后7-15d原球茎干湿重变化、其中 石斛碱含量变化，以石斛碱得率最高的菌株作为共培养体系的受试菌；

S8：共培养体系优化，以原球茎的生长时期、相对接种量、液体 培养基组成、培养温度等作为参数，结合GC/MS检测得到石斛碱的得 率进行正交实验设计、响应面法优化共培养体系；

S9：内生菌与金钗石斛原球茎高产石斛碱网络绘制，进行转录组 学检测；

S10：转录组学分析，将组装得到的所有Unigenes，与NCBI的 Nr(非兀余蛋白数据库)、Nt(非冗余核酸数据库)数据库、Swissprot 蛋白数据库、COG数据库以及KEGG蛋白数据库分别进行比对，对 unigenes进行功能注释及GO富集分析，同时对三代转录组得到的数据对其中的转录剪切、单基因变异等信息进行进一步补充，完善转录 组数据信息；

S11：绘制石斛碱积累的功能基因代谢网络，以KEGG等数据库为 依托，结合RNA-Seq揭示的基因表达差异信息，进行代谢通路分析， 采用DAVIDDAVID生物功能簇类分析，对功能分析及信号传递通路分 析结果进行整合，绘制金钗石斛与内生菌作用高产石斛碱信号传递网 络，结合标识蛋白和标识代谢物相关信息，对次生代谢途径终产物进 行推导和验证；

S12：关键基因筛选与初步验证，对转录组KEGG功能注解的次生 代谢网络中与石斛碱相关的基因作为待选，这些基因中与代谢组检测 中的时间节点中与石斛碱含量变化具有高度相关性作为目标基因，进 行Q-PCR验证。

优选的，步骤S1中诱导和继代材料为1/2MS+0.2mg/L NAA+30g/L 蔗糖+6g/L琼脂+30g/L马铃薯，pH5.8；1/2MS+0.3mg/L NAA+1.5mg/L 6-BA10％土豆+30g/L蔗糖+6g/L琼脂，pH 5.8。

优选的，所述步骤S2中采用正交实验与响应面法对金钗石斛原 球茎培养中的有机种类与浓度、碳源种类与浓度、激素种类与浓度进 行优化。

优选的，所述步骤S3中取金钗石斛原球茎干燥粉末0.5g，精密 称定，置250mL圆底烧瓶中，加pH＝4的HCl溶液20mL，震荡30min， 然后加入氨水调pH＝10，加氯仿50mL，称重，回流提取2h，称重， 以氯仿补足失重，精密量取续滤液10.0mL，减压回收溶剂至干，加 甲醇溶解，定量转入2mL量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，0.22μm微 孔滤膜过滤，密塞，备用。

优选的，所述步骤S4中收集金钗石斛，取根、茎、叶在0.1％HgCl

优选的，所述步骤S8中分别选取接种不同时间点 0h,1h,2h,4h,8h,16h,24h,48h以及在优良菌株筛选中得到的石斛碱 含量曲线明显上升的点，并提取总RNA，以分析与产石斛碱相关的生 物信息，并挖掘生物信息资源。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

1、本发明的特色之处在于采用用课题组培育的金钗石斛原球茎， 结合其特异内生菌进行石斛碱的生产，利用植物生物反应器在金钗石 斛原球茎增殖上的优势，对于揭示金钗石斛中石斛碱的高效积累机制 的具有积极的意义，同时也是金钗石斛细胞生物反应器构建和定向诱 导次生代谢物的合成积累理论和实验基础；

2、本发明中金钗石斛原球茎的植物生物反应器体系的构建高产 石斛碱的产品从而替代传统金钗石斛的农业生产，目前尚未有关于金 钗石斛原球茎与其内生菌通过植物生物反应器共培养高效生产石斛 碱等有重要药用价值的次生代谢化合物的文献报道，具有原始创新性；

3、本发明将影响金钗石斛的内生菌、营养条件、生长条件三者 结合起来，通过响应面法等新方法来筛选适合与高效稳定生产生物碱 的方法与体系，优化现有培养基配方、培养条件，反应器是液体间歇 浸没培养，提高植物生物反应器培养的金钗石斛原球茎的细胞增殖效 率。

附图说明

图1为本发明的操作流程图；

图2为不同添加量的NaCl及KCl对组培苗生长影响图。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方 案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部 分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普 通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例， 都属于本发明保护的范围。

实施例一

请参阅图1-2，本发明提供一种技术方案：一种稳定高产石斛碱的内生菌与 金钗石斛原球茎共培养方法，所述高产石斛碱的内生菌与金钗石斛原球茎共培 养方法包括以下步骤：

S1：对金钗石斛原球茎制备，选用金钗石斛蒴果，并建立种子诱 导原球茎与增值培养体系，并在此基础上绘制原球茎生长曲线，利用 GC/MS方法鉴定其中石斛碱的含量；

S2：较高繁殖系数金钗石斛原球茎制备，培养基成分与激素类型、 用量是影响植物组织培养最主要的因素之一，对生长状态进行描述和 绘制生长曲线；

S3：金钗石斛原球茎中石斛碱含量测定，以标品石斛碱作为对照， 并进行标准曲线制作；

S4：分离金钗石斛内生菌并鉴定其次生代谢产物，将纯化后的菌 种划线取样、涂片，在显微镜下观察形态，记录；

S5：金钗石斛中内生菌次生代谢产物鉴定，同时将菌种转至真菌 液体培养基中,28℃培养7-15d,将菌样、培养液分别提取产物，进行 GC/MS分析，并与金钗石斛茎段次生代谢产物、石斛碱标品进行比较 分析，挑选次生代谢产物中含有石斛碱的菌种作为共培养的候选菌株；

S6：建立金钗石斛原球茎与内生菌的共培养体系选用在生长曲线 中处于上升期的原球茎，转入植物生物反应器中，接种金钗石斛的内 生菌，添加液体培养基，温度25℃，采用间歇式浸没法进行共培养， 在共培养前后检测金钗石斛原球茎的干湿重变化，检测其中的石斛碱 含量；

S7：优良菌株筛选，将S6得到的候选菌株转入添加有金钗石斛 原球茎的培养瓶中，分别记录接种后7-15d原球茎干湿重变化、其中 石斛碱含量变化，以石斛碱得率最高的菌株作为共培养体系的受试菌；

S8：共培养体系优化，以原球茎的生长时期、相对接种量、液体 培养基组成、培养温度等作为参数，结合GC/MS检测得到石斛碱的得 率进行正交实验设计、响应面法优化共培养体系；

S9：内生菌与金钗石斛原球茎高产石斛碱网络绘制，进行转录组 学检测；

S10：转录组学分析，将组装得到的所有Unigenes，与NCBI的 Nr(非兀余蛋白数据库)、Nt(非冗余核酸数据库)数据库、Swissprot 蛋白数据库、COG数据库以及KEGG蛋白数据库分别进行比对，对 unigenes进行功能注释及GO富集分析，同时对三代转录组得到的数据对其中的转录剪切、单基因变异等信息进行进一步补充，完善转录 组数据信息；

S11：绘制石斛碱积累的功能基因代谢网络，以KEGG等数据库为 依托，结合RNA-Seq揭示的基因表达差异信息，进行代谢通路分析， 采用DAVIDDAVID生物功能簇类分析，对功能分析及信号传递通路分 析结果进行整合，绘制金钗石斛与内生菌作用高产石斛碱信号传递网 络，结合标识蛋白和标识代谢物相关信息，对次生代谢途径终产物进 行推导和验证；

S12：关键基因筛选与初步验证，对转录组KEGG功能注解的次生 代谢网络中与石斛碱相关的基因作为待选，这些基因中与代谢组检测 中的时间节点中与石斛碱含量变化具有高度相关性作为目标基因，进 行Q-PCR验证。

本发明步骤S1中诱导和继代材料为1/2MS+0.2mg/L NAA+30g/L 蔗糖+6g/L琼脂+30g/L马铃薯，pH5.8；1/2MS+0.3mg/L NAA+1.5mg/L 6-BA10％土豆+30g/L蔗糖+6g/L琼脂，pH 5.8，步骤S2中采用正交实 验与响应面法对金钗石斛原球茎培养中的有机种类与浓度、碳源种类 与浓度、激素种类与浓度进行优化，步骤S3中取金钗石斛原球茎干 燥粉末0.5g，精密称定，置250mL圆底烧瓶中，加pH＝4的HCl溶液 20mL，震荡30min，然后加入氨水调pH＝10，加氯仿50mL，称重，回 流提取2h，称重，以氯仿补足失重，精密量取续滤液10.0mL，减压回收溶剂至干，加甲醇溶解，定量转入2mL量瓶中，加甲醇至刻度， 摇匀，0.22μm微孔滤膜过滤，密塞，备用，步骤S4中收集金钗石斛， 取根、茎、叶在0.1％HgCl

在本发明中，本发明的特色之处在于采用具有地域优势的珍稀中 药材金钗石斛，结合其特异内生菌进行石斛碱的生产，利用植物生物 反应器在产量上的更新，这对于揭示金钗石斛中石斛碱的高效积累机 制的具有积极的意义，同时也是金钗石斛细胞生物反应器构建和定向 诱导次生代谢物的合成积累理论和实验基础。

在本发明中，金钗石斛原球茎的植物生物反应器体系的构建高产 石斛碱的产品替代传统金钗石斛的农业生产，目前尚未有关于金钗石 斛原球茎与其内生菌通过植物生物反应器共培养高效生产石斛碱等 有重要药用价值的次生代谢化合物的文献报道，具有原始创新性。

在本发明中，将影响金钗石斛的内生菌、营养条件、生长条件三 者结合起来，通过响应面法等新方法来筛选适合与高效稳定生产生物 碱的方法与体系，优化现有培养基配方、培养条件，提高固体培养和 植物生物反应器培养的金钗石斛原球茎的细胞增殖效率。

实施例二

金钗石斛内生菌分离与真菌产物初步鉴定：

取贵州赤水金钗石斛的根、茎、芽进行消毒灭菌后，转入PDA培 养基中，28℃培养3-5天后统计菌株分离情况，共计分离得到细菌 98株，真菌19株，对长出的菌进行纯化培养，镜检，记录，进一步 对已经纯化的菌株进行扩大培养，7-15d后收集菌体三氯甲烷抽提、过滤、浓缩、GC/MS检测，与石斛碱的标准品(T＝5.91min)比较发 现5株中出现与石斛碱出峰时间相同的峰；产石斛碱的内生真菌分离 物占比为26.3％。

实施例三

金钗石斛原生质体培养体系的建立与优化：

将金钗石斛幼嫩叶片放置在黑暗环境下进行低温质壁分离的预 处理后，添加配制的酶液，采用酶解法制备金钗石斛原生质体，滴加 配制的清洗液清洗纯化后计数并检测原生质体活力，根据 Design-Expert8.0.6软件绘制的反映变量间交互关系的等高线和三维响应曲面图可知，S1和S2、S1和S3、S2和S3的三维响应曲面图 存在最高点，说明响应值具有最大值。再依据二次回归的数学模型分 析结果得到了金钗石斛原生质体培养的最佳组合条件：2,4-D浓度 1.42mg/L、6-BA浓度1.02mg/L、NAA浓度3.18mg/L、孵育时间19.44h， 此时最大的活力率模型预测值为84.62％，这是因为在一定量的培养 基中，孵育时间对原生质体活力的影响很大造成的，此外，通过等高 线分析结果进一步发现，2,4-D浓度与6-BA浓度的互作、2,4-D浓度 与NAA浓度的互作、6-BA浓度与NAA浓度的互作对金钗石斛原生质 体培养均有显著影响。

实施例四

金钗原球茎培养体系建立：根据本发明前期实验基础，金钗石斛 的成熟蒴果进行消毒灭菌，以其中的种子作为实验材料，以67-V、 MS和1/2MS为基本培养基，调整6-BA、NAA等激素配比，适时添加 活性炭、土豆、椰汁和香蕉等物质以优化培养基配方，并添加TDZ类物质以维持种苗的遗传稳定性，目前已筛选出适宜研究材料种子萌发、 原球茎分化和生根壮苗三个生育阶段的最佳培养基配方，构建起金钗 石斛优良品系的组培快繁技术体系，同时将优质的原球茎材料接种在 植物反应器中，初步建立了金钗石斛在植物反应器中的扩繁体系。

实施例五

金钗倍性材料创制：

在本发明中，分离金钗石斛的内生菌，对其的次生代谢产物进行 鉴定验证原球茎增殖研究中响应面设计各因素的优化结果，建立利用 新型植物生物反应器进行金钗石斛原球茎培养技术方案。分析不同的 金钗石斛内生菌与金钗石斛原球茎共培养后的石斛碱的表征检测与 生物总碱的检测，筛选其中促进石斛碱积累的内生菌菌株，对不同内 生真菌与原球茎共培养后的次生代谢产物进行GC/MS检测，比较分析 其中的代谢产物类型与变化趋势。

在本发明中，对优选的能促进金钗石斛原球茎中石斛碱持续、高 效积累的菌种，以其不同的成分建立与植物反应器进行石斛碱生产的 体系，将影响金钗石斛原球茎增殖速率与石斛碱积累的菌种诱导子、 培养基营养成分、胁迫因子、激素等结合，筛选其中高效积累石斛碱 的植物生物反应器的生产条件。

在本发明中，对内生菌处理下，高效积累石斛碱的体系进行转录 组检测、分析、对其中的功能基因的表达轮廓、代谢通路进行分析， 与代谢产物的GC/MS结果进行对应和初步揭示机制，对高效积累石斛 碱的植物生物反应器的生产条件进行验证，对转录组结果与代谢通路 中解析出的关键基因进行筛选，并将其在共培养诱导过程中的变化与 信号识别、信号转导、功能基因表达等关键步骤结合，为揭示内生菌 与药用植物识别、积累目标药用成分的机制提供资料。

尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术 人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这 些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权 利要求及其等同物限定。