一种抗癌喹喔啉嘧啶胺杂环化合物及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及药物化学领域，具体为一种抗癌喹喔啉嘧啶胺杂环化合物及其制备方法和应用。

背景技术

细胞增殖和生长受到细胞周期调控机制的严格控制，细胞分裂失调会导致细胞异常增殖，是癌症的关键标志之一，因此，靶向调节细胞周期的药物一直是研究热点。周期蛋白依赖性激酶(CDK)是一类依赖细胞周期蛋白(Cyclin)的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，可作为催化亚基与Cyclin结合形成异二聚体，磷酸化对应底物驱动细胞周期。其中，CDK6与肿瘤关系密切，在肿瘤细胞中常见扩增现象，主要调控后生动物中G1期到S期的过渡，在细胞周期的G1期的前期，会与D型细胞周期蛋白结合表现出蛋白激酶活性，磷酸化视网膜母细胞瘤蛋白(RB)促进转录因子E2F的释放，加快细胞周期由G1期向S期的进展。因此，抑制CDK6可以减慢细胞周期进程，产生抗增殖和抗癌的作用。

莫洛尼小鼠白血病病毒前病毒整合激酶1(PIM1)是一种结构独特的丝氨酸/苏氨酸激酶，在多种恶性血液瘤和一些实体瘤中高度表达。PIM1激酶通过磷酸化不同的底物在不同阶段刺激细胞周期进程，如分别活化Cdc25A和Cdc25C加快G1期到S期和G2期到M期进程；磷酸化CDK抑制剂p27

发明内容

本发明的目的是提供一种全新母核的喹喔啉嘧啶胺杂环化合物，对CDK6和PIM1产生抑制作用。本发明还提供了该化合物的具体制备方法和应用于制备喹喔啉嘧啶胺杂环化合物的制药应用。

技术方案：本发明所述的一种通式(S)所示的化合物或其药学上可接受的盐、酯、立体异构体、溶剂化合物或前药：

其中，

所述X选自C(O)或(CH

所述R

所述R

所述R

所述R

当R

在本发明的一些实施例中，所述X为C(O)或(CH

在本发明的一些实施例中，所述R

在本发明的一些实施例中，所述R

在本发明的一些实施例中，所述R

在本发明的一些实施例中，所述R

在本发明的一些实施例中，所述X为C(O)或(CH

在本发明的另一些实施例中，优选地：所述X选自：(CH

在本发明的一些具体的实施例中，本发明还提供选自S-1至S-48所示的化合物或其药学上可接受的盐、酯、立体异构体、溶剂化合物或前药：

上述药学上可接受的盐为通式(I)化合物的酸加成盐，其中用于成盐的酸包括无机酸及有机酸，所述无机酸包括：盐酸、硫酸、磷酸和甲磺酸，有机酸包括乙酸、三氯乙酸、丙酸、丁酸、马来酸、对甲苯磺酸、苹果酸、丙二酸、肉桂酸、柠檬酸、富马酸、樟脑酸、二葡糖酸、天冬氨酸和酒石酸。

优选地，本发明中所述的药学上可接受的盐为盐酸盐。

本发明通式(S)化合物的制备方法，由化合物(A)与化合物(B)在钯催化剂的作用下经偶联反应制备化合物(S)：

其中，X、R

本发明还公开了一种药用组合物，包含上述通式(S)所示的化合物或其药学上可接受的盐、酯、立体异构体、溶剂化合物或前药，以及药学上可接受的载体。

药学上可接受的载体指的是对有机体不引起明显的刺激性和不干扰所给予化合物的生物活性和性质的赋形剂或稀释剂。

本发明还提供了一种式(S)化合物或其药学上可接受的盐、酯、立体异构体、溶剂化合物或前药或本发明所述的组合物在制备药物中的用途。

本发明还提供了一种式(S)化合物或其药学上可接受的盐、酯、立体异构体、溶剂化合物或前药或本发明所述的组合物在制备CDK6抑制剂中的应用。

本发明还提供了一种式(S)化合物或其药学上可接受的盐、酯、立体异构体、溶剂化合物或前药或本发明所述的组合物在制备PIM1激酶抑制剂中的应用。

本发明所述的化合物或其药学上可接受的盐、酯、立体异构体、溶剂化合物或前药或本发明所述的组合物在制备治疗癌症或肿瘤相关疾病药物中的应用。癌症或肿瘤相关疾病包括但不限于白血病、乳腺癌、前列腺癌、肺癌、多发性骨髓瘤、肝癌、胃癌、骨癌、脑癌、头颈癌、肠癌、胰腺癌、膀胱癌、睾丸癌、卵巢癌、子宫内膜癌等。

本发明所述的通式(S)化合物或其药学上可接受的盐，具有CDK4/6双靶点抑制活性，对细胞恶性增值肿瘤具有治疗效果。

本发明中的术语除特别说明外，一般具有如下的含义。

术语“烷基”表示具有所述数目之碳原子的直链或支链饱和烃基。

术语“C

术语“烷氧基”表示O-烷基。术语“C

术语“卤素”为氟、氯、溴或碘。优选为氟、氯、溴。

术语“杂芳基”表示单环或稠合环基团，含有一个、两个、三个或四个选自N、O或S的环杂原子，其余环原子是C，另外具有完全共轭的π电子系统。术语“C

术语“杂芳基”表示单环或稠合环基团，含有一个、两个、三个或四个选自N、O或S的环杂原子，其余环原子是C，另外具有完全共轭的π电子系统。术语“C

有益效果：本发明和现有技术相比，具有如下显著性特点：本发明公开了一种新的通式(Ⅰ)所示的化合物，能够同时抑制癌症发生的多个通路、治疗效果好、毒性低、具有良好药物代谢特性、不易产生耐药性问题，可用于制备治疗癌症或肿瘤相关疾病药物；本发明还公开了通式(Ⅰ)化合物的制备方法。

附图说明

图1是本发明急性毒性测定中实施例S41对小鼠的体重变化的影响；

图2是本发明急性毒性测定中灌胃给予小鼠10000mg/kg时的HE染色结果图。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。下面结合具体实施例对本申请作出详细说明。

一、中间反应物的合成

反应物(A)和反应物(B)可以直接购买或者自主研发，自主研发能够显著降低成本。自主研发反应物(ZA)和反应物(ZB)的具体制备方法如下：

1)6-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二噁硼戊烷-2-基)喹喔啉(ZA1)的合成

将6-溴喹喔啉(9.745g,46mmol)溶于DMF(150mL),然后加入频哪醇硼酸酯(13.022g,51mmol),Pd(dppf)Cl

2)6-(2-氯-5-氟嘧啶-4-基)喹喔啉(ZA2)的合成

将2，4-二氯-5-氟嘧啶(0.935g,5.6mmol)加到三颈烧瓶中，再加入Pd(PPh

3)6-溴-2,3-二甲基喹喔啉(ZA3)的合成

4-溴苯-1,2-二胺(374mg,2.0mmol)和2,3-丁二酮(173mg,2.0mmol)溶于乙醇(15mL)中，室温反应5h，过滤浓缩，快速硅胶柱纯化得到化合物ZA3(425mg,产率为90％)。

4)7-溴-N，N-二甲基喹喔啉-2-胺(ZA4)的合成

7-溴-2-氟喹喔啉(100mg,0.45mmol)与二甲胺(23mg，0.5mmol)混合与THF(0.33mL)中，50℃回流一晚。过滤浓缩，快速硅胶柱纯化得到化合物ZA4(214mg，产率为85％)。

5)7-溴-N，N-二乙基喹喔啉-2-胺(ZA5)的合成

参照化合物(ZA4)的合成方法，产率为84％。

6)4-(7-溴喹喔啉-2-基)吗啉(ZA6)的合成

7-溴-2-氯喹喔啉(244mg,1.0mmol)，吗啉(435mg，5mmol)和碳酸钾(414mg，3mmol)溶于乙腈中，90℃回流一晚。过滤浓缩，快速硅胶柱纯化得到化合物ZA6(265mg，产率为90％)。

7)2,3-二甲基-6-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂硼烷-2-基)喹喔啉(ZA7)的合成

参照化合物(ZA1)的合成方法，产率为84％。

8)N，N-二甲基-7-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂硼烷-2-基)喹喔啉-2-胺(ZA8)的合成

参照化合物(ZA1)的合成方法，产率为86％。

9)N，N-二乙基-7-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂硼烷-2-基)喹喔啉-2-胺(ZA9)的合成

参照化合物(ZA1)的合成方法，产率为80％。

10)4-(7-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂硼硼烷-2-基)喹喔啉-2-基)吗啉(ZA10)的合成

参照化合物(ZA1)的合成方法，产率为87％。

11)6-(2-氯-5-氟嘧啶-4-基)-2,3-二甲基喹喔啉(ZA11)的合成

参照化合物(ZA2)的合成方法，产率为84％。

12)7-(2-氯-5-氟嘧啶-4-基)-N，N-二甲基喹喔啉-2-胺(ZA12)的合成

参照化合物(ZA2)的合成方法，产率为80％。

13)7-(2-氯嘧啶-4-基)-N，N-二甲基喹喔啉-2-胺(ZA13)的合成

参照化合物(ZA2)的合成方法，产率为79％。

14)7-(2-氯-5-甲氧基嘧啶-4-基)-N，N-二甲基喹喔啉-2-胺(ZA14)的合成

参照化合物(ZA2)的合成方法，产率为81％。

15)7-(2-氯-5-氟嘧啶-4-基)-N，N-二乙基喹喔啉-2-胺(ZA15)的合成

参照化合物(ZA2)的合成方法，产率为85％。

16)4-(7-(2-氯-5-氟嘧啶-4-基)喹喔啉-2-基)吗啉(ZA16)的合成

参照化合物(ZA2)的合成方法，产率为85％。

17)叔丁基4-(6-胺基烟碱酰基)哌嗪-1-羧酸酯(ZB1)的合成。

称取6-氨基烟酸(0.28g,2.0mmol)，哌嗪-1-羧酸叔丁酯(0.45g,2.4mmol)溶于DMF(5mL)，70℃反应10min，室温再搅拌1h，加入N-乙基哌嗪(0.46g,4.0mmol)，室温反应过夜，浓缩，快速硅胶柱纯化得到化合物ZB1(0.54g,产率为87％)。

18)叔丁基4-(6-胺基吡啶-3-基)哌嗪-1-羧酸酯(ZB2)的合成

步骤一，叔丁基4-(6-硝基吡啶-3-基)哌嗪-1-羧酸酯的合成：称取5-溴-2-硝基吡啶(0.41g,2.0mmol)，叔丁基哌嗪-1-羧酸酯(0.48g,2.6mmol)和三乙胺(0.41g,4.0mmol)溶于DMSO(5mL),加热至60℃，反应18h。冷却过滤浓缩，快速硅胶柱纯化得到化合物叔丁基4-(6-硝基吡啶-3-基)哌嗪-1-羧酸酯(0.49g,产率为80％)。

步骤二，叔丁基4-(6-胺基吡啶-3-基)哌嗪-1-羧酸酯的合成：称取叔丁基4-(6-硝基吡啶-3-基)哌嗪-1-羧酸酯(0.31g,1.0mmol)，还原铁粉(0.17g,3.0mmol)和氯化铵(0.49g,9.0mmol)溶于70％乙醇(10mL),加热至70℃，反应6h。冷却过滤浓缩，快速硅胶柱纯化得到化合物ZB2(0.24g,产率为85％)。

19)4-((6-氨基吡啶-3-基)甲基)哌嗪-1-甲酸乙酯(ZB3)的合成

2-氨基-5-醛基吡啶(0.32g,2.6mmol)和N-哌嗪甲酸乙酯(0.62g,3.9mmol)溶于1,2-二氯乙烷(20mL)，室温搅拌2h，随后加入三乙酰基硼氢化钠(0.87g,4.1mmol)，室温搅拌8h。加入1M NaOH(30mL)淬灭，DCM(20mL*3)萃取，无水硫酸钠干燥，浓缩后柱层析(DCM/MeOH＝10:1)得到化合物DB3(0.59g,产率为86％)。

20)(6-氨基吡啶-3-基)(4-甲基哌嗪-1-基)甲酮(ZB4)的合成

参考化合物(ZB1)的合成方法，产物为淡黄色，产率为85％。

21)5-((4-(甲基磺酰基)哌嗪-1-基)甲基)吡啶-2-胺(ZB5)的合成

参考化合物(ZB3)的合成方法，产率为90％。

22)5-((4-异丙基哌嗪-1-基)甲基)吡啶-2-胺(ZB6)的合成

参考化合物(ZB3)的合成方法，产率为81％。。

23)5-((4-乙基哌嗪-1-基)甲基)吡啶-2-胺(ZB7)的合成

参考化合物(ZB3)的合成方法，产率为84％。

24)(6-氨基吡啶-3-基)(4-异丙基哌嗪-1-基)甲酮(ZB8)的合成

参考化合物(ZB1)的合成方法，产率为85％。

25)叔丁基4-((6-胺基吡啶-3-基)甲基)哌嗪-1-羧酸酯(ZB9)的合成

参考化合物(ZB3)的合成方法，产率为86％。

26)(6-氨基吡啶-3-基)(4-乙基哌嗪-1-基)甲酮(ZB10)的合成

参考化合物(ZB1)的合成方法，产率为82％。

27)5-(4-甲基哌嗪-1-基)吡啶-2-胺(ZB11)的合成

参考化合物(ZB2)的合成方法，产率分别为82％和85％。1-甲基-4-(6-硝基吡啶-3-基)哌嗪：

二、化合物S-1-S-48的合成

实施例1：

叔丁基4-(6-((4-(喹喔啉-6-基)-5-氟嘧啶-2-基)胺)烟酰胺基)哌嗪-1-羧酸酯(S-1)的合成

化合物ZA2(390.1mg,1.5mmol)和ZB1(551.5mg,1.8mmol)溶于二氧六环(15mL)，然后加入Pd

实施例2：

6-((4-(喹喔啉-6-基)-5-氟嘧啶-2-基)胺)吡啶-3-基)(4--异丙基哌嗪-1-基)甲酮(S-2)的合成

参考实施例1的合成方法，产率为40％。淡黄色固体；

实施例3：

6-((4-(喹喔啉-6-基)-5-氟嘧啶-2-基)胺)吡啶-3-基)(4—甲基哌嗪-1-基)甲酮(S-3)的合成:

参考实施例1的合成方法，产率为37％。淡黄色固体；

实施例4：

6-((4-(喹喔啉-6-基)-5-氟嘧啶-2-基)胺)吡啶-3-基)(哌嗪-1-基)甲酮盐酸盐(S-4)的合成:

将实施例1溶于二氯甲烷中，0℃条件下通入HCl气体反应2h。反应结束后，浓缩得到化合物S4，产率为100％。淡黄色固体；

实施例5：

叔丁基4-((6-((4-(喹喔啉-6-基)-5-氟嘧啶-2-基)胺)吡啶-3-基)哌嗪-1-羧酸酯(S-5)的合成：

参考实施例1的合成方法，产率为37％。黄色固体；

实施例6：

4-(喹喔啉-6-基)-5-氟-N-(5-(哌嗪-1-基)吡啶-2-基)嘧啶-2-胺盐酸盐(S-6)的合成：

参考实施例4的合成方法，产率为100％。红棕色固体；

实施例7：

4-(喹喔啉-6-基)-5-氟-N-(5-((4-(甲磺酰基)哌嗪-1-基)甲基)吡啶-2-基)嘧啶-2-胺(S-7)的合成:

参考实施例1的合成方法，产率为30％。黄色固体；

实施例8：

4-(喹喔啉-6-基)-5-氟-N-(5-((4-异丙基哌嗪-1-基)甲基)吡啶-2-基)嘧啶-2-胺(S-8)的合成:

参考实施例1的合成方法，产率为40％。黄色固体；

实施例9：

乙基4-((6-((4-(喹喔啉-6-基)-5-氟嘧啶-2-基)胺)吡啶-3-基)甲基)哌嗪-1-羧酸酯(S-9)的合成:

参考实施例1的合成方法，产率为37％。淡黄色固体；

实施例10：

6-((4-(2,3-二甲基喹喔啉-6-基)-5-氟嘧啶-2-基)胺)吡啶-3-基)(4-甲基哌嗪-1-基)甲酮(S-10)的合成：

参考实施例1的合成方法，产率为34％。灰白色固体；

实施例11：

4-(2,3-二甲基喹喔啉-6-基)-5-氟-N-(5-((4-乙基哌嗪-1-基)甲基)吡啶-2-基)嘧啶-2-胺(S-11)的合成：

参考实施例1的合成方法，产率为33％。淡黄色固体；

实施例12：

6-((4-(2,3-二甲基喹喔啉-6-基)-5-氟嘧啶-2-基)胺)吡啶-3-基)(4-异丙基哌嗪-1-基)甲酮(S-12)的合成：

参考实施例1的合成方法，产率为34％。白色固体；

实施例13：

4-(2,3-二甲基喹喔啉-6-基)-5-氟-N-(5-((4-异丙基哌嗪-1-基)甲基)吡啶-2-基)嘧啶-2-胺(S-13)的合成：

参考实施例1的合成方法，产率为32％。淡黄色固体；

实施例14：

叔丁基4-(6-((4-(2,3-二甲基喹喔啉-6-基)-5-氟嘧啶-2-基)胺)烟酰胺基)哌嗪-1-羧酸酯(S-14)的合成：

参考实施例1的合成方法，产率为32％。淡黄色固体；

实施例15：

叔丁基4-((6-((4-(2,3-二甲基喹喔啉-6-基)-5-氟嘧啶-2-基)胺)吡啶-3-基)甲基)哌嗪-1-羧酸酯(S-15)的合成：

参考实施例1的合成方法，产率为35％。黄色固体；

实施例16：

叔丁基4-((6-((5-氟-4-(2,3-二甲基喹喔啉-6-基)嘧啶-2-基)胺)吡啶-3-基)甲基)哌嗪-1-羧酸酯(S-16)的合成：

参考实施例1的合成方法，产率为34％。淡黄色固体；

实施例17：

6-((4-(2,3-二甲基喹喔啉-6-基)-5-氟嘧啶-2-基)胺)吡啶-3-基)(哌嗪-1-基)甲酮盐酸盐(S-17)的合成：

参考实施例4实施例4的合成方法，，产率为100％。绿色固体；

实施例18：

4-(2,3-二甲基喹喔啉-6-基)-5-氟-N-(5-(哌嗪-1-基)吡啶-2-基)嘧啶-2-胺盐酸盐(S-18)的合成：

参考实施例4的合成方法，产率为100％。棕色固体；

实施例19：

5-氟-4-(2,3-二甲基喹喔啉-6-基)-N-(5-(哌嗪-1-基甲基)吡啶-2-基)嘧啶-2-胺盐酸盐(S-19)的合成：

参考实施例4的合成方法，产率为100％。灰绿色固体；

实施例20：

(6-((4-(3-(二甲胺)喹喔啉-6-基)-5-氟嘧啶-2-基)胺)吡啶-3-基)(4-异丙基哌嗪-1-基)甲酮(S-20)的合成：

参考实施例1的合成方法，产率为33％。黄色固体；

实施例21：

叔丁基4-(6-((4-(3-(二甲胺)喹喔啉-6-基)-5-氟嘧啶-2-基)胺)烟碱酰基)哌嗪-1-羧酸酯(S-21)的合成：

参考实施例1的合成方法，产率为36％。黄色固体；

实施例22：

叔丁基4-((6-((4-(3-(二甲胺)喹喔啉-6-基)-5-氟嘧啶-2-基)胺)吡啶-3-基)哌嗪-1-羧酸酯(S-22)的合成：

参考实施例1的合成方法，产率为32％。黄色固体；

实施例23：

6-((4-(3-(二甲胺)喹喔啉-6-基)-5-氟嘧啶-2-基)胺)吡啶-3-基)(哌嗪-1-基)甲酮盐酸盐(S-23)的合成：

参考实施例4的合成方法，产率为100％。黄色固体；

实施例24：

7-(5-氟-2-((5-(哌嗪-1-基)吡啶-2-基)胺)嘧啶-4-基)-N,N-二甲基喹喔啉-2-胺盐酸盐(S-24)的合成：

参考实施例4的合成方法，产率为100％。黄色固体；

实施例25：

(6-((4-(3-(二甲胺)喹喔啉-6-基)-5-甲氧基嘧啶-2-基)胺)吡啶-3-基)(4-异丙基哌嗪-1-基)甲酮(S-25)的合成：

参考实施例1的合成方法，产率为34％。黄色固体；

实施例26：

叔丁基4-(6-((4-(3-(二甲胺)喹喔啉-6-基)-5-甲氧基-2-基)胺)烟碱酰基)哌嗪-1-羧酸酯(S-26)的合成：

参考实施例1的合成方法，产率为36％。黄色固体；

实施例27：

叔丁基4-((6-((4-(3-(二甲胺)喹喔啉-6-基)-5-甲氧基嘧啶-2-基)胺)吡啶-3-基)哌嗪-1-羧酸(S-27)的合成：

参考实施例1的合成方法，产率为33％。黄色固体；

实施例28：

(6-((4-(3-(二甲胺)喹喔啉-6-基)嘧啶-2-基)胺)吡啶-3-基)(4-异丙基哌嗪-1-基)甲酮(S-28)的合成：

参考实施例1的合成方法，产率为32％。黄色固体；

实施例29：

叔丁基4-(6-((4-(3-(二甲胺)喹喔啉-6-基)嘧啶-2-基)胺)烟碱酰基)哌嗪-1-羧酸酯(S-29)的合成：

参考实施例1的合成方法，产率为33％。黄色固体；

实施例30：

叔丁基4-((6-((4-(3-(二甲胺)喹喔啉-6-基)嘧啶-2-基)胺)吡啶-3-基)哌嗪-1-羧酸酯(S-30)的合成：

参考实施例1的合成方法，产率为32％。黄色固体；

实施例31：

6-((4-(3-(二甲胺)喹喔啉-6-基)-5-甲氧基嘧啶-2-基)胺)吡啶-3-基)(哌嗪-1-基)甲酮盐酸盐(S-31)的合成：

参考实施例4的合成方法，产率为100％。黄色固体；

实施例32：

7-(5-甲氧基-2-((5-(哌嗪-1-基)吡啶-2-基)胺)嘧啶-4-基)-N,N-二甲基喹喔啉-2-胺盐酸盐(S-32)的合成：

参考实施例4的合成方法，产率为100％。棕色固体；

实施例33：

6-((4-(3-(二甲胺)喹喔啉-6-基)嘧啶-2-基)胺)吡啶-3-基)(哌嗪-1-基)甲酮盐酸盐(S-33)的合成：

参考实施例4的合成方法，产率为100％。黄色固体；

实施例34：

7-(2-((5-(哌嗪-1-基)吡啶-2-基)胺)嘧啶-4-基)-N,N-二甲基喹喔啉-2-胺盐酸盐(S-34)的合成：

参考实施例4的合成方法，产率为100％。棕色固体；

实施例35：

(6-((4-(3-(二乙胺)喹喔啉-6-基)-5-氟嘧啶-2-基)胺)吡啶-3-基)(4-异丙基哌嗪-1-基)甲酮(S-35)的合成:

参考实施例1的合成方法，产率为32％。黄色固体；H NMR(400MHz,CDCl

实施例36：

叔丁基4-(6-((4-(3-(二乙胺)喹喔啉-6-基)-5-氟嘧啶-2-基)胺)烟碱酰基)哌嗪-1-羧酸酯(S-36)的合成:

参考实施例1的合成方法，产率为35％。黄色固体；

实施例37：

6-((4-(3-(二乙胺)喹喔啉-6-基)-5-氟嘧啶-2-基)胺)吡啶-3-基)(哌嗪-1-基)甲酮盐酸盐(S-37)的合成：

参考实施例4的合成方法，产率为100％。黄色固体；

实施例38：

(6-((4-(3-(二乙胺)喹喔啉-6-基)-5-氟嘧啶-2-基)胺)吡啶-3-基)(4-乙基哌嗪-1-基)甲酮(S-38)的合成：

参考实施例1的合成方法，产率为33％。黄色固体；

实施例39：

叔丁基4-((6-((4-(3-(二乙胺)喹喔啉-6-基)-5-氟嘧啶-2-基)胺)吡啶-3-基)哌嗪-1-羧酸酯(S-39)的合成：

参考实施例1的合成方法，产率为32％。黄色固体；

实施例40：

7-(5-氟-2-((5-(哌嗪-1-基)吡啶-2-基)胺)嘧啶-4-基)-N,N-二乙基喹喔啉-2-胺盐酸盐(S-40)的合成：

参考实施例4的合成方法，产率为100％。黄色固体；

实施例41：

4-(3-(二乙胺)喹喔啉-6-基)-5-氟-N-(5-((4-异丙基哌嗪-1-基)甲基)吡啶-2-基)嘧啶-2-胺(S-41)的合成：

参考实施例1的合成方法，产率为34％。黄色固体；

实施例42：

4-(3-(二乙胺)喹喔啉-6-基)-5-氟-N-(5-((4-甲基哌嗪-1-基)吡啶-2-基)嘧啶-2-胺(S-42)的合成：

参考实施例1的合成方法，产率为32％。黄色固体；

实施例43：

叔丁基4-((6-((4-(3-吗啉代喹喔啉-6-基)-5-氟嘧啶-2-基)胺)吡啶-3-基)哌嗪-1-羧酸酯(S-43)的合成：

参考实施例1的合成方法，产率为33％。黄色固体；

实施例44：

叔丁基4-(6-((4-(3-吗啉代喹喔啉-6-基)-5-氟嘧啶-2-基)胺)烟碱酰基)哌嗪-1-羧酸酯(S-44)的合成：

参考实施例1的合成方法，产率为35％。黄色固体；

实施例45：

6-((4-(3-吗啉代喹喔啉-6-基)-5-氟嘧啶-2-基)胺)吡啶-3-基)(哌嗪-1-基)甲酮盐酸盐(S-45)的合成：

参考实施例4的合成方法，产率为100％。棕黄色固体；

实施例46：

4-(3-吗啉代喹喔啉-6-基)-5-氟-N-(5-(哌嗪-1-基)吡啶-2-基)嘧啶-2-胺盐酸盐(S-46)的合成：

参考实施例4的合成方法，产率为100％。黄色固体；

实施例47：

4-(3-吗啉代喹喔啉-6-基)-5-氟-N-(5-((4-异丙基哌嗪-1-基)甲基)吡啶-2-基)嘧啶-2-胺(S-47)的合成：

参考实施例1的合成方法，产率为32％。黄色固体；

三、生物学评价实验

(1)CDK6激酶活性分析检测方法

为考察实例化合物对CDK6/cyclinD1蛋白激酶的抑制作用，采用PerkinElmer公司的Lance Ultra方法进行检测。在检测板中将蛋白激酶、Ulight标记的多肽底物、ATP及化合物混合，并孵育反应。之后，加入EDTA终止反映，并加入铕(Eu)螯合物标记的抗体进行检测。本实验采用PerkinElmer公司的Envision仪器进行分析，模式为TR-FRET。在320/340nm波长激发后，可以发射665nm和615nm波长的荧光信号。Eu可以将能量转移至相邻的荧光物质Ulight受体上，再对该发射光进行检测。首先用DMSO将化合物溶解并稀释至2mM，然后3倍稀释10个浓度，使最终实验板中化合物浓度为10μM至0.508nM。再将CDK6/cyclinD1(LifeTechnologies)和Ulight-4E-BPI-peptide substrate(珀金埃尔默)分别用反应缓冲液(50mM Hepes PH 7.5，10mM MgCl

测得的IC

表1本发明化合物对CDK6激酶活性的IC

(2)PIM1激酶活性分析检测方法

通过电泳迁移率变动分析检查化合物对PIM1激酶的抑制效果。测定在384孔板中进行，首先将30μM ATP和测试化合物添加到33ng/mL PIM1和1.5μM FAM-Pimtide(5FAM-ARKRRRHPSGPPTA，Caliper Life Sciences，Hopkinton，MA)中引发酶促反应(反应缓冲液为50mM Hepes(pH 7.4),10mM MgCl

测得的IC

表2本发明化合物对PIM1激酶活性的IC

(3)对多种癌细胞增殖抑制作用测定

化合物对人乳腺癌(MCF-7、MDA-MB-231)细胞系、多发性骨髓瘤(RPMI8226)细胞系、白血病(HL-60、K562)细胞系、肺癌(A-549、非小细胞肺癌NCI-H1650)细胞系、胃癌(MGC-803)细胞系、卵巢癌(SK-OV-3)细胞系、人结肠癌(HT-29)细胞系、肝癌(HepG2)细胞系、胰腺癌(Panc-1)细胞系、人神经胶质瘤(U251)细胞系和前列腺癌(PC-3)细胞系等14种细胞增殖抑制作用通过以下的方法进行测试。

实验步骤：

按照MTT法进行测定化合物对多种癌细胞增殖的抑制作用，并得出化合物抑制细胞增殖活性的半数抑制浓度IC

1)将对数生长期细胞以1×10

2)向培养板加入梯度稀释的不同浓度的待测化合物溶液100μL，将培养板在37℃，5％CO

3)孵育结束前4h，每孔加入20μL MTT溶液(5mg/mL)。孵育结束后，弃去各孔上清液，每孔加入150μL DMSO，细胞振荡仪上振荡10min，待结晶物充分溶解后用酶标仪测定OD

4)得出数据后，GraphPad Prism 6拟合得出IC

本发明中的化合物对多种癌症细胞增殖活性的试验进行测定，测得的IC

表3实施例40对多种癌细胞增殖活性抑制IC

(4)化合物急性毒性测定

受试动物：ICR小鼠(由上海斯莱克实验动物有限责任公司提供)；18-22g；雌性；共20只。

组别剂量设置：1000mg/kg组：灌胃药物，给药1次，5只小鼠，观察14天；2500mg/kg组：灌胃药物，给药1次，5只小鼠，观察14天；5000mg/kg组：灌胃药物，给药1次，5只小鼠，观察14天；10000mg/kg组：灌胃药物，给药1次，5只小鼠，观察14天；

表4组别剂量设置

试验室环境：室温24±2℃，相对湿度60～70％。观察指标：将受试药物(实施例40所制得的化合物)按表3的剂量给药1次，记录小鼠中毒症状及死亡情况，死亡动物进行尸检。观察期为14天。结果表明：各组小鼠给药后12h之内，动物未见异常。给药24h内未见动物死亡，给药第14天后动物未见死亡。未见其他明显异常。

体重变化如图1，本实验结果显示，受试药物灌胃给予1000mg/kg，2500mg/kg，5000mg/kg，10000mg/kg未见毒性反应。

HE染色结果如图2，实施例40对心、肝、脾、肺、肾等主要器官未见明显毒性。

(5)化合物药代动力学测定

称取供试品置于无菌小瓶中，加入250mL DMSO，再加入10μL甲磺酸，溶解后，加入4.78mL 5％葡萄糖注射液，超声、振荡混匀，配制成2mg/mL的供试品溶液，以此溶液作为灌胃给药制剂。另外，取0.5mL 2mg/mL的供试品溶液，加入4.5mL的5％葡萄糖注射液，振荡混匀，配制成0.2mg/mL的供试品溶液，作为静脉注射给药制剂。

实施例40按5mg/kg和50mg/kg剂量分别对大鼠进行静脉注射给药和灌胃给药并在给药后，在给药前后既定时间取血并分离出血浆，测定血药浓度。根据灌胃给药测定结果，选取给药后2h取血以及心、肝、脾、肺、肾、胃、肠、脑、肌肉、附睾脂肪、睾丸等组织。建立HPLC-MS/MS方法测定给药后实施例41在大鼠血浆及组织中的浓度，利用WinNonlin统软件计算药动学参数,结果如表5。

结果表明实施例40具有吸收慢，代谢快，分布广的药动学特性，且其与组织蛋白的结合力较弱，较易再次释放入血，从而对药动学行为产生明显影响。且可快速且广泛分布到各个组织，血流丰富的组织如肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、心脏中药物浓度较高，分别为30.27、10.71、31.69、12.60、5.13μg/g组织；另外，在肌肉中的浓度也达到1.31μg/g。

表5药代动力学参数记录

(6)化合物抗AML活性测定

药物为实施例40所制得的化合物与Palbociclib。细胞株为人急性早幼粒细胞白血病细胞株HL-60于含10％胎牛血清的RPMI-1640培养基中培养。受试动物为SPF级BALB/c裸小鼠；雄性；每组5只。药物剂量设置如表6。

表6药物剂量配置

药物配制方法：

实施例40(100mg/kg)：称取20mg待测试化合物粉末溶于2mL生理盐水，配成浓度为10mg/mL药物，口服灌胃给药，给药体积为0.2mL/20g。

实施例40(200mg/kg)：称取40mg待测试化合物粉末溶于2mL生理盐水，配成浓度为20mg/mL药物，口服灌胃给药，给药体积为0.2mL/20g。

Palbociclib(100mg/kg)：称取20mg待测试化合物粉末溶于2mL生理盐水，配成浓度为10mg/mL药物，口服灌胃给药，给药体积为0.2mL/20g。

实验方法：人急性髓性白血病裸鼠移植瘤模型，由人急性早幼粒细胞白血病细胞株HL-60接种于裸鼠腋窝皮下而建立。取对数生长期的HL-60细胞，在无菌条件下，接种于30只裸小鼠右侧腋窝皮下，细胞接种量为5×10

实验结果显示：受试药实施例40(100mg/kg)低剂量组、实施例40(200mg/kg)高剂量组与模型组对比相对肿瘤增殖率T/C(％)分别55.1％，39.3％，肿瘤生长抑制率分别为44.9％、60.7％。阳性药Palbociclib以100mg/kg剂量灌胃给药，相对肿瘤增殖率T/C(％)为41.1％，抑瘤率为58.9％。

因此，实施例40制得的受试药对人急性髓性白血病HL-60裸鼠异种移植瘤生长有明显的抑制作用，且效果好于阳性对照药物帕博西尼。