一种基于LAMP法的实时荧光定量恒温快速便携式分子检测设备

技术领域

本发明属于分子生物学与医疗检测仪器技术领域，涉及一种基于LAMP法的恒温实时荧光定量快速便携式分子检测设备。

背景技术

LAMP(Loop-mediated isothermal amplification)是一种新型的核酸扩增方法，其特点是针对靶基因的6个区域设计4种特异引物，再链置换DNA聚合酶的的作用下，在60-65°期间进行恒温扩增。在5-30分钟左右可以扩增DNA 100万倍以上。其方法与PCR(Polymerase Chain Reaction，聚合酶链式反应)类似，LAMP法相对简单，并能提供快速，高效，高精度的检测，更适用小型化的仪器的现场检测。

基于Taqman探针的实时荧光LAMP技术其探针是使用5’端带有荧光物质(如：FAM等)，3’端带有淬灭物质(如：TAMRA等)修饰的寡核苷酸进行荧光检测的方法。当探针完整时，5’端的荧光物质受到3’端淬灭物质的制约，不能发出荧光。而当探针被分解后，5’端的荧光物质便会游离出来，发出荧光。当实时荧光反应液中加入荧光探针后，在实时荧光反应的退火过程中，荧光探针便会和模板杂交。进一步在实时荧光反应的延伸过程中，耐热性DNA聚合酶的5’→3’Exonuclease活性可以分解与模板杂交的荧光探针，游离荧光物质发出荧光。通过检测反应体系中的荧光强度，可以达到检测微生物DNA扩增量的目的。

实现LAMP法的实时荧光定量检测技术的仪器称为恒温实时荧光定量检测仪，其本质上就是一个高精度荧光检测和温控设备。基本原理是：光源灯发出激发光，通过光学组件到达具有样本的反应管，样本被激发后发出荧光。被激发出的荧光再经过光学组件到达检测器。滤光镜是光学组件的一个部件，可以使特定波长的光通过，从而达到区分产物的目的。通过滤光镜的荧光经过光学组件后被检测器捕获，捕获后的荧光通过一系列光电转换后，输入计算机进行计算分析。

目前市场上分子检测设备主要基于PCR原理，体积大、质量重、不便携、操作复杂，极易造成样品的污染，且测试时间平均在1-2小时，不适用于室外等一些特殊场景的使用，这使得这些仪器使用场景单一，适用性低，因此不具备快速分析、小型化、便携等现场实时检测和诊断的需求。仅适用于实验室或大中型医疗机构的检验室使用，检测人员一般需要经过相应的培训。基于LAMP的检测方法是近年开发的新兴基因检测技术，特点就是快速，精准，特异性，可重复性好。市场现有的基于LAMP的检测仪还处在初探阶段，在测量精度和速度上都存在不足。

发明内容

为了克服上述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种基于LAMP法的恒温实时荧光定量快速便携式分子检测设备，利用高度集成的荧光检测组件，附以高效的控制软件、以及优化的中央处理控制系统、电源电池管理系统，数据通信系统，把检测时间降低到5到15分钟。并且本发明在提高便携性的基础上把DNA/RNA提取和微生物检测过程集成为一体，实现了仪器小型化和一机多用，减少了检测步骤，同时也减少了样品的污染概率，节约了最终用户的资金投入。简单的检测过程为：在聚合酶链式反应过程中，中央处理控制器实时调控并监测荧光反应系统，配合数据通信系统实现和上位机或手持终端之间的数据实时传输。上位机或手持终端通过相应的通讯系统可以对反应过程进行实时监控，并在聚合酶链式反应结束后通过对反应产物以及熔解曲线的分析得到反应的特异性并对检测结果进行判断。

进一步的本发明所述的基于LAMP法的小型实时荧光定量检测仪，设备包括：荧光反应系统，荧光信号转换系统，中央处理控制系统，电源电池管理系统，数据通信系统组成，数据存储系统。

进一步的本发明所述的基于LAMP法的小型实时荧光定量检测仪，其各系统关系为：聚合酶链式反应台通过内置的荧光激发器对实验样品进行照射，所产生的荧光信号由荧光感应器采集并通过信号放大滤波设置由光电转换器转换为电信号；中央处理器接收并后期处理荧光电信号同时控制各模块有序工作；数据通信系统根据中央处理器的指令，将实时荧光信号发送给上位机或手持终端，上位机或手持终端实时观测聚合酶链式反应的状态，同时对检测结果进行分析和判读。

进一步的本发明所述的小型实时荧光定量反应系统包括聚合酶链式反应台、温度控制系统及温度传感装置，其中：所述聚合酶链式反应台由优良导热性的金属制成，包含两个用于放置8联排反应管的反应槽，两反应槽左右对称，每个反应槽具有8个反应孔。

进一步的本发明所述温度控制系统包括加热模块、热传感器和散热模块，其中加热模块内嵌于所述聚合酶链式反应台内部，当电流通过时，加热模块发热使反应台温度均匀升高，散热模块为一小型风扇，位于反应台下方，当中央处理控制系统发出降温信号时，小型风扇通电工作并使热量散去，温度降低；所述温度传感装置内嵌于金属工作台内部的每一个反应孔内，将反应台(孔)的温度实时采集并反馈给中央处理控制系统。

进一步的本发明所述荧光信号传感系统由荧光传感器，信号放大和过滤器组成，荧光传感器内置在每一个反应孔的侧方90°位置，获取聚合酶链式反应管内反应过程中的实时荧光信号，并最终转换为电信号。

进一步的所述中央处理控制系统，其连接所述电源系统、温度控制系统、光电系统、信号传输系统；中央处理器直接控制加热模块的温度变化并通过散热模块对仪器腔体内的温度进行调节；所述中央处理控制系统采用PID控制原理对反应温度进行精准控制，当温度传感装置采集的温度偏离给定值时，PID控制根据反馈回的测量信号与给定值的偏差进行比例、积分、微分运算，从而输出适当的控制信号对加热模块或散热模块进行调节，促使测量值恢复到给定值，达到自动控制的效果。

进一步的所述数据通信系统，在反应开始之前，聚合酶链式反应的所需参数通过上位机或手持终端进行设置，并通过数据通信系统传递给中央处理器以对反应过程进行控制，所述参数包括温度、时间、样品名称。

进一步的所述设备功能，本系统集成了DNA/RNA提取和聚合酶链式反应，提高了设备的使用性，减少了交叉污染的概率和最终用户的使用成本。

进一步的所述加热模块和散热模块，通过所述中央处理控制系统可以保证聚合酶链式反应温度的均一性为±

进一步的功能所述，在聚合酶链式反应结束之后，中央处理控制系统控制反应台温度上升，使得DNA双螺旋结构降解；在此过程中，荧光信号传感系统(2)采集荧光信号，并通过数据通信系统将信号发送给上位机或手持设备；上位机或手持终端通过分析熔解曲线和熔解温度，完成对反应产物的特异性分析，进而得到检测结果。

附图说明

图1为本发明系统架构图。

图2嵌入式工作台(加热模块)。

图3荧光信号激发与处理。

图4仪器工作流程

具体实施方式：

1、下面根据附图和实施例对本发明作进一步详细说明。

如图1所示，一种基于LAMP法的恒温实时荧光定量快速便携式分子检测设备，包括：中央处理器(1)，小型实时荧光定量反应及检测系统(2)，荧光信号传感系统(3)，电源电池系统(4)，存储系统(5)，触屏控制器(6)，无线通信系统(7)，USB传输系统(8)。

中央处理器通过本机人机交互界面(6)或是上位机及手持设备终端(9)接收测试指令程序；根据不同的实验要求，中央控制器发送测试信号给聚合酶链式反应荧光系统控制台(2)，对加热模块进行升降温控制，并根据每个测试孔实时反馈的温度信息对温度进行微调，同时对超出温控范围的情况给出报警处理；处理器根据预先设定，在适当的时候开启激发光源，并对荧光反应通过光电转换系统(3)转换成高精度电信号；中央处理器对荧光电信号进行分析比对，把测试结果输出到多功能触屏显示器(3)上，或通过无线传输系统(7)把测试结果通过网络传给用户终端。本仪器也可通过USB连接本地电脑进行操作和数据传输；详尽的实验数据会在仪器内部的存储系统(5)进行备份保留；基于便携性的要求，本机带一个高效能电池系统(4)，可以提供8个小时不间断的工作能力。

2、如图2所示，一种基于LAMP法的恒温实时荧光定量快速便携式分子检测设备的核心部件-嵌入式聚合酶链式反应台，包括：加热模块，内置温度采集传感器，内置荧光信号激发器，内置荧光信号采集器，为了减少信号损失，荧光信号分析转换电路(图3)也附着在反应台上。

反应台由具有优良导热性的金属制成，加热模块镶嵌在工作台上，紧密贴近试管反应槽，给反应槽提供高精准的温度控制(±0.1°)。工作台包含2个图3所示的用于放置聚合酶链式反应管的反应槽，两个反应槽左右对称，每个反应槽具有8个反应孔；根据中央控制器的指令，当电流通过时，加热模块发热使反应台整体温度升高促使测试样品进行DNA链式反应；位于每一个反应孔底部的内嵌式荧光激发器在适当的时候激发试管内的荧光物质，在反应孔侧面90°位置的内嵌式荧光感应器会在采集所需荧光信号。荧光信号经过复杂的放大，滤波和光电转换器(图3)转变为微弱电信号，经过进一步放大，传输给中央处理器进行数据分析最终给出实验结果。此处散热模块为一小型风扇，位于聚合酶链式反应台下方，当中央处理控制系统发出降温信号时，小型风扇通电工作并使热量散去，温度降低；所述温度传感装置内置于反应台上每一个反应孔内部，将反应管的温度实时采集并反馈给中央处理控制系统。

3、本实例所述的是一种基于LAMP法的恒温实时荧光定量快速便携式分子检测设备其主要使用方法如下：

如图D所示，本发明设备有四个主要预设功能模块，功能模块可以根据用户的需求自己增减。

功能模块1是：扩增和退火；选择此功能键，设备会按照预先设计好的程序对样品进行DNA的检测，符合快速及简单操作的要求。可以只使用反应槽A或B，也可以同时使用两个反应槽进行16个样品的同时操作。此功能模块的设置可以由相关技术人员进行更改和存储。

功能模块2是：退火；在此功能下设备只进行预设的退火过程，此功能模块的设置也可以由相关技术人员进行更改和并存储。

功能模块3是：是DNA提取功能；同功能模块1和2类似，选择此功能本发明设备会按照预设的程序对反应槽A或B或A和B同时进行8到16个样品的操作。功能设置同样可以由技术人员进行更改和设置。

功能模块4是：设备设置；进入此模块可以对设备的操作系统进行重置，调节显示亮度，查看并上传本机文件；本模块还可以对设备时间日期，电池管理，屏幕校准，以及显示器背景进行设置。