治疗Crohn病的整联蛋白β7拮抗剂和方法

本申请为2016年2月25日提交的，发明名称为“治疗Crohn病的整联蛋白β7拮抗剂和方法”的PCT申请PCT/US2016/019468的分案申请，所述PCT申请进入中国国家阶段的日期为2017年8月25日，申请号为201680012164.3。

相关申请的交叉引用

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序列表

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发明领域

提供治疗胃肠道炎性疾病如炎性肠病(包括Crohn病)的方法。还提供施用和给予整联蛋白β7拮抗剂如抗整联蛋白β7抗体的方法。此外，提供施用和给予这类整联蛋白β7拮抗剂以引起Crohn病缓解或引起并维持其缓解的方法。

背景技术

炎性肠病(IBD)是胃肠(GI)道慢性炎性自身免疫病症，其临床上表现为溃疡性结肠炎(UC)或Crohn病(CD)。CD是可能影响整个胃肠道的任何部分的慢性透壁性炎性疾病，并且UC是结肠的粘膜炎症。两种病状临床上均以频繁肠运动、营养不良和脱水为特征，同时破坏日常生活活动。IBD的病因学复杂，并且发病机制的许多方面仍不清楚。

CD是IBD的慢性、复发形式，其可以影响胃肠道的任何部分，40％-50％病例侵袭小肠。CD以散布在健康肠部分的零散、透壁性炎症、溃疡和肉芽肿损害(跳跃性病变)为特征。本疾病为渐进性；不受控的炎症形成狭窄或穿透并发症如狭窄前扩张、阻塞(狭窄)和腹内或肛周瘘及脓肿(穿透)。临床体征和症状包括慢性腹泻、腹痛、恶病质、腹部肿块或触痛以及明显的瘘征。病程可变；患者可以体验到重度的初始潮红，随后数种症状接下来绵延数10年(43％)或症状为慢性和持续性(19％)或复发-缓解(32％)(Baumgart DC等人,Lancet380:1590-605,2012)。

欧洲、亚洲和中东和北美洲报告的CD年度发病率分别是12.7、5.0和20.2/100,000人年(Molodecky NA等人,Gastroenterology 142:46-54,2012)。据报道北美洲的当前流行率是319/100,000人(Id.)。CD中的疾病相关死亡率占这个群体中大约30％的死亡例，因病程中早期出现的临床和/或手术并发症或稍后出现的肠癌所致。CD的全球发病率预计继续大幅度增长，在发育最重要和最富生产力的阶段影响个体，给患者、医疗系统和社会带来长期费用(Duricova D.等人,Inflamm Bowel Dis16:347-53,2010)。

迄今，不存在CD的治愈措施。因此，CD的当前治疗目标是引起并维持症状改善、引起粘膜愈合、避免手术和改善生活质量(Lichtenstein GR等人,Am J Gastroenterol 104:465-83,2009；Van Assche G等人,J Crohns Colitis.4:63-101,2010)。

全身性皮质类固醇(CS)已经成为引起缓解的主流治疗并且在大约80％患者中有效(Summers RW等人,Gastroenterology 77:847-69,1979；Malchow H等人,Gastroenterology 86:249-66,1984)。但是，作为维持疗法，它们不太有效，仅28％的患者在1年治疗后实现延长的反应并且32％患者变得依赖皮质类甾醇(Faubion WA等人,Gastroenterology 121:255-60,2001；Peyrin-Biroulet L等人,Am J Gastroenterol105:289–97,2010)。即便患者的症状改善，但预计不足30％者实现类固醇治疗时内窥镜下改善(Modigliani R等人,Gastroenterology 98:811-8,1990)。类固醇的不良作用经充分记录并且50％患者将因此而停止其治疗；长期安全性结果包括骨质疏松症、白内障和糖尿病。

一般施用免疫抑制剂(IS)(例如，硫唑嘌呤[AZA]、6-巯基嘌呤[6-MP]或甲氨蝶呤[MTX])，旨在不耐受或抵抗类固醇的患者中引起缓解及旨在实现静息性CD的患者中维持缓解。伴随或不伴随类固醇衔接的情况下给予免疫抑制剂，这取决于2-4月IS功效初起期间患者的症状。在患有回肠或升结肠疾病的患者中，布地奈德呈现为毒性较少、更可耐受的衔接物，原因在于其因首过代谢迅速而全身性生物利用度低。过去20年已经倡导较早启用IS以改变炎性疾病过程。但是，在这段时间期间尚未观察到肠道切除术和并发症的比率下降(Cosnes J等人,Gut 54:237-41,2005)。这可能反映这种自上而下治疗因顾虑伴随AZA和6-MP的全身性毒性(包括白细胞减少症、血小板减少症和淋巴瘤风险升高)(Prefontaine E等人,Cochrane Database Syst Rev(4):CD000545,2009)和伴随MTX的肝毒性和落发(Hausmann J等人,Inflamm Bowel Dis 16:1195-202,2010)而采用不佳。

开发针对肿瘤坏死因子(TNF)-α的单克隆抗体(mAb)提供了额外的治疗选项。尽管抗TNF在明显比例的患者中有效，但效力为次优；4周诱导治疗后的缓解率低于35％并且在响应于诱导治疗的患者当中，在20-30周维持状态下评估时，低于50％的患者实现缓解(Peyrin-Biroulet L等人,Aliment Pharmacol Ther 33:870-9,2011)。另外，4周诱导治疗后评估时，30％的患者据报道为抗TNF治疗的原发性非反应者(Targan SR等人,N Engl JMed 337:1029-35,1997；Sandborn WJ等人,Ann Intern Med 2007:19；146:829-38Epub2007Apr 30)，可能原因在于并非TNF-α驱动并且本身可能从机制不同的药物类别中获益的基础性病理生物学。据估计30％-40％的患者将为继发性非反应者(即，最初有反应，但是在首年治疗中丧失反应或变得不耐受)(Colombel JF等人Gastroenterology 132:52-65,2007)。继发性无反应已经归因于形成导致血清药物水平低的中和抗体、归因于药物清除加速或可能从采用不同药理学靶的疗法中获益的生物学逃逸机制。抗TNF还与显著的副作用(包括严重感染、机会性感染、狼疮样反应，和淋巴瘤风险升高)相关(Siegal CA等人,Therap Adv Gastroenterol 2:245–51,2009)。耐受性顾虑包括输注反应(在9％-17％经英夫单抗(infliximab)治疗的患者中出现，参见de Vries HS等人,Br J Clin Pharmacol71:7-19,2011)和注射部位反应(在10％接受阿达木单抗(adalimumab)的患者中出现，参见van der Heijde D等人,Arthritis Rheum.54:2136-46,2006)。总体上，认为这个药物类别的益处相对于风险可接受，但是持续需要益处-风险特征更好的减弱炎症及临床后遗症并改善CD患者长期预后的治疗。

整联蛋白是在多个细胞过程(包括白细胞黏附、信号传导、增殖和迁移)中及基因调节中发挥作用的α/β异二聚体细胞表面糖蛋白受体(Hynes,R.O.,Cell,1992,69:11-25；和Hemler,M.E.,Annu.Rev.Immunol.,1990,8:365-368)。它们由二个异二聚体非共价相互作用的α跨膜亚基和β跨膜亚基组成，所述跨膜亚基与内皮、上皮上的不同细胞黏附分子(CAM)和胞外基质蛋白特异性结合。以这种方式，整联蛋白可以作为组织特异性细胞黏附受体发挥作用，协助白细胞以受高度调节的方式从血液召集入附近的全部组织部位，在白细胞归巢至正常组织及炎症部位中发挥作用(von Andrian等人,N Engl J Med 343:1020–34(2000))。在免疫系统中，整联蛋白在炎症过程期间涉及白细胞运输、黏附和浸润(Nakajima,H.等人,J.Exp.Med.,1994,179:1145-1154)。整联蛋白的差异性表达调节细胞的黏附特性并且不同的整联蛋白涉及不同的炎症反应。(Butcher,E.C.等人,Science,1996,272:60-66)。含有β7的整联蛋白(即，α4β7和αEβ7)主要在单核细胞、淋巴细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞和巨噬细胞上表达，但在中性粒细胞上不表达(Elices,M.J.等人,Cell,1990,60:577-584)。

抗整联蛋白是经批准用于治疗CD的另一类生物产品。那他珠单抗是在美国获准仅用于治疗中度至重度活动性CD的抗整联蛋白抗体。阻断α4β1和α4β7的那他珠单抗的用途受限，这归因于以下顾虑：抑制α4β1/VCAM-1结合作用升高进行性多灶性白质脑病(PML)(罕见但严重的CNS感染)的风险。维多珠单抗(Vedolizumab)是最新批准用于CD的消化道选择性抗整联蛋白抗体，但它仅靶向α4β7整联蛋白受体，抑制T-淋巴细胞与黏附分子MAdCAM-1结合并且作为静脉(IV)输液施用。在维多珠单抗关键试验中，31％采用6周诱导治疗的患者具有临床反应，其定义为Crohn病活动指数[CDAI]评分距基线下降≥100分；与22％给予安慰剂的患者相比，多达39％采用46周维持治疗的维多珠单抗反应者实现缓解(定义为CDAI评分≤150)(Sandborn WJ等人,N Engl J Med 369(8):711-721,2013；Sandborn WJ等人,Aliment Pharmacol Ther 37:204-13,2013)。尽管维多珠单抗显示出作为新CD疗法的前景，但仍需要具有消化道选择性并实现更好反应率和缓解率的更便利疗法。

α4β7整联蛋白(维多珠单抗的靶)是在细胞迁移至肠粘膜和相关淋巴组织(如小肠中的派伊尔氏淋巴结、大肠中的淋巴样滤泡和肠系膜淋巴结)中重要的白细胞归巢受体。在消化道中，白细胞翻滚并牢固黏附于粘膜内皮由来自趋化因子的信号引发并经粘膜地址素细胞黏附分子(MAdCAM)-1-相关的唾液酰Lewis X介导。趋化因子信号传导过程诱导α4β7整联蛋白发生从MAdCAM-1低结合亲和力至高结合亲和力的变化。白细胞随后停住并且开启穿过血管内皮外溢至下方组织的过程。认为这种外溢过程在正常免疫细胞再循环状态下和炎性病状中均出现(von Andrian等人,上文)。浸润物中α4β7

仅在T淋巴细胞上表达并与粘膜组织结合的另一个β7整联蛋白家族成员是αEβ7整联蛋白，另称作CD103。αEβ7整联蛋白选择性地结合于上皮细胞上的E-钙黏着蛋白并且，已经提出其在T细胞停留于上皮内淋巴细胞区室的粘膜组织中发挥作用(Cepek等人,JImmunol 150:3459-70(1993)；Karecla等人,Eur J Immunol 25:852–6(1995))。已经报道粘膜固有层中的αEβ7

先前已经描述了靶向β7整联蛋白亚基的人源化单克隆抗体。参见，例如，国际专利公开号WO2006/026759。这样的一种抗体etrolizumab(rhuMAbβ7)衍生自大鼠抗小鼠/人单克隆抗体FIB504(Andrew DP等人,J Immunol 153:3847-61,1994)。将它工程化以包含人IgG1重链构架和κ1轻链构架。国际专利公开号WO2006/026759。

Etrolizumab(一种皮下施用的mAb)是一种新的抗整联蛋白抗体，不同于维多珠单抗，其分别靶向调节运输和T细胞亚群在肠粘膜中停留的α4β7和αEβ7受体。因此在无泛化免疫抑制的情况下，etrolizumab借助双重作用机制(MOA)在CD中提供潜在的加合治疗作用。Etrolizumab以高亲和力与α4β7(Holzmann B等人,Cell 56:37-46,1989；Hu M等人,ProcNatl Acad Sci USA 89:8254-8,1992)和αEβ7(Cepek KL等人,J Immunol 150:3459-70,1993)结合。通过这种机制，它阻断白细胞亚群在肠粘膜中归巢和停留，这分别借助与细胞黏附分子(MAdCAM-1)和E-钙黏着蛋白结合而发生。从而，它代表一种新的消化道粘膜-选择性抗运输药物，所述抗运输药物的选择性可以通过将靶标运输偏好向消化道而非其他器官和组织，消除泛化的免疫抑制。来自持续时间长达6个月的多项非临床总体毒性研究中的数据显示，etrolizumab在任何器官系统中没有不良作用。参见，例如，Stefanich等人,British Journal of Pharmacology 162:1855–1870,2011；国际专利公开号WO 2009/140684。

值得注意的是，不同于那他珠单抗，etrolizumab与α4β1不结合或不抑制α4β1和VCAM-1相互作用及淋巴细胞分布和归巢至CNS和外周淋巴组织。从而，预计etrolizumab不升高进行性多灶性白质脑病(PML)风险。已经在成人I期和II期研究中完成etrolizumab安全性评估，其中中度至重度活动性UC患者接受单剂或多剂IV或皮下(SC)etrolizumab。总计158名患者已经暴露于etrolizumab，没有明显的不良安全性信号(包括严重或机会性感染率增加的任何证据)与etrolizumab治疗相关。确认etrolizumab的临床经验有限，然而在etrolizumab治疗的患者中尚未报道PML事件。

迄今，Crohn病临床试验中的主要结局指标是Crohn病活动指数(CDAI)，其已经充当批准多种药物治疗(例如包括维多珠单抗和那他珠单抗)的基础。通过回归对代表患者报告结果(PRO)(即腹痛、令患者从睡眠苏醒的疼痛、食欲)、身体体征(即，每日平均体温、腹部肿块)、药物使用(即，用于腹泻的洛哌丁胺或阿片剂)和实验室检验(即血细胞比容)的十八个潜在项目的疾病活动度临床总体评估，编制CDAI。反向逐步回归分析确定了八个独立预测指标，这些指标是液状粪或软粪便次数、腹痛严重程度、总体幸福感、肠外症状出现、止泻药需求、存在腹部肿块，血细胞比容和体重。最终评分是这八项的复合，使用回归系数和标准化予以校正，以建立总体CDAI评分，范围从0至600，较高评分表示更大的疾病活动度。广泛使用的基准是：CDAI<150定义为临床缓解，将150至219定义为轻度活动性疾病，220至450定义为适度活动性疾病，并且450以上定义为极重度疾病(Best WR等人,Gastroenterology77:843-6,1979)。维多珠单抗和那他珠单抗已经基于展示的临床缓解即CDAI≤150得到批准。

尽管CDAI已经在用超过40年，并且已经充当药物批准的基础，但作为临床试验结局指标，它具有几个局限。例如，大部分总评分来自患者日记卡项(疼痛、液状排便次数和总体幸福感)，这些项定义模糊并且不是标准化术语(Sandler等人,J.Clin.Epidemiol 41:451-8,1988；Thia等人,Inflamm Bowel Dis 17:105-11,2011)。此外，疼痛的测量基于四分量表(four-point scale)，而不是更新的七分量表(seven-point scale)。剩余5个指标项对鉴定功效信号的贡献非常小并且可能是测量噪声源。另外，已经出现如下方面的顾虑：CDAI标准效度低劣、据报道在炎症的CDAI指标和内窥镜下指标之间缺少相关性(这可能使得CDAI作为活动性CD和肠激惹综合征的不良判别物)和安慰剂报告率高(Korzenik等人,NEngl J Med.352:2193-201,2005；Sandborn WJ,等人,N Engl J Med 353:1912-25,2005；Sandborn WJ,等人,Ann Intern 19；146:829-38,2007,Epub 2007Apr 30；Kim等人,Gastroenterology 146:(5 supplement 1)S-368,2014)。

因此，通常认为需要额外或备选的CD症状指标，如新的PRO工具或导出新PRO的CDAI改编。PRO2和PRO3工具是这类CDAI改编并且最近已经在Khanna等人,AlimentPharmacol.Ther.41:77-86,2015中描述。PRO2评价了溏便/液状粪频率和腹痛(上文)。这些项因此从CDAI导出和加权并且连同总体幸福感一并是CDAI日记卡项，所述日记卡项最有助于依据CDAI测量的观测的临床获益(Sandler等人,J.Clin.Epidemiol 41:451-8,1988；Thia等人,Inflamm Bowel Dis 17:105-11,2011；Kim等人,Gastroenterology 146:(5supplement 1)S-368,2014)。≤11的缓解评分是7天时间中平均排便频率评分和疼痛评分的CDAI加权总和，该总和在II期临床研究的优特克单抗诱导治疗中度至重度CD的回顾性数据分析中产生最佳灵敏度和特异性供确定CDAI缓解(评分＜150)(Gasink C等人,[摘要]ACG Annual Meeting 2014)。显示在依据CDAI测量的活动性CD中作为MTX治疗回顾性数据分析的连续结局指标使用时，PRO2灵敏和有反应性(Khanna R等人,Inflamm Bowel Dis20:1850-61,2014)。

评估Crohn病范围和严重程度的额外手段是内窥镜检查。已经在众多研究中描述了Crohn病常见的内窥镜下损害并且例如包括口疮样溃疡、“穿孔性”溃疡、鹅卵石样征和狭窄。这类损害的内窥镜评价结果用来开发首个验证的内窥镜评分，Crohn病内窥镜严重程度指数(CDEIS)(Mary等人,Gut 39:983-9,1989)。最近，因为CDEIS对于例行使用而言费时、复杂并且不切实际，所以开发并验证了Crohn病简化内窥镜活动度评分(SES-CD)(Daperno等人,Gastrointest.Endosc.60(4):505-12,2004)。SES-CD由五个回结肠肠段中所评定的四个内窥镜下变量(溃疡大小、溃疡覆盖表面的比例、具有任何其他损害(例如，炎症)的表面的比例和存在狭窄[狭窄])组成，从0至3评定每种变量或评估结果。

尽管CD中疾病范围和严重程度的新PRO指标和新内窥镜检查指标的开发和验证取得这些最新进展，迄今尚无公开的前瞻性临床研究可用于确定如何在III期临床研究(即关键或注册研究)的设计和实施中前瞻性利用这类新指标，旨在评价治疗性候选物的特定给药方案的功效。因此存在改善这些指标的使用以确定多类治疗性候选物(包括抗整联蛋白)的最佳疗效终点的需要。就确定(例如，抗整联蛋白抗体(包括抗整联蛋白β7抗体))的将符合优化疗效终点的特定给药方案而言，也需要这类改善。

本文所述的本发明符合上述某些需求并提供其他益处。

本文中提到的全部参考文献，包括专利申请和出版物，通过引用的方式完整并入本文用于任何目的。

概述

本发明的方法至少部分地基于以下发现：可以根据某些给药方案皮下施用治疗有效量的整联蛋白β7拮抗剂，如抗β7抗体，本文也称作抗整联蛋白β7抗体，包括etrolizumab(rhuMAbβ7)，所述给药方案展示如通过测量如本文所述的某些功效结局指标所确定的功效。

因此，在一个方面，提供了治疗哺乳动物受试者中Crohn病(CD)的方法，所述方法包括向受试者施用治疗有效量的整联蛋白β7拮抗剂。在某些实施方案中，哺乳动物受试者是患者。在某些实施方案中，患者是人。在某些实施方案中，皮下施用整联蛋白β7拮抗剂。在某些实施方案中，整联蛋白β7拮抗剂是抗整联蛋白β7亚基单克隆抗体，也称作抗β7抗体。在某些这类实施例中，抗β7抗体选自嵌合抗体、人抗体和人源化抗体。在某些实施方案中，抗β7抗体是抗体片段。在某些实施方案中，抗β7抗体包含六个高变区(HVR)，其中：

(i)HVR-L1包含氨基酸序列A1-A11，其中A1-A11是RASESVDTYLH(SEQ ID NO：1)；RASESVDSLLH(SEQ ID NO：7)，RASESVDTLLH(SEQ ID NO：8)或RASESVDDLLH(SEQ ID NO：9)或SEQ ID NO：1、7、8或9的变体(SEQ ID NO：26)，其中氨基酸A2选自A、G、S、T和V，和/或氨基酸A3选自S、G、I、K、N、P、Q、R和T，和/或A4选自E、V、Q、A、D、G、H、I、K、L、N和R，和/或氨基酸A5选自S、Y、A、D、G、H、I、K、N、P、R、T和V，和/或氨基酸A6选自V、R、I、A、G、K、L、M和Q，和/或氨基酸A7选自D、V、S、A、E、G、H、I、K、L、N、P、S和T，和/或氨基酸A8选自D、G、N、E、T、P和S，和/或氨基酸A9选自L、Y、I和M，和/或氨基酸A10选自L、A、I、M和V，和/或氨基酸A11选自H、Y、F和S；

(ii)HVR-L2包含氨基酸序列B1-B8，其中B1-B8是KYASQSIS(SEQ ID NO：2)，RYASQSIS(SEQ ID NO：20)或X

(iii)HVR-L3包含氨基酸序列C1-C9，其中C1-C9是QQGNSLPNT(SEQ ID NO：3)或SEQID NO：3的变体(SEQ ID NO：28)，其中氨基酸C8选自N、V、W、Y、R、S、T、A、F、H、I、L和M；

(iv)HVR-H1包含氨基酸序列D1-D10，其中D1-D10是GFFITNNYWG(SEQ ID NO：4)；

(v)HVR-H2包含氨基酸序列E1-E17，其中E1-E17是GYISYSGSTSYNPSLKS(SEQ IDNO：5)，或SEQ ID NO：5的变体(SEQ ID NO：29)，其中氨基酸E2选自Y、F、V和D，和/或氨基酸E6选自S和G，和/或氨基酸E10选自S和Y，和/或氨基酸E12选自N、T、A和D，和/或氨基酸13选自P、H、D和A，和/或氨基酸E15选自L和V，和/或氨基酸E17选自S和G；并且

(vi)HVR-H3包含氨基酸序列F2-F11，其中F2-F11是MTGSSGYFDF(SEQ ID NO：6)或RTGSSGYFDF(SEQ ID NO：19)；或包含氨基酸序列F1-F11，其中F1-F11是AMTGSSGYFDF(SEQID NO：16)、ARTGSSGYFDF(SEQ ID NO：17)、或AQTGSSGYFDF(SEQ ID NO：18)或SEQ ID NO：6、16、17、18或19的变体(SEQ ID NO：30)，其中氨基酸F2是R、M、A、E、G、Q、S和/或氨基酸F11选自F和Y。

在某些实施方案中，抗β7抗体包含三个重链高变区序列(HVR-H1-H3)和三个轻链高变区序列(HVR-L1-L3)，其中：

(i)HVR-L1包含SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8或SEQ ID NO：9；

(ii)HVR-L2包含SEQ ID NO：2；

(iii)HVR-L3包含SEQ ID NO：3；

(iv)HVR-H1包含SEQ ID NO：4；

(v)HVR-H2包含SEQ ID NO：5；并且

(vi)HVR-H3包含SEQ ID NO：6或SEQ ID NO：16或SEQ ID NO：17或SEQ ID NO：19。在某些实施方案中，抗β7抗体包含了包含SEQ ID NO：31的氨基酸序列的可变轻链和包含SEQ ID NO：32的氨基酸序列的可变重链。

在某些实施方案中，抗β7抗体是etrolizumab，也称作rhuMAbβ7。

在另一个方面，提供在Crohn病患者中引起缓解的方法。在某些实施方案中，该方法包括向患者皮下施用治疗有效量的整联蛋白β7拮抗剂，其中治疗有效量在施用首剂后14周引起缓解。在一些实施方案中，整联蛋白β7拮抗剂是抗整联蛋白β7单克隆抗体。在一些实施方案中，抗整联蛋白β7抗体选自嵌合抗体、人抗体和人源化抗体。在一些实施方案中，抗整联蛋白β7抗体是抗体片段。在某些实施方案中，抗β7抗体包含六个高变区(HVR)，其中：

(i)HVR-L1包含氨基酸序列A1-A11，其中A1-A11是RASESVDTYLH(SEQ ID NO：1)；RASESVDSLLH(SEQ ID NO：7)，RASESVDTLLH(SEQ ID NO：8)或RASESVDDLLH(SEQ ID NO：9)或SEQ ID NO：1、7、8或9的变体(SEQ ID NO：26)，其中氨基酸A2选自A、G、S、T和V，和/或氨基酸A3选自S、G、I、K、N、P、Q、R和T，和/或A4选自E、V、Q、A、D、G、H、I、K、L、N和R，和/或氨基酸A5选自S、Y、A、D、G、H、I、K、N、P、R、T和V，和/或氨基酸A6选自V、R、I、A、G、K、L、M和Q，和/或氨基酸A7选自D、V、S、A、E、G、H、I、K、L、N、P、S和T，和/或氨基酸A8选自D、G、N、E、T、P和S，和/或氨基酸A9选自L、Y、I和M，和/或氨基酸A10选自L、A、I、M和V，和/或氨基酸A11选自H、Y、F和S；

(ii)HVR-L2包含氨基酸序列B1-B8，其中B1-B8是KYASQSIS(SEQ ID NO：2)、RYASQSIS(SEQ ID NO：20)或X

(iii)HVR-L3包含氨基酸序列C1-C9，其中C1-C9是QQGNSLPNT(SEQ ID NO：3)或SEQID NO：3的变体(SEQ ID NO：28)，其中氨基酸C8选自N、V、W、Y、R、S、T、A、F、H、I、L和M；

(iv)HVR-H1包含氨基酸序列D1-D10，其中D1-D10是GFFITNNYWG(SEQ ID NO：4)；

(v)HVR-H2包含氨基酸序列E1-E17，其中E1-E17是GYISYSGSTSYNPSLKS(SEQ IDNO：5)，或SEQ ID NO：5的变体(SEQ ID NO：29)，其中氨基酸E2选自Y、F、V和D，和/或氨基酸E6选自S和G，和/或氨基酸E10选自S和Y，和/或氨基酸E12选自N、T、A和D，和/或氨基酸13选自P、H、D和A，和/或氨基酸E15选自L和V，和/或氨基酸E17选自S和G；并且

(vi)HVR-H3包含氨基酸序列F2-F11，其中F2-F11是MTGSSGYFDF(SEQ ID NO：6)或RTGSSGYFDF(SEQ ID NO：19)；或包含氨基酸序列F1-F11，其中F1-F11是AMTGSSGYFDF(SEQID NO：16)，ARTGSSGYFDF(SEQ ID NO：17)，或AQTGSSGYFDF(SEQ ID NO：18)，或SEQ ID NO：6、16、17、18或19的变体(SEQ ID NO：30)，其中氨基酸F2是R、M、A、E、G、Q、S，和/或氨基酸F11选自F和Y。

在某些实施方案中，抗整联蛋白β7抗体包含三个重链高变区序列(HVR-H1-H3)和三个轻链高变区序列(HVR-L1-L3)，其中：

(i)HVR-L1包含SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8或SEQ ID NO：9；

(ii)HVR-L2包含SEQ ID NO：2；

(iii)HVR-L3包含SEQ ID NO：3；

(iv)HVR-H1包含SEQ ID NO：4；

(v)HVR-H2包含SEQ ID NO：5；并且

(vi)HVR-H3包含SEQ ID NO：6或SEQ ID NO：16或SEQ ID NO：17或SEQ ID NO:19。

在某些实施方案中，抗整联蛋白β7抗体包含了包含SEQ ID NO:31的氨基酸序列的可变轻链和包含SEQ ID NO:32的氨基酸序列的可变重链。在某些实施方案中，抗整联蛋白β7抗体是etrolizumab。

在又一个方面，在施用首剂整联蛋白β7拮抗剂之前，患者具有中度至重度活动性Crohn病。在一些实施方案中，确定患者在施用首剂之前七天中的任何时间具有大于或等于220并且小于或等于480的Crohn病活动指数(CDAI)评分。在一些实施方案中，确定患者在施用首剂之前七天中的任何时间具有大于或等于14的患者报告结果2(PRO2)评分。在一些实施方案中，确定患者具有活动性炎症，其中将活动性炎症确定为如通过回结肠镜检查所测定的Crohn病简化内窥镜指数(SES-CD)评分大于或等于7。在一些实施方案中，患者具有孤立的回肠炎或回盲肠切除术后并且确定患者具有活动性炎症，其中将活动性炎症确定为如通过回结肠镜检查所测定的Crohn病简化内窥镜指数(SES-CD)评分大于或等于4。在某些实施方案中，患者具有上文的CDAI评分和PRO2评分。在某些实施方案中，患者具有根据上文的CDAI评分、PRO2评分和SES-CD评分。

在又一个方面，患者对常规疗法的反应不充分、丧失反应或不耐受。在一些实施方案中，常规疗法选自免疫抑制剂疗法、皮质类固醇疗法和抗TNF疗法中一者或多者。在一些实施方案中，免疫抑制剂疗法选自6-巯基嘌呤、硫唑嘌呤和甲氨蝶呤。在一些实施方案中，皮质类固醇疗法选自泼尼松(或泼尼松等同物)和布地奈德。在一些实施方案中，抗TNF治疗选自英夫单抗、阿达木单抗和聚乙二醇培舍珠单抗。

在依旧又一个方面，抗整联蛋白β7抗体按近平剂量每4周105mg施用。在某些实施方案中，抗整联蛋白β7抗体按近平剂量每4周210mg施用。在一些实施方案中，将抗整联蛋白β7抗体作为首剂时210mg施用、首剂后两周210mg、首剂后四周210mg、首剂后八周210mg和首剂后12周210mg的近平剂量施用。在一些实施方案中，将抗整联蛋白β7抗体作为首剂时210mg施用、首剂后两周210mg、首剂后四周210mg、首剂后八周210mg和首剂后12周210mg的近平剂量施用。在一些实施方案中，通过Crohn病活动指数(CDAI)评分确定缓解，其中CDAI评分小于150。在一些实施方案中，治疗有效量在施用首剂后10周引起缓解。在一些实施方案中，通过患者报告结果2(PRO2)评分确定缓解，其中PRO2评分小于或等于11。在一些实施方案中，治疗有效量引起如通过Crohn病简化内窥镜指数(SES-CD)评分所确定的内窥镜下改善。在一些实施方案中，与基线时所确定的SES-CD评分相比，施用首剂后14周所确定的SES-CD评分在减少50％。在一些实施方案中，治疗有效量引起反应，其中将该反应确定为CDAI评分与基线时确定的CDAI评分相比减少至少70分。在一些实施方案中，将该反应确定为CDAI评分与基线时确定的CDAI评分相比减少至少100分。

在一个方面，提供在Crohn病患者中维持缓解的方法。在某些实施方案中，该方法包括向患者皮下施用治疗有效量的整联蛋白β7拮抗剂，其中治疗有效量在施用首剂后维持缓解至少52周、或至少66周，或至少70周或至少74周。在一些实施方案中，治疗有效量在施用首剂后维持缓解至少74周，患者在施用首剂后接受皮质类固醇疗法14周并且皮质类固醇疗法随时间推移减少，始于施用首剂后14周直至停用。在一些实施方案中，皮质类固醇疗法是小于或等于每日20mg泼尼松或泼尼松等同物，并且皮质类固醇疗法每周减少2.5mg泼尼松或泼尼松等同物直至停用。在一些实施方案中，皮质类固醇疗法每日小于或等于6mg口服布地奈德并且其中皮质类固醇疗法每2周减少3mg口服布地奈德直至停用。在某些实施方案中，治疗有效量维持长期缓解，其中长期缓解依据CDAI评分在六个或更多个时间点的每个时间点处小于150确定，所述时间点选自施用首剂后24周、施用首剂后28周、施用首剂后32周、施用首剂后44周、施用首剂后56周、施用首剂后66周、施用首剂后70周和施用首剂后74周。在某些实施方案中，整联蛋白β7拮抗剂是抗整联蛋白β7单克隆抗体。在一些实施方案中，抗整联蛋白β7抗体选自嵌合抗体、人抗体和人源化抗体。在一些实施方案中，抗整联蛋白β7抗体是抗体片段。在一些实施方案中，抗β7抗体包含六个高变区(HVR)，其中：

(i)HVR-L1包含氨基酸序列A1-A11，其中A1-A11是RASESVDTYLH(SEQ ID NO：1)；RASESVDSLLH(SEQ ID NO：7)，RASESVDTLLH(SEQ ID NO：8)或RASESVDDLLH(SEQ ID NO：9)或SEQ ID NO：1、7、8或9的变体(SEQ ID NO：26)，其中氨基酸A2选自A、G、S、T和V，和/或氨基酸A3选自S、G、I、K、N、P、Q、R和T，和/或A4选自E、V、Q、A、D、G、H、I、K、L、N和R，和/或氨基酸A5选自S、Y、A、D、G、H、I、K、N、P、R、T和V，和/或氨基酸A6选自V、R、I、A、G、K、L、M和Q，和/或氨基酸A7选自D、V、S、A、E、G、H、I、K、L、N、P、S和T，和/或氨基酸A8选自D、G、N、E、T、P和S，和/或氨基酸A9选自L、Y、I和M，和/或氨基酸A10选自L、A、I、M和V，和/或氨基酸A11选自H、Y、F和S；

(ii)HVR-L2包含氨基酸序列B1-B8，其中B1-B8是KYASQSIS(SEQ ID NO：2)、RYASQSIS(SEQ ID NO：20)或X

(iii)HVR-L3包含氨基酸序列C1-C9，其中C1-C9是QQGNSLPNT(SEQ ID NO：3)或SEQID NO：3的变体(SEQ ID NO：28)，其中氨基酸C8选自N、V、W、Y、R、S、T、A、F、H、I、L和M；

(iv)HVR-H1包含氨基酸序列D1-D10，其中D1-D10是GFFITNNYWG(SEQ ID NO：4)；

(v)HVR-H2包含氨基酸序列E1-E17，其中E1-E17是GYISYSGSTSYNPSLKS(SEQ IDNO：5)，或SEQ ID NO：5的变体(SEQ ID NO:29)，其中氨基酸E2选自Y、F、V和D，和/或氨基酸E6选自S和G，和/或氨基酸E10选自S和Y，和/或氨基酸E12选自N、T、A和D，和/或氨基酸13选自P、H、D和A，和/或氨基酸E15选自L和V，和/或氨基酸E17选自S和G；并且

(vi)HVR-H3包含氨基酸序列F2-F11，其中F2-F11是MTGSSGYFDF(SEQ ID NO:6)或RTGSSGYFDF(SEQ ID NO:19)；或包含氨基酸序列F1-F11，其中F1-F11是AMTGSSGYFDF(SEQID NO:16)，ARTGSSGYFDF(SEQ ID NO:17)，或AQTGSSGYFDF(SEQ ID NO:18)，或SEQ ID NO:6、16、17、18或19的变体(SEQ ID NO:30)，其中氨基酸F2是R、M、A、E、G、Q、S，和/或氨基酸F11选自F和Y。在一些实施方案中，抗整联蛋白β7抗体包含三个重链高变区序列(HVR-H1-H3)和三个轻链高变区序列(HVR-L1-L3)，其中：

(i)HVR-L1包含SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:9；

(ii)HVR-L2包含SEQ ID NO:2；

(iii)HVR-L3包含SEQ ID NO:3；

(iv)HVR-H1包含SEQ ID NO:4；

(v)HVR-H2包含SEQ ID NO:5；并且

(vi)HVR-H3包含SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:16或SEQ ID NO:17或SEQ ID NO:19。在一些实施方案中，抗整联蛋白β7抗体包含了包含SEQ ID NO:31的氨基酸序列的可变轻链和包含SEQ ID NO:32的氨基酸序列的可变重链。在一些实施方案中，抗整联蛋白β7抗体是etrolizumab。

在前述段落的方法的另一个方面，在施用首剂整联蛋白β7拮抗剂之前，患者具有轻度至中度活动性Crohn病。在一些实施方案中，确定患者在施用首剂之前七天中的任何时间具有大于或等于220并且小于或等于480的CDAI评分。在一些实施方案中，确定患者在施用首剂之前七天中的任何时间具有大于或等于14的PRO2评分。在一些实施方案中，确定患者具有活动性炎症，其中将活动性炎症确定为如通过回结肠镜检查所测定的SES-CD评分大于或等于7。在一些实施方案中，患者具有孤立的回肠炎或回盲肠切除术后并且确定患者具有活动性炎症，其中将活动性炎症确定为如通过回结肠镜检查所测定的Crohn病简化内窥镜指数(SES-CD)评分大于或等于4。在某些实施方案中，患者具有上文的CDAI评分和PRO2评分。在某些实施方案中，患者具有根据上文的CDAI评分、PRO2评分和SES-CD评分。

在前述段落的方法的又一个方面，患者对常规疗法的反应不充分、丧失反应或不耐受。在一些实施方案中，常规疗法选自免疫抑制剂疗法、皮质类固醇疗法和抗TNF疗法中一者或多者。在一些实施方案中，免疫抑制剂疗法选自6-巯基嘌呤、硫唑嘌呤和甲氨蝶呤。在一些实施方案中，皮质类固醇疗法选自泼尼松、泼尼松等同物和布地奈德。在一些实施方案中，抗TNF治疗选自英夫单抗、阿达木单抗和聚乙二醇培舍珠单抗。

在维持缓解的仍又一个方面，抗整联蛋白β7抗体按近平剂量每4周105mg施用。在一些实施方案中，抗整联蛋白β7抗体按近平剂量每4周210mg施用。在一些实施方案中，将抗整联蛋白β7抗体作为首剂时210mg施用、首剂后2周210mg、首剂后四周210mg、首剂后八周210mg、首剂后12周210mg和此后每4周105mg的近平剂量施用。在一些实施方案中，通过Crohn病活动指数(CDAI)评分确定缓解，其中CDAI评分小于150。在一些实施方案中，患者未给予皮质类固醇至少52周。在一些实施方案中，通过患者报告结果2(PRO2)评分确定缓解，其中PRO2评分小于或等于11。在一些实施方案中，治疗有效量引起如通过Crohn病简化内窥镜指数(SES-CD)评分所确定的内窥镜下改善。在一些实施方案中，与基线时所确定的SES-CD评分相比，施用首剂后66周所确定的SES-CD评分减少50％。在一些实施方案中，施用首剂后66周的内窥镜下改善是粘膜炎症消散，其中粘膜炎症消散是SES-CD评分经测定为零。在一些实施方案中，治疗有效量在施用首剂后14周引起反应，其中将该反应确定为CDAI评分与基线时确定的CDAI评分相比减少至少70分。在一些实施方案中，治疗有效量在施用首剂后66周引起反应，其中将该反应确定为CDAI评分与基线时确定的CDAI评分相比减少至少100分。

在以上任一个实施方案的仍又一个方面，使用预充式注射器或预充式注射器和自动注射器组合，施用整联蛋白β7拮抗剂。

附图简述

图1A和图1B显示以下共有序列和抗β7亚基抗体序列的可变轻链序列和可变重链序列的比对结果：轻链人亚组κI共有序列(图1A，SEQ ID NO:12)、重链人亚组III共有序列(图1B，SEQ ID NO:13)、大鼠抗小鼠β7抗体(Fib504)可变轻链(图1A，SEQ ID NO:10)、大鼠抗小鼠β7抗体(Fib504)可变重链(图1B，SEQ ID NO:11)，和人源化抗体变体的可变轻链序列和可变重链序列的比对结果：人源化hu504K移植可变轻链(图1A，SEQ ID NO:14)、人源化hu504K移植可变重链(图1B，SEQ ID NO:15)、变体hu504-5、hu504-16和hu504-32(图1A中指示来自人源化hu504K移植的氨基酸变异)(轻链)(按出现顺序分别是SEQ ID NO:22-24，)和图1B(重链)变体hu504-5、hu504-16和hu504-32(SEQ ID NO:25)。

图2A显示etrolizumab的可变轻链区域(SEQ ID NO:31)并且图2B显示其可变重链区域(SEQ ID NO:32)。

图3显示如实施例1中所述的III期临床研究的诱导期的研究方案。抗TNF＝抗肿瘤坏死因子；CD＝Crohn病；ETRO＝etrolizumab；IS＝免疫抑制剂；SC＝皮下；Wk＝周。

图4显示如实施例1中所述的III期临床研究的维持期的研究方案。CS＝皮质类固醇类；ETRO＝etrolizumab；OLE＝标签公开延展期；PBO＝安慰剂；q4w＝每4周；Re-Rx＝再随机分配。

图5显示如实施例1中所述的医学辅助措施，称作布里斯托大便分类法。

发明详述

除非另外定义，否则本文中所用的技术与科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解相同的含义。Singleton等人,Dictionary of Microbiology andMolecular Biology第2版,J.Wiley&Sons(New York,N.Y.1994)和March,AdvancedOrganic Chemistry Reactions，Mechanisms and Structure，第4版,John Wiley&Sons(New York,N.Y.1992)为本领域技术人员提供了本申请中所用多个术语的一般指南。

定义

出于解释本说明书的目的，以下定义将适用，并且在适宜的任何时候，以单数使用的术语还将包括复数形式并且反之亦然。在下文所述的任何定义与通过引用方式并入本文的任何文献矛盾的情况下，下文所述的定义应当为主。

除非上下文另外清楚地说明，否则如本说明书及所附权利要求书中所用，单数形式“一个(a)”、“一种(an)”和“该(the)”包括复数指称。因此，例如，对“一种蛋白质”的指称包括多种蛋白质；对“一个细胞”的指称包括包括细胞的混合物等。

本说明书和所附权利要求书中所提供的范围包括两个终点和这些终点之间的全部点。因此，例如，2.0至3.0的范围包括2.0、3.0和2.0和3.0之间的全部点。

“治疗”、“治疗着”及语法变型指意图改变正在治疗的个体或细胞的天然过程的临床介入，并且可以为了预防或在临床病理学过程期间实施。想要的治疗效果包括防止疾病出现或复发、减轻症状、减小疾病的任何直接或间接病理学后果、降低病情进展速率、减轻或缓和疾病状态，以及缓解或预后改善。

“治疗方案”指剂量、施用频率或治疗持续时间的组合，同时添加或不添加第二药物。

“有效治疗方案”指将向接受治疗的患者提供有益反应的治疗方案。

“调整治疗”指改变治疗方案，包括改变剂量、施用频率或治疗持续时间和/或添加第二药物。

可以使用显示患者获益的任何终点评估“患者应答”或“患者反应性”，所述终点包括而不限于(1)一定程度地抑制病情进展，包括减慢和完全制止；(2)减少疾病发作和/或症状的次数；(3)减少损害尺度；(4)抑制(即，减少、减慢或完全制止)疾病细胞浸润入相邻外周器官和/或组织；(5)抑制(即减少、减慢或完全制止)疾病扩散；(6)减少自身免疫反应，这可以、但不必然导致疾病损害的消退或消除；(7)一定程度地减轻一种或多种与疾病相关的症状；(8)治疗后无疾病表现的时长增加；和/或(9)治疗后给定时间点的死亡率降低。术语“反应性”指可度量反应，包括完全反应(CR)和部分反应(PR)。

如本文所用，“完全反应”或“CR”意指全部炎症体征消失或响应于治疗而缓解。这不必然地意指疾病已经治愈。

“部分反应”或“PR”指炎症严重程度响应于治疗而减少至少50％。

患者对整联蛋白β7拮抗剂治疗的“有益反应”和相似措辞指向患者赋予的来自拮抗剂(如抗β7整联蛋白抗体)治疗或因其所致的临床或治疗益处，所述患者面临胃肠道炎性疾病的风险或患有这种疾病。这类益处包括来自拮抗剂治疗或因其所致的患者的细胞反应或生物学反应、完全反应、部分反应、病情稳定(无进展或复发)或具有较后复发的反应。

当治疗期间患者的反应性不随时间下降时，“患者维持治疗反应性”。

如本文所用，“基线”意指描述在施用某些治疗药(例如，整联蛋白β7拮抗剂)之前确定的患者状况的临床(例如，体征或症状)值或实验室值。可以确定其基线值的临床值或实验室值的例子包括但不限于血液学值和临床化学值，如血红蛋白、血细胞比容、血小板计数、钠、钾、氯化物等、CDAI评分、SES-CD评分、PRO2评分或其他的患者报告结局指标如IBDQ或CD-PRO/SS。

如本文所用，术语“样品”指从目的受试者获得或衍生的组合物，所述组合物含有例如基于物理特征、生物化学特征、化学特征和/或生理特征待表征和/或鉴定的细胞实体和/或其他分子实体。例如，短语“疾病样品”及其变种指从目的受试者获得的将预计或已知含有待表征的细胞实体和/或分子实体的任何样品。样品可以从目的受试者的组织或从受试者的外周血获得。

“β7整联蛋白拮抗剂”或“β7拮抗剂”指抑制一种或多种生物学活性或阻碍β7整联蛋白与一种或多种其相关分子结合的任何分子。本发明的拮抗剂可以用来调节整联蛋白β7相关作用的一个或多个方面，所述作用包括但不限于与α4整联蛋白亚基结合、与αE整联蛋白亚基缔合、α4β7整联蛋白与MAdCAM、VCAM-1或纤连蛋白结合和αEβ7整联蛋白与E-钙黏着蛋白结合。这些作用可以受到任何生物学相关机制调节，包括破坏配体与β7亚基或与α4β7或αEβ7二聚体整联蛋白结合，和/或因破坏α整联蛋白亚基和β整联蛋白亚基之间的缔合，从而抑制二聚体整联蛋白形成而受到调节。在本发明的一个实施方案中，β7拮抗剂是抗β7整联蛋白抗体(或抗β7抗体)。在一个实施方案中，抗β7整联蛋白抗体是人源化抗β7整联蛋白抗体并且更具体地是重组人源化抗β7单克隆抗体(或rhuMAbβ7)。在一些实施方案中，本发明的抗β7抗体是抗整联蛋白β7拮抗性抗体，所述抗体抑制或阻断β7亚基与α4整联蛋白亚基结合、与αE整联蛋白亚基缔合、α4β7整联蛋白与MAdCAM、VCAM-1或纤连蛋白结合和αEβ7整联蛋白与E-钙黏着蛋白结合。

“β7亚基”或“β7亚基”意指人β7整联蛋白亚基(Erle等人,(1991)J.Biol.Chem.266:11009-11016)。β7亚基与α4整联蛋白亚基(如人α4亚基)缔合(Kilger和Holzmann(1995)J.Mol.Biol.73:347-354))。α4β7整联蛋白据报道在大部分成熟淋巴细胞以及小群胸腺细胞、骨髓细胞和肥大细胞上表达。(Kilshaw和Murant(1991)Eur.J.Immunol.21:2591-2597；Gurish等人,(1992)149:1964-1972；以及Shaw,S.K.和Brenner,M.B.(1995)Semin.Immunol.7:335)。β7亚基还与αE亚基如人αE整联蛋白亚基缔合(Cepek,K.L等人,(1993)J.Immunol.150:3459)。αEβ7整联蛋白在肠道内上皮淋巴细胞(iIEL)上表达(Cepek,K.L.(1993)上文)。

“αE亚基”或“αE整联蛋白亚基”或“αE亚基”或“αE整联蛋白亚基”或“CD103”意指被发现与上皮内淋巴细胞上β7整联蛋白缔合的整联蛋白亚基，所述αEβ7整联蛋白介导iEL与表达E-钙黏着蛋白的肠上皮结合(Cepek,K.L.等人,(1993)J.Immunol.150:3459；Shaw,S.K.和Brenner,M.B.(1995)Semin.Immunol.7:335)。

“MAdCAM”或“MAdCAM-1”在本发明的上下文中互换使用并且指粘膜地址素细胞黏附分子-1蛋白质，所述蛋白质是包含一个短胞质尾、一个跨膜区和一个由三个免疫球蛋白样结构域组成的胞外序列的单链多肽。已经克隆鼠、人和恒河猴MAdCAM-1的cDNA(Briskin等人,(1993)Nature,363:461-464；Shyjan等人,(1996)J.Immunol.156:2851-2857)。

“VCAM-1”或“血管细胞黏附分子-1”、“CD106”指在活化的内皮上表达并且在内皮-白细胞相互作用(如炎症期间白细胞的结合和变移)中重要的α4β7和α4β1的配体。

“CD45”指蛋白质酪氨酸磷酸酶(PTP)家族的蛋白质。已知PTP是调节多种细胞过程(包括细胞生长、分化、有丝分裂周期和致癌性转化)的信号传导分子。这种PTP含有一个胞外结构域、一个单次跨膜区段及二个串联胞质内催化结构域，并且因此属于受体型PTP。这个基因在造血细胞中特异性表达。已经证实这种PTP是T细胞和B细胞抗原受体信号转导的必需调节物。它通过与抗原受体复合体的组分直接相互作用或通过激活抗原受体信号转导过程所需要的各种Src家族激酶来发挥作用。这种PTP还阻抑JAK激酶，并且因此作为细胞因子受体信号转导的调节物发挥作用。已经报道了这个基因的四个可变剪接转录物变体，它们编码不同的同工型。(Tchilian EZ,Beverley PC(2002)."CD45 in memory anddisease."Arch.Immunol.Ther.Exp.(Warsz.)50(2):85-93.Ishikawa H,Tsuyama N,Abroun S等人(2004)."Interleukin-6,CD45 and the src-kinases in myeloma cellproliferation."Leuk.Lymphoma 44(9):1477-81)。

存在CD45的多种同工型：CD45RA、CD45RB、CD45RC、CD45RAB、CD45RAC、CD45RBC、CD45RO、CD45R(ABC)。CD45也高度糖基化。CD45R是最长的蛋白质并且从T细胞分离时在200kDa处迁移。B细胞也表达糖基化更重的CD45R，致使分子量达220kDa，因此命名为B220；220kDa的B细胞异构体。B220表达不限于B细胞并且还可以在活化的T细胞上、在树状细胞和其他抗原呈递细胞的亚群上表达。Stanton T,Boxall S,Bennett A等人,(2004)"CD45variant alleles:possibly increased frequency of a novel exon4CD45polymorphism in HIV seropositive Ugandans."Immunogenetics 56(2):107-10。

“消化道归巢的淋巴细胞”指具有选择性归巢至肠道淋巴结和组织而不归巢至外周淋巴结和组织的特征的淋巴细胞亚群。这个淋巴细胞亚组以多种细胞表面分子组合(包括但不限于CD4、CD45RA和β7组合)的独特表达模式为特征。一般，可以将至少两个外周血CD4

如本文相对于细胞表面标记物所用，符号“+”表示细胞表面标记物的阳性表达。例如，CD4

如本文相对于细胞表面标记物所用，符号“-”表示细胞表面标记物的阴性表达。例如，CD45RA

如本文相对于细胞表面标记物所用，符号“低”表示淋巴细胞上相对低的细胞表面标记物表达水平，而“高”表示淋巴细胞上相对高的细胞表面标记物表达水平。在流式细胞术中，β7

“外周归巢的淋巴细胞”指具有归巢至外周淋巴结和组织而不归巢至肠道淋巴结和组织的特征的淋巴细胞亚群。在一个示例性实施方案中，如上文解释，外周归巢的淋巴细胞是在流式细胞测定法中被鉴定为CD45RA

“胃肠道炎性疾病”是一组在黏膜中造成炎症和/或溃疡的慢性病症。这些病症例如包括炎性肠病(例如，Crohn病、溃疡性结肠炎、未定型结肠炎和传染性结肠炎)、黏膜炎(例如，口腔黏膜炎、胃肠道黏膜炎、鼻黏膜炎和直肠炎)、坏死性小肠结肠炎和食管炎。

“炎性肠病”或“IBD”在本文中互换地用来指造成炎症和/或溃疡并且包括而不限于Crohn病和溃疡性结肠炎的肠疾病。

“Crohn病(CD)”和“溃疡性结肠炎(UC)”是病因学未知的慢性炎性肠病。不同于溃疡性结肠炎，Crohn病可以侵袭肠的任何部分。Crohn病的最突出特征是肠壁的颗粒状、浅红-紫色水肿性增稠。伴随炎症的形成，这些肉芽肿经常丧失其限定的边界并与周围组织整合。腹泻和肠阻塞是主要的临床特征。与溃疡性结肠炎一样，Crohn病的过程可以是连续或复发的、轻度或重度的，但是不同于溃疡性结肠炎，Crohn病不可通过切除涉及的肠治愈。大部分Crohn病患者在某个时间上需要手术，但是后续复发常见并且持续医学治疗是常见的。

Crohn病可以涉及从口腔至肛门的消化道任何部分，虽然一般,它在回结肠区域、小肠区域或结肠-肛门直肠区域发生。在组织病理学上，本疾病表现为断续肉芽肿、隐窝脓肿、裂隙和口疮性溃疡。炎性浸润是混合型的，由淋巴细胞(T细胞和B细胞)、浆细胞、巨噬细胞和中性粒细胞组成。分泌IgM和分泌IgG的浆细胞、巨噬细胞和中性粒细胞存在不相称的增加。

抗炎药柳氮磺吡啶和5-氨基水杨酸酸(5-ASA)用于治疗轻度活动性结肠Crohn病并且通常开具意图维持疾病的缓解。甲硝唑和环丙沙星在功效方面类似于柳氮磺吡啶并且尤其开具用于治疗肛周疾病。在更严重的病例中，开具皮质类固醇类以治疗活动性加重并且有时可以维持缓解。硫唑嘌呤和6-巯基嘌呤也已经用于需要长期施用皮质类固醇类的患者中。已经提出这些药物可以在长期预防中发挥作用。不幸地，在一些患者中起效之前可能存在非常长的延迟(直至六个月)。止泻药物也可以在一些患者中提供症状缓解。营养性疗法或要素饮食可以改善患者的营养状态并且引起急性疾病的对症改善，但是它不引起持久的临床缓解。抗生素用于治疗继发性小肠细菌过度生长及用于治疗化脓性并发症。

“有效剂量”指以需要的剂量并持续需要的时间段，有效实现所需治疗结果或预防结果的量。

如本文所用，术语“患者”指需要治疗的任何单个受试者。在某些实施方案中，本文的患者是人。

本文的“受试者”一般是人。在某些实施方案中，受试者是非人类哺乳动物。示例性非人类哺乳动物包括实验室动物、家养动物、宠物、竞赛动物和原种动物(stock animal)，例如，小鼠、猫、犬、马和奶牛。一般，受试者符合治疗资格，例如，治疗胃肠道炎性疾病资格。

如本文所用，受试者的“寿命”指启动研究后受试者生命的剩余部分。

术语“不充分反应”、“丧失反应”和“难治性”在本文中互换地使用并且指尽管具有一种或多种治疗药(例如，皮质类固醇类，免疫抑制剂和/或抗TNF)治疗的历史，活动性疾病的体征或症状迁延或再出现。

术语“抗体”和“免疫球蛋白”以最广意义互换地使用并且包括单克隆抗体(例如，全长或完整的单克隆抗体)、多克隆抗体、多价抗体、多特异性抗体(例如，双特异性抗体，只要它们显示出所需的生物学活性)并且也可以包括某些抗体片段(如本文更详细地描述)。抗体可以是人的、人源化的和/或亲和力成熟的。

“抗体片段”仅包含完整抗体的一部分，其中该部分优选地保留正常情况下在完整抗体中存在时与该部分相关的多种功能中的至少一种功能和一般大部分或全部功能。在一个实施方案中，抗体片段包含完整抗体的抗原结合位点并且因此保留结合抗原的能力。在另一个实施方案中，抗体片段，例如包含Fc区的抗体片段，保留正常情况下在完整抗体中存在时与Fc区相关的多种功能(如FcRn结合作用、抗体半寿期调节作用、ADCC功能和补体结合作用)中的至少一种功能。在一个实施方案中，抗体片段是具有基本上与完整抗体相似的体内半寿期的单价抗体。例如，这种抗体片段可以包含与能够对该片段赋予体内稳定性的Fc序列连接的一条抗原结合臂。

如本文所用的术语“单克隆抗体”指从基本上同质的抗体群体中获得的抗体，即，构成这个群体的各个抗体是基本上相同的，例外是可能少量存在的可能天然存在的突变。单克隆抗体是高度特异的，即针对单一抗原。另外，与一般包括针对不同决定簇(表位)的不同抗体的多克隆抗体制备物相反，每种单克隆抗体针对抗原上的单个决定簇。

本文中的“单克隆抗体”特别包括这些“嵌合抗体”，其中重链和/或轻链的部分与源自特定物种或属于特定抗体类别或亚类的抗体以及这种抗体的片段中的相应序列相同或同源，同时所述链的其余部分与源自另一个物种或属于另一个抗体类别或亚类的抗体以及这种抗体的片段中的相应序列相同或同源，只要它们显示所需的生物学活性(美国专利号4,816,567；和Morrison等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81:6851-6855(1984))。

非人(例如，小鼠)抗体的“人源化”形式是含有从非人免疫球蛋白衍生的最少序列的嵌合抗体。对大部分情况而言，人源化抗体是这些人免疫球蛋白(受体抗体)，其中来自所述受体的高变区中的残基由来自非人物种(供体抗体)如小鼠、大鼠、兔或非人灵长类动物的具有所需特异性、亲和力和能力的高变区中的残基替换。在一些情况下，人免疫球蛋白的构架区(FR)残基由相应的非人残基替换。另外，人源化抗体可以包含在受体抗体中或在供体抗体中不存在的残基。作出这些修饰以进一步完善抗体性能。通常，人源化抗体将包含基本上全部的至少一个和一般两个可变结构域，其中全部或基本上全部的高变环与非人免疫球蛋白的那些高变环对应并且全部或基本上全部的FR区是具有人免疫球蛋白lo序列的那些FR。人源化抗体任选地还将包含免疫球蛋白恒定区(Fc)的至少部分、通常人免疫球蛋白的恒定区的至少部分。对于进一步细节，参见Jones等人,Nature 321:522-525(1986)；Reichmann等人,Nature 332:323-329(1988)；和Presta,Curr.Op.Struct.Biol.2:593-596(1992)。还参见以下综述文章和其中引用的参考文献：Vaswani和Hamilton,Ann.Allergy,Asthma&Immunol.1:105-115(1998)；Harris,Biochem.Soc.Transactions 23:1035-1038(1995)；Hurle和Gross,Curr.Op.Biotech.5:428-433(1994)

“人抗体”是一种抗体，所述抗体包含与人产生的抗体的氨基酸序列相对应的氨基酸序列和/或已经使用如本文中公开的用于产生人抗体的任何技术产生。这类技术包括筛选人衍生的组合文库，如噬菌体展示文库(见，例如，Marks等人,J.Mol.Biol.,222:581-597(1991)和Hoogenboom等人,Nucl.Acids Res.,19:4133-4137(1991))；使用用于产生人单克隆抗体的人骨髓瘤和小鼠-人杂合骨髓瘤细胞系(见，例如，Kozbor J.Immunol.,133:3001(1984)；Brodeur等人,Monoclonal Antibody Production Techniques andApplications,第55-93页(Marcel Dekker,Inc.,New York,1987)；和Boerner等人,J.Immunol.,147:86(1991))；和在不存在内源免疫球蛋白产生的情况下能够产生完整人抗体库的转基因动物(例如，小鼠)中产生单克隆抗体(见，例如，Jakobovits等人,Proc.Natl.Acad.Sci USA,90:2551(1993)；Jakobovits等人,Nature,362:255(1993)；Bruggermann等人,Year in Immunol.,7:33(1993))。这种人抗体定义特别排除包含来自非人动物的抗原结合残基的人源化抗体。

“分离的”抗体是已经鉴定过并且与其自然环境的组分分离和/或从其中回收的一种抗体或多肽。其自然环境的杂质组分是将干扰该抗体的诊断性或治疗性用途的物质并且可以包括酶、激素和其他蛋白质性或非蛋白质性溶质。在某些实施方案中，将该抗体纯化(1)至以重量计大于95％的抗体，如Lowry法所测定，并且经常以重量计大于99％、纯化(2)至足以通过利用转杯测序仪(spinning cup sequenator)获得至少15个N端残基或内部氨基酸序列的程度或纯化(3)至通过还原或非还原条件下使用考马斯蓝或使用银染的SDS-PAGE所确定的均一性。分离的抗体包括重组细胞内部在原位的抗体，因为该抗体的自然环境的至少一种组分将不存在。然而，一般将通过至少一个纯化步骤制备分离的抗体。

术语“超变区”、“HVR”或“HV”指抗体可变结构域中在序列上高度变化和/或形成结构上确定的环的区域。通常，抗体包含六个高变区；VH中三个(H1、H2、H3)和VL中三个(L1、L2、L3)。本文中使用和包括了众多的高变区描述。Kabat互补性决定区(CDR)基于序列变异性并且是最常使用的(Kabat等人,Sequences of Proteins of Immunological Interest,第5版.Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,Md.(1991))。相反，Chothia指结构环的位置(Chothia和Lesk J.Mol.Biol.196:901-917(1987))。AbM高变区代表Kabat CDR和Chothia结构环之间的折中方案，并且由OxfordMolecular's AbM建模软件使用。“接触”高变区基于可获得的复合物晶体结构的分析结果。下文指出来自这些HVR的每一者中的残基。

高变区可以包含如下“延长的高变区”：VL中的24-36或24-34(L1)、46-56或49-56或50-56或52-56(L2)和89-97(L3)和VH中的26-35(H1)、50-65或49-65(H2)和93-102、94-102或95-102(H3)。对于这些定义中的每一者，将可变结构域残基根据Kabat等人上文编号

“构架”或“FR”残基是除如本文中定义的高变区残基之外的那些可变结构域残基。

“人类共有构架”是这样的构架，它代表在人免疫球蛋白VL或VH构架序列的选项中最常出现的氨基酸残基。通常，人免疫球蛋白VL或VH序列的选项来自可变结构域序列的亚组。通常，所述的序列亚组是如Kabat等人中那样的亚组。在一个实施方案中，对于VL，该亚组是如Kabat等人中描述的亚组κI。在一个实施方案中，对于VH，该亚组是如Kabat等人中描述的亚组III。

“亲和力成熟的”抗体是在一个或多个CDR中存在一个或多个改变的一种抗体，其中与没有这些改变的亲本抗体相比，所述改变导致抗体对抗原的亲和力改善。在某些实施方案中，亲和力成熟的抗体将对靶抗原具有纳摩尔或甚至皮摩尔亲和力。通过本领域已知的方法产生亲和力成熟的抗体。Marks等人,Bio/Technology 10:779-783(1992)描述了借助VH和VL结构域改组的亲和力成熟。CDR和/或构架残基的随机诱变由Barbas等人ProcNat.Acad.Sci.USA 91:3809-3813(1994)；Schier等人Gene 169:147-155(1996)；Yelton等人J.Immunol.155:1994-2004 (1995)；Jackson等人,J.Immunol.154(7):3310-9(1995)；和Hawkins等人,J.Mol.Biol.226:889-896(1992)描述。

如本文所用，短语“基本上相似的”或“基本上相同的”指二个数值之间的相似程度足够高(通常，一个数值与本发明的抗体相关并且另一个与参比/对照抗体相关)，从而本领域技术人员将认定在依据所述值测量的生物学特征(例如，Kd值)的背景范围内，二个值之间的差异具有微小或没有生物学和/或统计显著性。作为参比/对照抗体的值的函数，所述二个值之间的差异小于约50％、小于约40％、小于约30％、小于约20％、小于约10％。

“结合亲和力”通常指分子(例如，抗体)的单一结合位点及其结合配偶物(例如，抗原)之间非共价相互作用的总计强度。除非另外指出，否则如本文所用，“结合亲和力”指反映结合对子的成员(例如，抗体和抗原)之间1:1相互作用的固有结合亲和力。分子X对其配偶物Y的亲和力可以通常由解离常数(Kd)代表。亲和力可以由本领域已知的常见方法测量，包括本文所述的那些方法。低亲和力抗体通常缓慢结合抗原并且倾向于轻易解离，而高亲和力抗体通常较快地结合抗原并且倾向于更长地保持结合。本领域已知测量结合亲和力的多种方法，其中任一者均可以用于本发明的目的。

术语“可变的”指这样的事实：可变结构域的某些部分在序列方面在抗体之间明显不同并且用于每个特殊抗体对其特殊抗原的结合作用和特异性中。然而，变异性并不在抗体的可变结构域范围内均匀分布。它集中于轻链可变结构域和重链可变结构域的三个区段(称作超变区)中。可变结构域的更高度保守部分称作构架区(FR)。天然重链和轻链的可变结构域各自包括由三个高变区连接的大体上采取β折叠构型的四个FR，所述FR形成环，所述环连接该β折叠结构和在一些情况下形成该β折叠结构的部分。每条链中的高变区由FR密切接近地固定在一起，并且在高变区来自其他链的情况下，对形成抗体的抗原-结合部位作出贡献(参见Kabat等人,Sequences of Proteins of Immunological Interest,第5 版.Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD.(1991))。恒定结构域不直接参与抗体与抗原结合，但是展示出多种效应子功能，如使抗体参与抗体依赖的细胞毒作用(ADCC)。

木瓜蛋白酶消化抗体产生了两个相同的抗原结合片段，称作“Fab片段，各自具有单个抗原结合位点，和一个残余“Fc片段，该片段的名称反映其轻易结晶的能力。胃蛋白酶处理产生了具有两个抗原结合位点并且仍能够交联抗原的F(ab')

“Fv”是含有完整抗原识别和抗原结合位点的最小抗体片段。这个区域由紧密、非共价缔合的一个重链可变结构域和一个轻链可变结构域的二聚体组成。正是在这种格局中每个可变结构域的三个高变区相互作用以限定V

Fab片段还含有轻链的恒定结构域和重链的第一恒定结构域(CH1)。Fab＝片段因在重链CH1结构域的羧基端处附加额外几个残基(包括来自抗体铰链区的一个或多个半胱氨酸)而与Fab片段不同。Fab'-SH在本文是Fab'的名称，其中恒定结构域的半胱氨酸残基携带至少一个游离巯基。F(ab')

来自任何脊椎动物物种的抗体的“轻链”可以基于其恒定域的氨基酸序列划分成两个明显不同类型(称作κ(κ)和λ(λ))之一。

取决于抗体重链恒定结构域的氨基酸序列，可以将抗体(免疫球蛋白)划分成不同的“类别”。存在五个大类的免疫球蛋白：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，并且这些类别中的几种可以进一步划分成亚类(同种型)，例如，IgG

术语“全长抗体”、“完好抗体”和“完整抗体”在本文中可互换地用来指处于其基本上完好形式的抗体，不指如下文定义的抗体片段。该术语特别指具有重链的抗体，所述重链含有Fc区。

出于本文的目的，“裸抗体”是不与细胞毒部分或放射标记物缀合的抗体。

术语“Fc区”在本文中用来限定免疫球蛋白重链的C端区域，包括天然序列Fc区和变异Fc区。虽然免疫球蛋白重链的Fc区的界限可能略微变动,但是通常将人IgG重链Fc区限定为从位置Cys226或从Pro230处的氨基酸残基延伸至其重链的羧基端。可以例如在产生或纯化抗体期间或通过重组工程化编码抗体重链的核酸，移除Fc区的C端赖氨酸(根据EU编号体系，残基447)。因此，完整抗体的组合物可以包含移除全部K447残基的抗体群、未移除K447残基的抗体群以及具有含K447残基和不含该残基的抗体的混合物的抗体群。

除非另外说明，否则本文的免疫球蛋白重链中残基的编号按照如Kabat等人,Sequences of Proteins of Immunological Interest,第5版.Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD(1991)中的EU index进行，所述文献通过引用的方式明确并入本文中。“如Kabat中那样的EU index”指人IgG1 EU抗体的残基编号法。

“有功能的Fc区”拥有天然序列Fc区的“效应子功能”。示例性“效应子功能”包括C1q结合作用；补体依赖的细胞毒性；Fc受体结合作用；抗体依赖的细胞介导细胞毒性(ADCC)；吞噬；下调细胞表面受体(例如，B细胞受体；BCR)等。这类效应子功能通常需要Fc区与结合结构域(例如，抗体可变结构域)组合并且可以例如使用如本文所公开的多种测定法进行评估。

“天然序列Fc区”包含与自然界中存在的Fc区的氨基酸序列相同的氨基酸序列。天然序列人Fc区包括天然序列人IgG1 Fc区(非A同种型和A同种异型)；天然序列人IgG2 Fc区；天然序列人IgG3 Fc区；和天然序列人IgG4 Fc区，以及其天然存在的变体。

“变异Fc区”包含因至少一个氨基酸修饰而不同于Fc区天然序列的氨基酸序列。在某些实施方案中，与天然序列Fc区或与母体多肽的Fc区相比，变异Fc区在天然序列Fc区中或在母体多肽的Fc区中具有至少一个氨基酸置换，例如约一个至约十个氨基酸置换，并且在某些实施方案中，约一个至约五个氨基酸置换。在某些实施方案中，本文中的变异Fc区将与天然序列Fc区和/或与母体多肽的Fc区具有至少约80％同源性，或与之具有至少约90％同源性，或与之具有至少约95％同源性。

根据抗体重链恒定结构域的氨基酸序列，完整抗体可以划分成不同的“类别”。存在五个主要类别的完整抗体：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，并且这些类型中的几种可以进一步划分成“亚类”(同种型)，例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA和IgA2。与不同类别抗体相对应的重链恒定结构域分别称作α、δ、ε、γ和μ。不同类别的免疫球蛋白的亚基结构和三维构型是熟知的。

“依赖抗体的细胞介导细胞毒性”和“ADCC”指细胞介导的反应，其中表达Fc受体(FcR)的非特异性细胞毒细胞(例如，天然杀伤(NK)细胞、中性粒细胞和巨噬细胞)识别靶细胞上结合的抗体并且随后造成靶细胞的裂解。用于介导ADCC的主要细胞即NK细胞，仅表达FcγRIII，而单核细胞表达FcγRI、FcγRII和FcγRIII。造血细胞上的FcR表达在Ravetch和Kinet,Annu.Rev.Immunol 9:457-92(1991)第464页的表3中总结。为了评估目的分子的ADCC活性，可以进行体外ADCC测定法，如美国专利号5,500,362或5,821,337中描述的那种测定法。用于此类测定法的效应细胞包括外周血单核细胞(PBMC)和天然杀伤(NK)细胞。备选或另外，可以在体内，例如，在动物模型中，如在Clynes等人,PNAS(USA)95:652-656(1998)公开中的那种动物模型中评估目的分子的ADCC活性。

“人效应细胞”是表达一种或多种FcR并执行效应子功能的白细胞。在某些实施方案中，细胞至少表达FcγRIII并且执行ADCC效应子功能。介导ADCC的人白细胞的实例包括外周血单核细胞(PBMC)、天然杀伤(NK)细胞、单核细胞、细胞毒T细胞和中性粒细胞。效应细胞可以从其天然来源分离，例如，如本文所述，从血液或PBMC分离。

术语“Fc受体”或“FcR”用来描述与抗体的Fc区结合的受体。在某些实施方案中，FcR是人天然序列FcR。另外，FcR是结合IgG抗体的一种受体(γ受体)并且包括FcγRI、FcγRII和FcγRIII亚类的受体，包括这些受体的等位变体和可变剪接形式。FcγRII受体包括FcγRIIA(“激活性受体”)和FcγRIIB(“抑制性受体”)，它们具有主要在其胞质域内不同的相似氨基酸序列。激活性受体FcγRIIA在其胞质域中含有基于酪氨酸的免疫受体激活基序(ITAM)。抑制性受体FcγRIIB在其胞质域中含有基于酪氨酸的免疫受体抑制基序(ITIM)(参见

“单链Fv”或“scFv”抗体片段包括抗体的V

术语“双体抗体”指具有两个抗原结合位点的抗体小片段，所述小片段包括在相同的多肽链(V

“亲和力成熟的”抗体是在一个或多个高变区中存在一个或多个改变的抗体，其中与没有这些改变的亲本抗体相比，所述改变导致抗体对抗原的亲和力改善。在某些实施方案中，亲和力成熟的抗体将对靶抗原具有纳摩尔或甚至皮摩尔亲和力。通过本领域已知的方法产生亲和力成熟的抗体。Marks等人,Bio/Technology 10:779-783(1992)描述了借助VH和VL结构域改组的亲和力成熟。CDR和/或构架残基的随机诱变由Barbas等人,ProcNat.Acad.Sci.USA 91:3809-3813(1994)；Schier等人,Gene 169:147-155(1995)；Yelton等人,J.Immunol.155:1994-2004(1995)；Jackson等人,J.Immunol.154(7):3310-9(1995)；和Hawkins等人,J.Mol.Biol.226:889-896(1992)描述。

本文中的“氨基酸序列变体”抗体是具有异于主要物种抗体的氨基酸序列的抗体。在某些实施方案中，氨基酸序列变体将与主要物种抗体拥有至少约70％同源性，或它们将与与主要物种抗体至少约80％或至少约90％同源。氨基酸序列变体在主要物种抗体的氨基酸序列内部或与该氨基酸序列相邻的某些位置处拥有置换、缺失和/或插入。本文中的氨基酸序列变体的例子包括酸性变体(例如，脱酰胺的抗体变体)、碱性变体、在其一条或两条轻链上具有氨基端前导序列延长(例如，VHS-)的抗体、在其一条或两条重链上具有C末端赖氨酸残基的抗体等，并且包括重链和/或轻链的氨基酸序列变异的组合。本文中的特定目的抗体变体是其一条或两条轻链上包含氨基端前导序列延长、任选地还相对于主要物种抗体包含其他氨基酸序列差异和/或糖基化差异的抗体。

本文中的“糖基化变体”抗体是具有与之连接一个或多个糖部分的抗体，所述糖部分与连接至主要物种抗体的一个或多个糖部分不同。本文中的糖基化变体的例子包括具有与其Fc区连接的G1或G2低聚糖结构、而非G0低聚糖结构的抗体、具有与其一条或两条轻链连接的一个或两个糖部分的抗体、没有与抗体的一条或两条重链连接的糖的抗体等以及糖基化改变的组合。在抗体具有Fc区的情况下，低聚糖结构可以连接至抗体的一条或两条重链，例如，在残基299(298，残基的Eu编号)处连接。

如本文所用的术语“细胞毒药物”指抑制或阻碍细胞功能和/或造成细胞破坏的物质。该术语意在包括放射性同位素(例如，At

术语“细胞因子”是用于一个细胞群体所释放的蛋白质的类属术语，所述蛋白质作为细胞间介质作用于另一种细胞。此类细胞因子的例子是淋巴因子类、单核因子类和传统的多肽激素。细胞因子当中包括生长激素如人生长激素、N-甲硫酰人生长激素和牛生长激素；副甲状腺激素；甲状腺素；胰岛素；胰岛素原；松弛素；松弛素原；糖蛋白激素类如促卵泡激素(FSH)、促甲状腺激素(TSH)和促黄体激素(LH)；肝生长因子；成纤维细胞生长因子；催乳素；胎盘催乳激素；肿瘤坏死因子-α和-β；缪勒管抑制物质；小鼠促性腺激素相关肽；抑制素；活化素；血管内皮生长因子；整联蛋白；血小板生成素(TPO)；神经生长因子类如NGF-β；血小生长因子；转化生长因子(TGF)如TGF-α和TGF-β；胰岛素样生长因子-I和-II；促红细胞生成素(EPO)；骨诱导因子；干扰素如干扰素-α、-β和-γ；集落刺激因子类(CSF)如巨噬细胞-CSF(M-CSF)；粒细胞-巨噬细胞-CSF(GM-CSF)；和粒细胞-CSF(G-CSF)；白介素(IL)如IL-1、IL-1α、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12；肿瘤坏死因子如TNF-α或TNF-β；和其他多肽因子，包括LIF和kit配体(KL)。如本文所用，术语“细胞因子”包括来自天然来源或来自重组细胞培养物的蛋白质和天然序列细胞因子的生物学活性等同物。

如本文对辅助疗法所用的术语“免疫抑制剂”指作用在于抑制或掩蔽本文中正在受到治疗的受试者之免疫系统的物质。这将包括抑制细胞因子产生、下调或抑制自身抗原表达或掩蔽MHC抗原的物质。这类药物的例子包括2-氨基-6-芳基-5取代的嘧啶(参见美国专利号4,665,077)；非类固醇抗炎药(NSAID)；更昔洛韦；他克莫司；糖皮质激素如皮质醇或醛固酮；抗炎药如环氧合酶抑制剂；5-脂加氧酶抑制剂；或白三烯受体拮抗剂；嘌呤拮抗药如硫唑嘌呤或吗替麦考酚酯(MMF)；烷基化剂如环磷酰胺；溴隐亭(bromocryptine)；达那唑；氨苯砜；戊二醛(其掩蔽MHC抗原，如美国专利号4,120,649中所述)；针对MHC抗原和MHC片段的抗独特型抗体；环孢菌素；6巯基嘌呤；类固醇如皮质类固醇类或糖皮质类固醇或糖皮质激素类似物，例如，泼尼松(包括泼尼松等同物，例如，包括但不限于、甲基泼尼松龙，包括SOLU-MEDROL.RTM.甲泼尼龙琥珀酸钠、和cortef[氢化可的松])、布地奈德和地塞米松；二氢叶酸还原酶抑制剂如甲氨蝶呤(口服或皮下)；抗疟疾药如氯喹和羟氯喹；柳氮磺吡啶；来福米特(leflunomide)；细胞因子或细胞因子受体抗体或拮抗剂，包括抗干扰素-α、-β或-γ抗体、抗肿瘤坏死因素因子(TNF)-α抗体(英夫单抗(infliximab)(REMICADE.RTM)或阿达木单抗(adalimumab))、抗TNF-α免疫黏附素(依那西普)、抗TNF-β抗体、抗白介素-2(IL-2)抗体和抗IL-2受体抗体和抗白介素-6(IL-6)受体抗体和拮抗剂；抗LFA-1抗体，包括抗CD11a抗体和抗CD18抗体；抗L3T4抗体；异源抗淋巴细胞球蛋白；泛T抗体、抗CD3或抗CD4/CD4a抗体；含有LFA-3结合结构域的可溶性肽(1990年7月26日公开的WO90/08187)；链激酶；转化生长因子β(TGF-β)；链道酶；来自宿主的RNA或DNA；FK506；RS-61443；苯丁酸氮芥；脱氧精胍菌素(deoxyspergualin)；雷帕霉素；T细胞受体(Cohen等人,美国专利号5,114,721)；T细胞受体片段(Offner等人,Science,251:430-432(1991)；WO 90/11294；Ianeway,Nature,341:482(1989)；和WO 91/01133)；BAFF拮抗剂如BAFF或BR3抗体或免疫黏附素和zTNF4拮抗剂(综述参见Mackay和Mackay,Trends Immunol.,23:113-5(2002)，并且还参见下文定义)；干扰辅助T细胞信号的生物药，如抗CD40受体或抗CD40配体(CD154)，包括针对CD40-CD40配体的阻断抗体(例如，Durie等人,Science,261:1328-30(1993)；Mohan等人,J.Immunol.,154:1470-80(1995))和CTLA4-Ig(Finck等人,Science,265:1225-7(1994))；和T细胞受体抗体(EP 340,109)如T10B9。

如本文所用，“未给予皮质类固醇”意指在未给予患者皮质类固醇的时间期间患者(例如，Crohn病患者)不使用皮质类固醇类治疗疾病或疾病症状。例如，未给予皮质类固醇12个月的Crohn病患者持续12个月不使用皮质类固醇类治疗Crohn病的症状。

如本文所用的术语“缓解”或“缓解”指减少、缩减或消除某病状、疾病、病症或表型，包括畸形或症状。

疾病或病症(例如，炎性肠病，例如，溃疡性结肠炎或Crohn病)的“症状”是受试者遭遇到的结构、功能或感觉方面的任何病态现象或与正常的背离，并且其表示疾病。

表述“治疗有效量”指有效预防、减轻或治疗疾病或病症(例如，炎性肠病，例如，溃疡性结肠炎或Crohn病)的量。例如，抗体的“治疗有效量”指有效预防、减轻或治疗指定疾病或病症的抗体的量。类似地，抗体和第二化合物的组合的“治疗有效量”指组合时有效预防、减轻或治疗指定疾病或病症的抗体量和第二化合物的量。

应当理解，术语“两种化合物的组合”不意指化合物不得不在彼此的混合物中施用。因此，用这种组合治疗或使用这种组合涵盖化合物的混合物或分别施用这些化合物，并且包括在同一天或不同天施用。因此，术语“组合”意指两种或更多种化合物单独或彼此混合物时用于治疗。当抗体和第二化合物例如组合施用至受试者时，每次在第二化合物也在受试者中存在时，抗体存在于受试者中，无论抗体和第二化合物是否单独或在混合下施用至受试者。在某些实施方案中，在抗体之前施用除抗体之外的化合物。在某些实施方案中，在抗体之后施用除抗体之外的化合物。

出于本文的目的，“肿瘤坏死因子-α(TNF-α)”指包含如Pennica等人,Nature,312:721(1984)或Aggarwal等人,JBC,260:2345(1985)中所述的氨基酸序列的人TNF-α分子。

本文中的“TNF-α抑制剂”是通常通过与TNF-α结合并抵消其活性而在某个程度抑制TNF-α的生物学功能的物质。本文中具体构思的TNF抑制剂的例子是依那西普

“皮质类固醇”指模拟或增进天然存在的皮质类固醇的作用的具有类固醇总体化学结构的几种合成物质或天然存在物质中的任一种。合成性皮质类固醇的实例包括泼尼松、泼尼松龙(包括甲泼尼龙)、地塞米松、曲安西龙、布地奈德和倍他米松。

“拮抗剂”指能够抵消、阻断、抑制、消除、减少或干扰特定或指定蛋白质的活性(包括在配体情况下其与一种或多种受体结合或在受体情况下与一种或多种配体结合)的分子。拮抗剂包括抗体和其抗原结合片段、蛋白质、肽、糖蛋白、糖肽、糖脂、多糖、低聚糖、核酸、生物有机分子、肽模拟物、药理学物质及其代谢物、转录和翻译控制序列等。拮抗剂还包括蛋白质的小分子抑制剂和与蛋白质特异性结合，因而掩蔽蛋白质与其靶结合的融合蛋白、受体分子和衍生物、蛋白质的拮抗剂变体、针对蛋白质的反义分子、针对蛋白质的RNA适配体和核酶。

“自注入装置”指例如由患者或居家看护者自我施用治疗药的医用装置。自注入装置包括设计用于自我施用的自动注射器装置和其他装置。

本文中定义或另外表征了多种额外的术语。

组合物和方法

提供了通过施用β7整联蛋白拮抗剂治疗受试者(例如，人类)中胃肠道炎性疾病的方法。潜在拮抗剂的例子包括与免疫球蛋白和β7整联蛋白的融合物结合的寡核苷酸，并尤其包括抗体，所述抗体包括而不限于多克隆和单克隆抗体和抗体片段、单链抗体、抗独特型抗体和这类抗体或片段的嵌合或人源化形式以及人抗体和抗体片段。备选地，潜在拮抗剂可以是一种密切相关的蛋白质，例如，识别配体但不赋予作用，因而竞争性抑制β7整联蛋白作用的β7整联蛋白突变形式。

另一种潜在的β7整联蛋白拮抗剂是使用反义技术制备的反义RNA或DNA构建体，其中例如通过与靶向的mRNA杂交并阻止蛋白质翻译，反义RNA或DNA分子发挥直接阻断mRNA翻译的作用。反义技术可以用来通过三螺旋体形成或反义DNA或RNA控制基因表达，所述二种方法方法均基于多核苷酸与DNA或RNA的结合。例如，本文中编码β7整联蛋白的多核苷酸序列的5'编码部分用来设计长度约10个至40个碱基对的反义RNA寡核苷酸。DNA寡核苷酸设计成与涉及转录的基因区域互补(三螺旋-参见Lee等人,Nucl.Acids Res.,6:3073(1979)；Cooney等人,Science,241:456(1988)；Dervan等人,Science,251:1360(1991))，因而阻止β7整联蛋白的转录和产生。反义RNA寡核苷酸在体内与mRNA杂交并阻断mRNA分子翻译成β7整联蛋白(反义-Okano,Neurochem.,56:560(1991)；Oligodeoxynucleotides as AntisenseInhibitors of Gene Expression(CRC Press:Boca Raton,Fla.,1988)。也可以将上文描述的寡核苷酸递送至细胞，从而反义RNA或DNA可以在体内表达以抑制PRO多肽产生。当使用反义DNA时，衍生自翻译起始位点(例如，靶基因核苷酸序列约-10位置和+10位置之间)的寡脱氧核糖核苷酸是常见的。

潜在的其他拮抗剂包括与活性部位、配体接合位点或结合分子结合位点结合，因而阻断β7整联蛋白之正常生物学活性的小分子。小分子的例子包括但不限于小肽或肽样分子，一般为可溶性肽，及合成性非肽酰基有机或无机化合物。

核酶是能够催化特异性切割RNA的酶促RNA分子。核酶通过与互补靶RNA的序列特异性杂交，随后核酸内切切割而发挥作用。可以通过已知技术鉴定潜在RNA靶内部的特定核酶剪切位点。关于更多细节，参见，例如，Rossi,Current Biology,4:469-471(1994)，和PCT公开号WO 97/33551(1997年9月18日公布)。

用来抑制转录的三螺旋形式的核酸分子应当为单链并由脱氧核苷酸组成。这些寡核苷酸的碱基组成如此设计，从而它通过Hoogsteen碱基配对法则促进三螺旋形成，所述法则通常在双链体的一条链上需要大小合适的嘌呤段或嘧啶段。关于更多细节，参见，PCT公开号WO 97/33551。可以通过本文中讨论的任一种或多种筛选测定法和/或通过本领域技术人员熟知的任何其他筛选技术鉴定这些小分子。

拮抗剂的筛选测定法设计成鉴定与本文鉴定的基因编码的β7整联蛋白结合或复合或否则干扰编码的多肽与其他细胞蛋白相互作用的化合物。这类筛选测定法将包括可用于高通量筛选化学文库的测定法，这令其特别合适鉴定候选小分子药物。

这些测定法可以按本领域充分表征的多种模式进行，所述模式包括蛋白质-蛋白质结合测定法、生物化学筛选测定法、免疫测定法和基于细胞的测定法。

B.

在一个实施方案中，β7整联蛋白拮抗剂是抗β7抗体。如下文描述，示例性抗体包括多克隆抗体、单克隆抗体、人源化抗体、人抗体、双特异性抗体和异质缀合抗体等。

1.多克隆抗体

可以在动物中通过多次皮下(SC)或腹内(IP)注射相关抗原和佐剂产生多克隆抗体。可以有用的是，使用双官能剂或衍化剂，例如，马来酰亚胺苯甲酰硫代琥珀酰亚胺酯(通过半胱氨酸残基缀合)、N-羟琥珀酰亚胺(借助赖氨酸残基)、戊二醛、琥珀酐、SOCl

通过将例如100μg或5μg蛋白质或缀合物(分别用于兔或小鼠)与3体积弗氏完全佐剂组合并且在多个部位皮内注射该溶液，将动物针对抗原、免疫原性缀合物或衍生物免疫。一个月后，将这些动物用弗氏完全佐剂中1/5至1/10初始量的肽或缀合物，通过在多个部位皮下注射进行强化免疫。七至14天后，将动物放血并且测定血清的抗体滴度。对动物强化免疫直至滴度平台期。在某些实施方案中，将动物用相同抗原的缀合物强化免疫，但是所述抗原与不同的蛋白质缀合和/或借助不同的交联试剂缀合。缀合物也可以在重组细胞培养物中作为蛋白质融合物产生。另外，适当地使用聚集剂如明矾来增强免疫反应。

2.单克隆抗体

单克隆抗体可以使用由Kohler等人,Nature,256:495(1975)首次描述的杂交瘤方法产生，或可以通过重组DNA方法产生(参见，例如，美国专利号4,816,567)。

在杂交瘤方法中，如上所述使小鼠或其他适宜的宿主动物如仓鼠免疫以激发产生或能够产生抗体的淋巴细胞，其中所述的抗体会与用于免疫的蛋白质特异性结合。备选地，淋巴细胞可以体外免疫。免疫后，将淋巴细胞分离并随后使用合适的融合剂如聚乙二醇，使其与骨髓瘤细胞系融合以形成杂交瘤细胞(Goding,Monoclonal Antibodies:Principlesand Practice,第59-103页(Academic Press,1986))。

在合适的培养基中接种并培育如此制备的杂交瘤细胞，其中所述的培养基可以含有抑制未融合的亲本骨髓瘤细胞(也称作融合伴侣)生长或存活的一种或多种物质。例如，如果亲本骨髓瘤细胞缺少次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(HGPRT或HPRT)，杂交瘤的选择性培养基一般会包含次黄嘌呤、氨基蝶呤和胸苷(HAT培养基)，所述物质防止HGPRT缺陷型细胞的生长。

在某些实施方案中，融合伴侣骨髓瘤细胞是那些细胞，所述细胞高效融合、支持所选择的产生抗体的细胞稳定高水平产生抗体并且对选择性培养基敏感，所述选择性培养基针对未融合的亲本细胞选择。在某些实施方案中，骨髓瘤细胞系是小鼠骨髓瘤系，如从美国加利福尼亚州旧金山Salk Institute Cell Distribution Center可获得的MOPC-21和MPC-11小鼠肿瘤衍生的那些，以及从美国弗吉尼亚州马纳萨斯市美国典型培养物保藏中心可获得的SP-2及衍生物，例如X63-Ag8-653细胞。也已经描述了用于产生人单克隆抗体的人骨髓瘤和小鼠-人杂合骨髓瘤细胞系(Kozbor,J.Immunol,133:3001(1984)；和Brodeur等人,Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications,第51-63页(Marcel Dekker,Inc.,New York,1987))。

对其中杂交瘤细胞正在生长的培养基分析针对抗原的单克隆抗体的产生。在某些实施方案中，通过免疫沉淀或通过体外结合测定法如放射免疫测定法(RIA)或酶-联免疫吸附测定法(ELISA)确定杂交瘤细胞产生的单克隆抗体的结合特异性。

单克隆抗体的结合亲和力可以例如通过Munson等人,Anal.Biochem.,107:220(1980)中所述的Scatchard分析法测定。一旦鉴定到产生具有所需特异性、亲和力和/或活性的抗体的杂交瘤细胞，所述克隆可以借助有限稀释法亚克隆并且通过标准方法培育(Goding,Brodeur 等人,Monoclonal Antibodies:Principles and Practice,第59-103页(Academic Press,1986))。用于此目的的合适培养基包括例如D-MEM或RPMI-1640培养基。此外，可以将杂交瘤细胞在动物中作为腹水肿瘤体内生长，例如，通过将所述细胞腹膜内注入小鼠。通过常规抗体纯化方法例如亲和色谱法(例如，使用蛋白A或蛋白G-Sepharose)或离子交换色谱法、羟基磷灰石色谱法、凝胶电泳法、透析法等将所述亚克隆分泌的单克隆抗体与培养基、腹水液或血清恰当地分开。

使用常规方法(例如，通过使用能够与编码鼠抗体重链和轻链的基因特异性结合的寡核苷酸探针)，轻易地分离出编码所述单克隆抗体的DNA。杂交瘤细胞充当这类DNA的来源。一旦分离，可以将这种DNA置入表达载体，随后将所述表达载体转染入不产生抗体蛋白的宿主细胞，如大肠杆菌细胞、猴COS细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞或骨髓瘤细胞，以实现重组宿主细胞中合成单克隆抗体。关于细菌中重组表达编码抗体的DNA的综述包括Skerra等人,Curr.Opinion in Immunol.5:256-262(1993)和Pluckthun,Immunol.Revs.,130:151-188(1992)。

在又一个实施方案，可以从抗体噬菌体文库，分离单克隆抗体或抗体片段，所述抗体噬菌体文库使用例如McCafferty等人,Nature,348:552-554(1990)中所描述的技术产生。Clackson等人,Nature,352:624-628(1991)和Marks等人,J.Mol.Biol.222:581-597(1991)描述了使用噬菌体文库分别分离出小鼠抗体和人抗体。后续出版物描述了通过链改组法产生高亲和力(nM级)人抗体(Marks等人,Bio/Technology 10:779-783(1992))，以及组合型感染和体内重组作为构建极大噬菌体文库的策略(Waterhouse等人,Nuc.Acids.Res,21:2265-2266(1993))。因而，这些技术是分离单克隆抗体的传统单克隆抗体杂交瘤技术的有效替代。

可以修饰编码抗体的DNA以产生嵌合或融合抗体多肽，例如，通过人重链恒定结构域序列和轻链恒定结构域序列(CH和CL)置换小鼠同源序列(美国专利号4,816,567；和Morrison,等人,Proc.Natl Acad.Sci. USA,81:6851(1984))或通过免疫球蛋白编码序列与非免疫球蛋白多肽(异源多肽)的编码序列的全部或部分融合来修饰。可以对非免疫球蛋白多肽序列置换抗体的恒定结构域，或对它们置换一种抗体的一个抗原结合部位的可变结构域以产生嵌合双价抗体，所述嵌合双价抗体包含对一种抗原具有特异性的一个抗原结合部和对不同抗原具有特异性的另一个抗原结合部位。

示例性抗β7抗体是Fib504、Fib21、22、27、30(Tidswell,M.J Immunol.1997Aug 1；159(3):1497-505)或其人源化衍生物。Fib504的人源化抗体在美国专利公开号20060093601(作为美国专利号7,528,236授权)中详细公开，所述文献的内容通过引用的方式完整并入本文(还参见下文讨论)。

3.人抗体和人源化抗体

本发明的抗β7整联蛋白抗体还可以包括人源化抗体或人抗体。非人类(例如，小鼠)抗体的“人源化”形式是含有从非人免疫球蛋白衍生的最少序列的嵌合免疫球蛋白、免疫球蛋白链或其片段(如抗体的Fv、Fab、Fab'、F(ab')

用于人源化非人抗体的方法是本领域熟知的。通常，人源化抗体具有从非人类的来源引入的一个或多个氨基酸残基。这些非人类氨基酸残基经常称作“输入”残基，它们一般取自“输入”可变结构域。人源化可以基本上按照Winter和合作者[Jones等人,Nature,321:522-525(1986)；Reichmann等人,Nature,332:323-327(1988)；Verhoeyen等人,Science,239:1534-1536(1988)]的方法，通过将啮齿类CDR序列或CDR序列置换为相应的人抗体序列进行。因此，此类人源化抗体是嵌合抗体(美国专利号4,816,567)，其中基本上小于完整人可变结构域的区域已经由来自非人类物种的相应序列置换。在实践中，人源化抗体一般是其中一些CDR残基并且可能一些FR残基由来自啮齿动物抗体中类似位点的残基置换的人抗体。当抗体意在人治疗性使用时，为降低抗原性和HAMA应答(人抗小鼠抗体)，选择在产生人源化抗体中待使用的人可变结构域(重链和轻链)是极重要的。根据所谓搣最佳配合攠方法，针对已知的人可变结构域序列完整文库筛选啮齿动物抗体的可变结构域的序列。鉴定到与啮齿动物V结构域序列最接近的人V结构域序列并且接受其内部的人构架区(FR)用于人源化抗体(Sims等人,J.Immunol,151:2296(1993)；Chothia等人,J.Mol.Biol.,196:901(1987))。另一种方法使用从具有特定亚组轻链或重链的全部人类抗体的共有序列衍生的特殊构架区。相同的框架可以用于几种不同的人源化抗体(Carter等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:4285(1992)；Presta等人,J.Immunol.151:2623(1993))。更重要的是抗体应当人源化，同时保留针对抗原的高结合亲和力和其他有利生物学特性。为实现这个目标，根据某些实施方案，通过使用亲本序列和人源化序列的三维模型，分析亲本序列和多种构思性人源化产物的过程而制备人源化抗体。三维免疫球蛋白模型通常是可获得的并且是本领域技术人员熟悉的。说明并展示所选择候选免疫球蛋白序列的可能三维构象性结构的计算机程序是可获得的。对这些展示结果的检验允许分析残基在候选免疫球蛋白序列发挥作用中的可能角色，即，分析影响候选免疫球蛋白结合其抗原的能力的残基。以这种方式，可以从受体序列和输入序列选出并且组合FR残基，从而实现想要的抗体特征，如对靶抗原增加的亲和力。通常，高变区残基直接并且绝大部分参与影响抗原结合作用。

构思多种形式的人源化抗β7整联蛋白抗体。例如，人源化抗体可以是抗体片段，如Fab，其任选地用一种或多种细胞毒药物缀合以产生免疫缀合物。备选地，人源化抗体可以是完整抗体，如完整的IgG1抗体。

示例性人源化抗β7抗体包括但不限于rhuMAbβ7，其为针对整联蛋白亚基β7的人源化单克隆抗体并且是衍生自大鼠抗小鼠/人单克隆抗体FIB504(Andrew等人,1994JImmunol 1994；153:3847-61)。它已经过工程化以包含人免疫球蛋白IgG1重链和κ1轻链构架并且由中国仓鼠卵巢细胞产生。这种抗体与调节胃肠道中淋巴细胞亚群转运和停留并涉及炎性肠病(IBD)如溃疡性结肠炎(UC)和Crohn病(CD)的二种整联蛋白即α4β7(Holzmann等人1989Cell,1989；56:37-46；Hu等人,1992,Proc Natl Acad Sci USA 1992；89:8254-8)和αEβ7(Cepek等人,1993 J Immunol 1993；150:3459-70)结合。rhuMAbβ7是α4β7和其配体(粘膜地址素细胞黏附分子-1[MAdCAM]-1、血管细胞黏附分子[VCAM]-1和纤连蛋白)之间细胞性相互作用以及αEβ7和其配体(E-钙黏着蛋白)之间相互作用的体外强力阻断剂。rhuMAbβ7以相似高亲和力与来自兔、食蟹猴和人类的淋巴细胞上的β7可逆结合。它还以高亲和力与小鼠β7结合。rhuMAbβ7和其变体的氨基酸序列以及产生和使用例如在美国申请专利号20060093601(作为美国专利号7,528,236授权)中详细公开，所述文献的内容完整并入本文。

图1A和图1B描述了以下者的可变轻链序列和可变重链序列的比对结果：轻链人亚组κI共有序列(图1A，SEQ ID NO:12)、重链人亚组III共有序列(图1B，SEQ ID NO:13)、大鼠抗小鼠β7抗体(Fib504)可变轻链(图1A，SEQ ID NO:10)、大鼠抗小鼠β7抗体(Fib504)可变重链(图1B，SEQ ID NO:11)，和人源化抗体变体的可变轻链序列和可变重链序列的比对结果：人源化hu504K移植可变轻链(图1A，SEQ ID NO:14)、人源化hu504K移植可变重链(图1B，SEQ ID NO:15)、变体hu504-5、hu504-16和hu504-32(图1A中指示距人源化hu504K移植的氨基酸变异)(轻链)(按出现顺序分别是SEQ ID NO:22-24，)和图1B(重链)变体hu504-5、hu504-16和504-32(SEQ ID NO:25)。

4.人抗体

作为人源化的备选，可以产生人抗体。例如，现在可以产生转基因动物(例如，小鼠)，其中所述转基因动物一旦免疫就能够在不存在内源免疫球蛋白生产的情况下产生完整的人抗体库。例如，已经描述了在嵌合和种系突变小鼠中抗体重-链铰链区(JH)基因的纯合缺失导致完全抑制内源抗体产生。在此类种系突变小鼠中转移入人种系免疫球蛋白基因排列将导致当抗原攻击时人抗体的产生。见，例如，Jakobovits等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,90:2551(1993)；Jakobovits等人,Nature,362:255-258(1993)；Bruggemann等人,Year in Immuno.,7:33(1993)；美国专利号5,545,806、5,569,825、5,591,669(均属于GenPharm)；美国专利号5,545,807；和WO 97/17852。

可选地，噬菌体展示技术(McCafferty等人,Nature 348:552-553(1990))可以用来在体外从源自未免疫供体的免疫球蛋白可变(V)结构域基因库中产生人抗体和人抗体片段。根据这项技术，将抗体V基因符合读码框地克隆到丝状噬菌体(如M13或fd)的主要衣壳蛋白基因或小衣壳蛋白基因中并且作为功能性抗体片段展示在噬菌体粒子的表面上。因为丝状粒子含有噬菌体基因组的单链DNA拷贝，故基于抗体功能特性的选择也导致选出编码展示这些特性的抗体的基因。因而，噬菌体模拟了B-细胞的一些特征。噬菌体展示可以按多种模式进行，综述参见例如，Johnson,Kevin S.和Chiswell,David J.,Current Opinionin Structural Biology 3:564-571(1993)。几种来源的V-基因节段可以用于噬菌体展示。Clackson等人,Nature,352:624-628(1991)从衍生自免疫小鼠的脾中的V基因小型随机组合型文库中分离了一组多样的抗噁唑酮抗体。可以从未免疫的人供体构建V基因库，并且可以基本上按照Marks等人,J.Mol.Biol.222:581-597(1991)或Griffith等人,EMBO J.12:725-734(1993)描述的技术分离针对多样化抗原组(包括自身抗原)的抗体。还见美国专利号5,565,332和5,573,905。

如上文讨论，也可以通过体外活化的B细胞产生人抗体(参见美国专利号5,567,610和5,229,275)。

5.抗体片段

在某些情况下，存在使用抗体片段而非完整抗体的优势。所述片段的较小尺寸允许迅速清除，并且可以导致改善进抵实体肿瘤。

已经开发了用于产生抗体片段的多种技术。传统上，这些片段借助蛋白酶解消化完整抗体衍生(见，例如，Morimoto等人,Journal of Biochemical and BiophysicalMethods 24:107-117(1992)；和Brennan等人,Science,229:81(1985))。然而，现在可以通过重组宿主细胞直接产生这些片段。例如，抗体片段可以从上文讨论的抗体噬菌体文库分离。备选地，Fab'-SH片段可以从大肠杆菌直接回收并且化学地偶联以形成F(ab')

6.双特异性抗体

双特异性抗体是对至少两个不同表位具有结合特异性的抗体。示例性双特异性抗体可以与如本文所述的β7整联蛋白的两个不同表位结合。其他的这类抗体可以将TAT结合位点与另一种蛋白质的结合位点组合。备选地，抗β7整联蛋白臂可以与结合到白细胞上触发分子如T细胞受体分子(例如CD3)或IgG的Fc受体(Fc.γ.R)如Fc.γRI(CD64)、Fc.γRII(CD32)和Fc.γ.RIII(CD16)的臂组合，从而使细胞防御机制聚焦并局限于表达TAT的细胞。双特异性抗体也可以用来使细胞毒药物局限于表达TAT的细胞。这些抗体拥有TAT结合臂和结合细胞毒药物(例如，皂草毒素蛋白、抗干扰素-α、长春碱类生物碱、蓖麻毒蛋白A链、甲氨蝶呤或放射性同位素半抗原)的臂。可以将双特异性抗体制备为全长抗体或抗体片段(例如，F(ab’)

用于产生双特异性抗体的方法是本领域已知的。全长双特异性抗体的传统生产基于共表达两个免疫球蛋白重链-轻链对，其中所述两种链具有不同特异性(Millstein等人,Nature,305:537-539(1983))。因为免疫球蛋白重链和轻链的随机分配，这些杂交瘤(四合瘤(quadroma)产生10种不同抗体分子的可能混合物，其中仅一种分子具有正确的双特异性结构。正确分子的纯化相当繁琐，通常借助亲和层析步骤进行，并且产物产率低。在WO 93/08829中和Traunecker等人,EMBO J.,10:3655-3659(1991)中公开了相似的方法。

根据一种不同方案，具有所需结合特异性的抗体可变结构域(抗体-抗原结合位点)与免疫球蛋白恒定结构域序列融合。在某些实施方案中，这种融合物具有Ig重链恒定结构域，包括铰链区、C

在某些实施方案中，双特异性抗体由一条臂中具有第一结合特异性的杂合免疫球蛋白重链和另一条臂中的杂合免疫球蛋白重链-轻链对(提供第二结合特异性)组成。发现这种非对称结构促进所需的双特异性化合物与不想要的免疫球蛋白链组合分离，因为免疫球蛋白轻链在所述双特异性分子的仅一半中的存在提供了便利的分离方式。这种方法在WO94/04690中公开。关于产生双特异性抗体的进一步细节，参见，例如Suresh等人,Methodsin Enzymology 121:210(1986)。

根据美国专利号5,731,168中描述的另一个方案，可以将一对抗体分子之间的界面工程化以最大化从重组细胞培养物回收的异二聚体的百分数。在某些实施方案中，该界面包含C

双特异性抗体包括交联抗体或“异质缀合”抗体。例如，异质缀合下的抗体之一可以偶联于抗生物素蛋白，另一种抗体偶联于生物素。已经例如提出这类抗体将免疫系统细胞导引至不想要的细胞(美国专利号4,676,980)并用于治疗HIV感染(WO 91/00360、WO 92/200373和EP 03089)。可以使用任何便利的交联方法产生异质缀合抗体。合适的交联剂是本领域熟知的并且连同许多交联技术一起在美国专利号4,676,980中公开。

也已经在文献中描述从抗体片段产生双特异性抗体的技术。例如，可以利用化学键制备双特异性抗体。Brennan等人,Science 229:81(1985)描述了其中完整抗体经蛋白酶解方式切割以产生F(ab’)

最近的进展已经促进从大肠杆菌直接回收Fab'-SH片段，所述片段可以化学地偶联以形成双特异性抗体。Shalaby等人,J.Exp.Med.,175:217-225(1992)描述了全人双特异性抗体F(ab')

构思了大于二价的抗体。例如，可以制备三特异性抗体。Tutt等人,J.Immunol.147:60(1991)。

7.异质缀合抗体

异质缀合抗体也处于本发明的范围内。异质缀合抗体由二个共价接合的抗体组成。已经例如提出这类抗体将免疫系统细胞导引至不想要的细胞[美国专利号4,676,980]并用于治疗HIV感染[WO 91/00360、WO 92/200373；EP 03089]。构思了可以使用在合成性蛋白质化学中已知的方法，包括涉及交联剂的那些方法，在体外制备抗体。例如，可以使用二硫键交换反应或通过形成硫醚键，构建免疫毒素。用于此目的的合适试剂的例子包括亚氨基硫醇酯(iminothiolate)和4-巯基丁酰亚氨酸甲酯和例如在美国专利号4,676,980中公开的那些。

8多价抗体

与双价抗体相比，多价抗体可以由表达与抗体结合的抗原的细胞更快内化(和/或分解代谢)。本发明的抗体可以是具有三个或更多个抗原结合位点的多价抗体(例如，四价抗体)(并非IgM类)，所述多价抗体可以通过重组表达编码抗体的多肽链的核酸轻易地产生。多价抗体可以包含一个二聚化结构域和三个或更多个抗原结合位点。在某些实施方案中，二聚化结构域包含Fc区或铰链区或由其组成。在这种情况下，抗体将包含一个Fc区和在该Fc区氨基端的三个或更多个抗原结合位点。在某些实施方案中，本文中的多价抗体包含三个至约八个、但一般地四个抗原结合位点或由其组成。多价抗体包含至少一条多肽链(和一般地两条多肽链)，其中多肽链包含两个或更多个可变结构域。例如，多肽链可以包含VD1-(X1)

9.效应子功能工程化

可以想要的是就效应子功能方面修饰本发明的抗体，从而例如增强该抗体的抗原依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)和/或补体依赖性细胞毒性(CDC)。这可以通过在抗体的Fc区中引入一个或多个氨基酸置换实现。备选或另外，可以在Fc区中引入半胱氨酸残基，因而允许在该区域内形成链间二硫键。如此产生的同二聚体抗体可以具有改善的内化能力和/或提高的补体介导细胞杀伤作用和抗体依赖性细胞毒性(ADCC)。参见Caron等人,J.ExpMed.176:1191-1195(1992)和Shopes,B.J.Immunol.148:2918-2922(1992)。也可以使用如Wolff等人,Cancer Research 53:2560-2565(1993)中所述的异双功能交联剂制备具有增强的抗肿瘤活性的同型二聚体抗体。备选地，可以工程化具有双Fc区并且因而可以具有增强的补体裂解能力和ADCC能力的抗体。参见Stevenson等人,Anti-Cancer Drug Design 3:219-230(1989)。为了增加抗体的血清半寿期，例如，可以将救援受体(salvage receptor)结合表位并入抗体(尤其抗体片段)，如美国专利号5,739,277中所述。如本文所用，术语“救援受体结合表位”指IgG分子(例如，IgG

10.免疫缀合物

在本文方法中使用的拮抗剂或抗体任选地与另一种药物(如细胞毒药物)或细胞因子缀合。

缀合将通常借助共价键实现，所述共价键的确切性质将由导引分子和整联蛋白β7拮抗剂或抗体多肽上的连接位点决定。一般，通过添加接头修饰非肽药物，所述接头允许借助其氨基酸侧链、糖链或通过化学修饰在抗体上引入的反应基团与抗β7整联蛋白抗体缀合。例如，可以通过赖氨酸残基的ε-氨基、通过游离α-氨基、通过二硫键交换成半胱氨酸残基或通过用高碘酸氧化糖链中的1,2-二醇以借助西夫-碱基键引起含有各种亲核体的药物连接，连接药物。参见，例如，美国专利号4,256,833。蛋白质修饰剂包括胺反应性试剂(例如，活性酯、异硫氰酸酯、醛和磺酰卤)、巯基反应性试剂(例如，卤代乙酰基衍生物和马来酰亚胺)和羧酸反应性试剂和醛反应性试剂。整联蛋白β7拮抗剂或抗体多肽可以通过使用双官能交联试剂与肽药物共价接合。异双官能试剂更常用并且借助二种不同活性部分(例如，胺反应性加巯基、碘乙酰胺或马来酰亚胺)的使用，允许二种不同的蛋白质受控偶联。这类连接剂的用途是本领域熟知的。参见，例如，上文Brinkley和美国专利号4,671,958。也可以使用肽接头。在备选时，可以通过制备融合多肽，使抗β7整联蛋白抗体多肽与肽部分连接。

其他双官能蛋白质偶联剂的例子包括N-琥珀酰亚胺-3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯(SPDP)、4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸琥珀酰亚胺酯、亚氨基硫杂环戊烷(IT)、亚氨酯的双官能衍生物(如，己二亚氨盐酸二甲酯)、活性酯(如，辛二酸二琥珀酰亚胺酯)、醛(如，戊二醛)、双-叠氮化合物(如，双(对-重氮盐苯甲酰基)己二胺)、双-重氮盐衍生物(如，双-(对-重氮盐苯甲酰基)-乙二胺)、二异氰酸酯(如，2,6-二异氰酸甲苯酯)和双活性氟化合物(如，1,5-二氟-2,4-二硝基苯)。

11.免疫脂质体

本文公开的抗β7整联蛋白抗体也可以配制为免疫脂质体。“脂质体”是由多种类型的脂类、磷脂和/或表面活性剂组成的小囊泡，其用于递送药物至哺乳动物。脂质体的组分通常以双层形式排列，其类似于生物膜的脂质排列形式。通过本领域已知的方法制备含有抗体的脂质体，所述方法如在Epstein等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82:3688(1985)；Hwang等人,Proc.Natl Acad.Sci.USA 77:4030(1980)；美国专利号4,485,045和4,544,545；和1997年10月23日公布的WO97/38731中描述。循环时间增强的脂质体在美国专利号5,013,556中公开。

可以通过反相蒸发方法，采用包含磷脂酰胆碱、胆固醇和PEG衍生化磷脂酰乙醇胺(PEG-PE)的脂质组合物，产生特别有用的脂质体。将脂质体经孔径限定的滤器挤出以产生具有所需直径的脂质体。

借助二硫键交换反应，本发明抗体的Fab片段可以与脂质体缀合，如Martin等人,J.Biol.Chem.257:286-288(1982)中所述。化疗药任选地含于脂质体内部。参见Gabizon等人,J.National Cancer Inst.81(19):1484(1989)。

12.用于产生抗体的载体、宿主细胞和重组方法

还提供了编码本文所述的抗β7抗体或多肽药物的分离核酸、包含这些核酸的载体和宿主细胞和用于产生抗体的重组技术。

为了重组产生抗体，可以将编码它的核酸分离并插入复制型载体中用于进一步克隆(扩增DNA)或用于表达。在另一个实施方案中，可以通过同源重组产生抗体，例如，如美国专利号5,204,244中描述，所述文献特别通过引用方式并入本文。使用常规方法(例如，通过使用能够与编码抗体重链和轻链的基因特异性结合的寡核苷酸探针)，轻易地分离出编码所述单克隆抗体的DNA。许多载体是可获得的。载体组件通常包括但不限于以下一者或多者：信号序列、复制起点、一个或多个标记基因、增强子元件、启动子和转录终止序列，例如，如1996年7月9日授权并特别通过引用方式并入本文的美国专利号5,534,615中所述。

在本文载体中克隆或表达DNA的合适宿主细胞是上文描述的原核生物细胞、酵母细胞或高等真核生物细胞。用于此目的合适原核生物包括真细菌，如革兰氏阴性或革兰氏阳性生物，例如，肠杆菌科(Enterobacteriaceae)如埃希氏菌属(Escherichia)(例如，大肠杆菌)、肠杆菌属(Enterobacter)、欧文氏菌属(Erwinia)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)、变形菌属(Proteus)、沙门氏菌属(Salmonella)(例如，鼠伤寒沙门氏菌(Salmonellatyphimurium))、沙雷菌属(Serratia)(例如，粘质沙雷菌(Serratia marcescans))和志贺氏菌(Shigella)、以及芽孢杆菌纲(Bacilli)如枯草芽孢杆菌(B.subtilis)和地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)(例如，在1989年4月12日公开DD 266,710中披露的地衣芽孢杆菌41P)、假单胞菌属(Pseudomonas)(如铜绿假单胞菌(P.aeruginosa))和链霉菌属(Streptomyces)。一个大肠杆菌克隆宿主是大肠杆菌294(ATCC 31,446)，不过其他菌株如大肠杆菌B、大肠杆菌X1776(ATCC 31,537)和大肠杆菌W3110(ATCC 27,325)是合适的。这些例子是说明性的而非限制的。

除原核生物之外，真核微生物如丝状真菌或酵母是用于编码抗β7整联蛋白抗体的载体的合适克隆宿主或表达宿主。低等真核宿主微生物当中，最常使用酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)或普通面包酵母。但是，众多其他属、物种和菌株是通常可获得并在本文中有用，如粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)；克鲁维酵母属(Kluyveromyces)宿主，例如，乳酸克鲁维酵母(K.lactis)、脆壁克鲁维酵母(K.fragilis)(ATCC 12,424)、保加利亚克鲁维酵母(K.bulgaricus)(ATCC 16,045)、K.wickeramii(ATCC24,178)、K.waltii(ATCC 56,500)、果蝇克鲁维酵母(K.drosophilarum)(ATCC 36,906)、耐热克鲁维酵母(K.thermotolerans)和马克斯克鲁维酵母(K.marxianus)；耶罗维亚酵母(yarrowia)(EP 402,226)；巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)(EP 183,070)；假丝酵母属(Candida)；里氏木霉属(Trichoderma reesia)(EP 244,234)；粗糙脉孢菌(Neurosporacrassa)；许旺酵母属(Schwanniomyces)如西方许旺酵母属(Schwanniomycesoccidentalis)；和丝状真菌，例如，脉孢菌属(Neurospora)、青霉属(Penicillium)、弯颈霉属(Tolypocladium)及曲霉属(Aspergillus)宿主如构巢曲霉(A.nidulans)和黑曲霉(A.niger)。

用于表达糖基化抗β7抗体的合适宿主细胞衍生自多细胞生物。无脊椎动物细胞的例子包括植物细胞和昆虫细胞。已经鉴定了多个杆状病毒毒株和变体及来自宿主如草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)(毛虫)、埃及伊蚊(Aedes aegypti)(蚊)、白纹伊蚊(Aedesalbopictus)(蚊)、黑腹果蝇(Drosophila melanogaster)(果蝇)和家蚕(Bombyx mori)的相应容许性昆虫宿主细胞。用于转染的多种毒株是可公开获得的，例如，苜蓿银纹夜蛾(Autographa californica)NPV的L-1变体和家蚕NPV的Bm-5株，并且可以根据本发明用作本文中的病毒，尤其用于转染草地贪夜蛾细胞。也可以利用棉花、玉米、马铃薯、大豆、碧冬茄、番茄和烟草的植物细胞培养物作为宿主。

但是，脊椎动物细胞已经是最有意义的，并且以培养方式(组织培养)增殖脊椎动物细胞已经变成例行方法。可用哺乳动物宿主细胞系的例子是由SV40转化的猴肾CV1系(COS-7，ATCC CRL 1651)；人胚肾系(293细胞或经亚克隆用于悬浮培养生长的293细胞，Graham等人,J.Gen Virol.,36:59(1977))；幼仓鼠肾细胞(BHK，ATCC CCL 10)；中国仓鼠卵巢细胞/-DHFR(CHO，Urlaub和Chasin,Proc Natl Acad Sci USA,77:4216(1980))；小鼠支持细胞(TM4，Mather,Biol.Reprod.,23:243-251(1980))；猴肾细胞(CV1，ATCC CCL 70)；非洲绿猴肾细胞(VERO-76，ATCC CRL-1587)；人宫颈癌细胞(HELA，ATCC CCL 2)；犬肾细胞(MDCK，ATCC CCL 34)；布法罗大鼠肝细胞(BRL 3A，ATCC CRL 1442)；人肺细胞(W138，ATCCCCL 75)；人肝细胞(Hep G2，HB 8065)；小鼠乳腺瘤(MMT 060562，ATCC CCL51)；TRI细胞(Mather等人,Annals N.Y.Acad.Sci.383:44-68(1982))；MRC5细胞；FS4细胞；和人肝瘤系(Hep G2)。

将宿主细胞用上文所述的产生抗β7整联蛋白抗体的表达载体或克隆载体转染或转化并且在常规营养培养基中培养，如果适宜，调整所述常规营养培养基以诱导启动子、选择转化体或扩增编码所需序列的基因。

可以在多种培养基中培养用来产生本发明抗β7整联蛋白抗体的宿主细胞。市售培养基如Ham's F10(Sigma)、极限基本培养基((MEM)，(Sigma)，RPMI-1640(Sigma)和Dulbecco改良Eagle培养基((DMEM)，Sigma)是适于培养宿主细胞。此外，可以使用Ham等人,Meth.Enz.58:44(1979)；Barnes等人,Anal.Biochem.1 02:255(1980)；美国专利号4,767,704；4,657,866；4,927,762；4,560,655；或5,122,469；WO 90/03430；WO 87/00195；或美国专利复审30,985中描述的任何培养基作为宿主细胞的培养基。这些培养基中任一者可以根据需要补充激素和/或其他生长因子(如胰岛素、转铁蛋白或表皮生长因子)、盐(如氯化钠、钙、镁和磷酸盐)、缓冲剂(如HEPES)、核苷(如腺苷和胸苷)、抗生素(如药物GENTAMYCIN

当使用重组技术时，抗体可以在胞内、在周质间隙产生或直接分泌入培养基。如果抗体以胞内方式产生，则作为第一步骤，移除颗粒状残片(宿主细胞或裂解的片段)，例如，通过离心或超滤移除。Carter等人,Bio/Technology 10:163-167(1992)描述了用于分离分泌至大肠杆菌周质间隙的抗体的方法。简而言之，将细胞糊状物在乙酸钠(pH 3.5)、EDTA和苯甲基磺酰氟(PMSF)存在下经约30分钟融化。通过离心移除细胞残片。在抗体分泌入培养基的情况下，首先通常使用市售的蛋白质浓缩滤器，例如，Amicon或Millipore Pellicon超滤装置，浓缩来自这类表达系统的上清液。可以在前述任意步骤中包含蛋白酶抑制剂如PMSF以抑制蛋白酶解，并且可以包含抗生素以防止外来污染物增长。

可以使用，例如，羟基磷灰石色谱、凝胶电泳、透析和亲和色谱纯化从细胞制备的抗体组合物，其中亲和色谱是常见纯化技术。蛋白A作为亲和力配体的适用性取决于抗体中存在的任何免疫球蛋白Fc结构域的种类和同种型。蛋白A可以用来纯化基于人γ.1、γ.2或γ.4重链的抗体(参见，例如，Lindmark等人,J.Immunol.Meth.,62:1-13(1983))。推荐蛋白G用于全部小鼠同种型和用于人γ.3(Guss等人,EMBO J.,5:1567-1575(1986))。亲和力配体与之连接的基质最经常是琼脂糖，但是其他基质是可用的。力学稳定的基质如可控孔度玻璃或聚(苯乙烯-二乙烯)苯允许比用琼脂糖所实现的更快的流速和更短的处理时间。在抗体包含C

C.药物制剂

可以通过将具有所需纯度的抗体与任选的生理可接受载体、赋形剂或稳定剂(Remington's Pharmaceutical Sciences第16版,Osol,A.编著(1980))混合，以水溶液剂、冻干或其他干燥制剂的形式制备包含本发明治疗药、拮抗剂或抗体的治疗性制剂供储存。可接受的载体、赋形剂或稳定剂在所用的剂量和浓度对接受者无毒，并且包括缓冲剂如磷酸盐、柠檬酸、组氨酸和其他有机酸；抗氧化剂(包括抗坏血酸和甲硫氨酸)；防腐剂(如十八烷基苄基二甲基氯化铵；六甲氯铵；苯扎氯铵、苯扎溴铵；苯酚、丁醇或苄醇；烷基尼泊金酯如尼泊金甲酯或丙酯；儿茶酚；雷琐辛；环己醇；3-戊醇和间甲酚)；低分子量(少于约10个残基)多肽；蛋白质，如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水聚合物如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖和其他碳水化合物包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂如EDTA；糖如蔗糖、甘露糖、海藻糖或山梨糖；形成盐的反离子如钠；金属络合物(例如Zn-蛋白质络合物)和/或非离子表面活性剂如TWEEN

本文中的制剂也可以根据正在治疗的特定适应症需要而含有多于一种活性化合物，一般是具有并未相互不利影响的互补活性的那些活性化合物。此类分子适当地以有效用于预期目的的量存在。

有效成分也可以包埋于例如分别通过凝聚技术或界面聚合制备的微胶囊(例如，羟甲基纤维素微胶囊或明胶微胶囊和聚(甲基丙烯酸甲酯)微胶囊)、胶态药物递送系统(例如，脂质体、白蛋白微球体、微乳液、纳米粒子和纳米胶囊)或乳浊液中。此类技术在Remington'sPharmaceutical Sciences第16版,Osol,A.编著(1980)中公开。

待用于体内施用的制剂必须是无菌的。这通过经无菌过滤膜过滤轻易地实现。

可以制备持续释放制品。持续释放制品的合适例子包括含有本发明免疫球蛋白的固态疏水性聚合物半通透性基质，所述基质处于成型制品(例如，薄膜或微胶囊)形式。持续释放基质的例子包括聚酯、水凝胶(例如，聚(甲基丙烯酸2-羟乙酯)或聚(乙烯醇)、聚乳酸(美国专利号3,773,919)、L-谷氨酸和γ-乙基-谷氨酸酯的共聚物、不可降解性乙烯-乙酸乙烯酯、可降解性乳酸-乙醇酸共聚物如LUPRON DEPOT

通过遵循标签上的说明，执行治疗的医师将能够确定个体受试者的适宜剂量。与整联蛋白β7拮抗剂组合或同步施用的市售第二治疗性化合物和其他化合物的配制和给药方案可以根据生产商的说明使用或由熟练的执业者经验确定。

在某些实施方案中，整联蛋白β7拮抗剂每四周施用一次或在0、2和四周施用一次，随后每四周一次持续一个月时间(4周)，或二个月、三个月、或六个月或12个月、或18个月、或24月或患者终生长期施用。在某些实施方案中，治疗由患者自行施用。在某些实施方案中，患者使用含有预充式注射器的自动注射装置自行施用。

在某些实施方案中，向患者施用近平剂量的抗β7抗体。近平剂量是无论重量如何，向每名患者施用的抗β7抗体的特定量。取决于疾病的类型和严重程度，将约50mg和450mg之间近平剂量的抗β7抗体施用至患者，这可以是一个或多个独立注射或输注或施用。这种近平剂量可以皮下施用。在某些实施方案中，近平剂量是约100mg或约200mg或约300mg或约400mg或约450mg。在某些实施方案中，近平剂量是约105mg或约210mg。在某些实施方案中，近平剂量是105mg。在某些实施方案中，近平剂量是210mg。在某些实施方案中，近平剂量每四周一次皮下施用。

在某些实施方案中，初始近平负荷剂量的抗β7抗体后接着是一个或多个近平维持剂量的抗β7抗体。负荷剂量是比维持剂量大的抗β7抗体量。在某些实施方案中，负荷剂量是约200mg或约210mg。在某些实施方案中，负荷剂量是210mg。在某些实施方案中，将210mg抗β7抗体在第0周、第2周、第4周、第8周和第12周施用，并且此后，维持剂量每4 周施用一次。在某些实施方案中，维持剂量是约100mg或约105mg。在某些实施方案中，维持剂量是105mg。

在某些实施方案中，将抗β7抗体施用14周时间。在某些实施方案中，将抗β7抗体施用三个月时间。在某些实施方案中，将抗β7抗体施用六个月时间。在某些实施方案中，将抗β7抗体施用至少12个月(52周)时间。在某些实施方案中，将抗β7抗体施用至少66周时间。在某些实施方案中，将抗β7抗体施用至少70周时间。在某些实施方案中，将抗β7抗体施用至少74周时间。在某些实施方案中，受试者终生施用抗β7抗体。

一般，临床医务人员将施用本发明的抗体(单独或与第二化合物组合)直至达到提供所要求生物学作用的剂量。可以通过本文所述的方法，例如，包括但不限于Crohn病活动指数(CDAI)评分、患者报告结果2(PRO2)评分和Crohn病简化内窥镜指数(SES-CD)评分，监测本发明疗法的进展。

在某些实施方案中，例如使用自注入装置、自动注射器装置或设计用于自我施用的其他装置施用抗β7抗体。各种自注入装置，包括自动注射器装置，是本领域已知和可商业获得的。示例性装置包括但不限于预充式注射器(如来自Becton Dickinson的BD HYPAK

如所示，整联蛋白β7拮抗剂可以单独施用或与至少第二治疗性化合物组合施用。这些第二治疗性化合物通常按照与迄今所用相同的剂量及施用途径或按约1％至99％迄今采用的剂量使用。如果使用这类第二化合物，则在某些实施方案中，它们按照比如果整联蛋白β7拮抗剂不存时的量较低的量使用，从而消除或减少因其造成的副作用。

还指出(例如，参见下文)，本领域已知多种合适的治疗IBD(例如，溃疡性结肠炎和Crohn病)的第二治疗性化合物，并且已经同样地描述这类第二治疗性化合物的剂量和施用方法。

整联蛋白β7拮抗剂和任何第二治疗性化合物的施用可以例如，作为单一组合物或作为两种或更多种不同组合物，使用相同或不同施用途径同时进行。备选地或额外地，施用可以按任何顺序依次进行。在某些实施方案中，可以在两种或更多种组合物的施用之间存在范围从数分钟至数天、从数周至数月的间隔期。例如，整联蛋白β7拮抗剂可以首先施用，接着是第二治疗性化合物。但是，还构思同时施用或在整联蛋白β7拮抗剂之前施用第二治疗性化合物。

用于中度至重度活动性CD受试者的医护标准包括采用标准剂量以下药物的治疗：全身性皮质类固醇，例如，泼尼松(或泼尼松等同物)或布地奈德、免疫抑制剂如硫唑嘌呤，6-巯基嘌呤、或甲氨蝶呤、或肿瘤坏死因子抑制剂(抗TNF)，如英夫单抗、阿达木单抗或聚乙二醇培舍珠单抗。已经批准其他抗整联蛋白疗法用于治疗CD并且这些疗法是那他珠单抗和维多珠单抗。采用整联蛋白β7拮抗剂(如本文中公开的抗β7整联蛋白抗体)治疗将导致改善病情缓解的诱导和/或维持(迅速控制疾病和/或缓解延长)和/或这样的临床反应，其优于针对这类受试者采用的医护标准(包含抗TNF)所实现的临床反应。

在一个实施方案中，用于人类Crohn病(CD)受试者中CD的本发明治疗包括向受试者施用有效量的治疗药，如抗β7整联蛋白抗体，并且还包括向受试者施用有效量的第二药物，所述第二药物是免疫抑制剂、皮质类固醇、抗TNF、疼痛控制药、止泻药、抗生素或其组合。

在一个示例性实施方案中，所述第二药物选自6-巯基嘌呤、硫唑嘌呤、甲氨蝶呤、泼尼松(或泼尼松等同物)、布地奈德、英夫单抗、阿达木单抗和聚乙二醇培舍珠单抗。

这些第二药物全部可以彼此组合使用或本身与第一药物一起使用，从而如本文所用的表述“第二药物”不意指它分别是在第一药物之外的唯一药物。因此，第二药物不必是一种药物，而可以构成或包含多于一种这类药物。

本文中的联合施用可以包括使用各个制剂或单一药物制剂的共同施用，和按照任何顺序的连续施用，其中通常，存在两种(或全部)有效药剂同时发挥其生物学活性的一段时间。

第二药物的联合施用包括使用各个制剂或单一药物制剂的共同施用(同步施用)，和按照任何顺序的连续施用，其中通常，存在两种(或全部)有效药剂(药物)同时发挥其生物学活性的一段时间。

E.

药物开发是一个复杂和昂贵的过程。新药推向市场的成本据估计在8亿美元和10亿美元之间。I期临床试验中不足10％的药物获得批准阶段。为何药物在后期阶段失败的两个关键原因是对剂量-浓度反应和意料以外安全性事件之间的关系缺少了解。鉴于这种情况，重要的是具有得力的工具，所述工具辅助预测药物将在体内如何表现并且辅助临床治疗候选物取得成功(Lakshmi Kamath,Drug Discovery and Development；ModelingSuccess in PK/PD Testing Drug Discovery&Development(2006))。

药代动力学(PK)表征了药物的吸收、分布、代谢和消除特性。药效动力学(PD)确定了针对所施用药物的生理学和生物学反应。PK/PD建模过程确立了这两个过程之间的数学和理论联系并有助于更好地预测药物作用。借助模拟过程的一体化PK/PD建模和计算机辅助试验设计正在整合入许多药物开发程序并且正产生日益增长的影响(Lakshmi Kamath,Drug Discovery and Development；Modeling Success in PK/PD Testing DrugDiscovery&Development(2006))。

一般在药物开发过程的每个阶段进行PK/PD检验。因为开发过程正在变得日益复杂、费时和成本高昂，各企业正在寻求更好地使用PK/PD数据在起点就消除有缺点的候选物并且鉴定最有可能临床成功的那些候选物。(Lakshmi Kamath,上文)。

PK/PD建模方案正在证明可用于确定生物标记物反应、药物水平和给药方案之间的关系。候选药物的PK/PD特征和预测患者对其反应的能力对成功的临床试验至关重要。分子生物学技术最新进展和更好了解多种疾病的靶已经验证生物标记物作为药物治疗功效的良好临床指标。生物标记物测定法有助于鉴定针对候选药物的生物学反应。一旦临床上验证某个生物标记物，则试验模拟可以有效地建模。生物标志物具有实现代用状态的潜力，所述代用状态可能有朝一日替代药物开发中的临床结果。(Lakshmi Kamath,上文)。

外周血中生物标记物的量可以用于鉴定针对整联蛋白β7拮抗剂治疗的生物学反应并且可以因此作为候选物治疗的治功功效的良好临床指标发挥作用。

药物开发中的传统PK/PD建模定义了多个参数如药物剂量浓度、药物暴露效应、药物半寿期、相对于时间的药物浓度和相对于时间的药物效应。当更广义地使用时，定量技术如药物建模、疾病建模、试验建模和市场建模可以支持整个开发过程，通过明确考虑风险和更好地利用知识，这产生更好的决策。药物开发研究者可获得多个PK/PD建模工具，例如，Pharsight,Inc.Mountain View,California开发的WinNonlin和Knowledgebase服务器(PKS)。

认为前文书面说明书及后续实施例足以令本领域技术人员能够实施本发明。除了本文显示和描述的那些修改之外，本发明的各种修改将因前文描述及后续实施例而对本领域技术人员是显而易见的并且落于所附权利要求书的范围内。

可以理解，根据本文所含的教导内容，本发明教导内容对特定问题或情况的应用将处于本领域普通技术人员能力范围内。

本发明的其他细节由以下非限制性实施例进一步说明。本说明书中全部引用的公开内容均通过引用方式明确并入本文。

实施例

实施例1

研究描述

本研究的目的是评估具有独特作用机制(MOA)的抗整联蛋白抗体etrolizumab的功效和安全性，其中已经证实所述抗整联蛋白抗体通过破坏α4β7/MAdCAM-1和αEβ7/E-钙黏着蛋白结合作用，抑制肠粘膜中炎性T细胞的运输和停留。

尽管尚未在患有CD的人类中研究etrolizumab，从UC患者和CD患者的切除物分离的消化道CD4+和CD8+T细胞上etrolizumab的药理学靶即整联蛋白β7受体的初步表达研究表明，两种疾病之间表达水平相似。CD中维多珠单抗(抗α4β7mAb)的报道功效展示了α4β7在这种疾病的病理生物学中的作用(Sandborn WJ等人,Aliment Pharmacol Ther 37:204-13,2013)并且随这类研究之而来的是，etrolizumab将在CD中有效。此外，因为αEβ7+表达据报道在CD患者中升高(Elewaut D等人,Acta Gastroenterol Belg 61:288-94,1998；Oshitani N等人,Int J Mol Med 12:715-9,2003)，同时观察到表达从远端肠至近端肠增加，所以与市售抗整联蛋白抗体和抗TNF疗法相比，etrolizumab的双重MOA可能在CD中带来增强的功效，而无泛发性免疫抑制。

此外，在一项UC患者全球II期研究中，etrolizumab有效治疗中度至重度UC并且在全部入选群体中治疗启动后10周(105mg(100mg标称剂量)每4周[Q4W])时实现安慰剂修正的临床缓解率20.5％(p＝0.058)和内窥镜下缓解率10.3％(p＝0.004)(Vermeire S等人,Gastroenterology 144,S1:S-36,2013；Vermeire S等人,Lancet 384:309–18,2014；Lin等人,Gastroenterology 146:307–315,2014)。此外，etrolizumab具有可接受的安全性特征，未观测到有临床意义的安全性信号。

这将是一项评价etrolizumab与安慰剂相比在诱导治疗和维持治疗中度至重度活动性CD期间的功效、安全性和耐受性的多中心、III期、双盲、安慰剂对照研究。

研究设计将包括1)确定患者的研究合格性的筛选期(直至28天)，2)诱导期(14周)，随后3)在诱导期结束时显示CDAI-70反应(定义为距CDAI基线评分降低至少70分)的患者中的维持期(60周)，和4)在维持期中施用末剂研究药物后针对不参与本研究标签公开扩展第1部分以接受etrolizumab治疗的那些患者的安全性随访期(12周)(参见图3和图4)。在完成安全性随访期时，将要求患者进入持续92周的扩展PML监测期(标签公开扩展研究)。一个独立数据监测委员会(iDMC)将在进行的(ongoing)基础上监测安全性和研究实施。

在筛选期，将依据产生≥220和≤480之间CDAI评分的临床体征和症状以及依据随机分配之前7天内计算的PRO2评分≥14定义中度至重度活动性CD。综合而言，要求存在活动性炎症(定义为SES-CD评分≥7)或在孤立的回肠炎或回盲肠切除术后情况下≥4，并且将通过中心判读所评定的筛选性回结肠镜检查结果确定这种存在。

研究群体将由尚未接受既往抗TNF疗法(TNF未治疗过)但难治或不耐受皮质类固醇类(CS)和/或免疫抑制剂(IS)疗法的患者以及难治或不耐受抗TNF疗法的患者组成(如下文进一步描述)。合格患者必须在随机分配之前接受稳定的IS至少8周及接受如下文描述的稳定剂量的CS。对于抗TNF治疗无反应(TNF-IR)或难治或不耐受抗TNF治疗的患者必须在其随机分配之前已经停用这种治疗至少12周时间。

来自大约380个全球研究中心的大约1250名患者将随机分配入该研究，通过入选过程进入三个队列之一。入选过程将是依次的，首先进入队列1，随后是队列2，并最后是队列3。

筛选期：

将在28天筛选期中评价患者的合格性(参见图3和图4)。下文说明主要的合规标准。

在筛选期期间，采用CS治疗的患者必须紧邻其随机分配之前已经接受稳定剂量的≤20mg/天泼尼松(或等同物)或≤6mg/天口服布地奈德至少2周。类似地，需要背景IS治疗(例如，6-MP或MTX)的合格患者必须紧邻其随机分配之前接受稳定的IS给药方案至少8周。呈TNF-IR或不耐受抗TNF治疗的患者必须在其随机分配之前已经停用这种治疗至少12周时间。

回结肠镜检查应当在筛选期的第-3周和第-2周之间进行，旨在有足够时间供中心判读员评定及确定合格性并且旨在避免回结肠镜检查法肠道准备过程影响用于确定基线PRO2评分和CDAI评分的患者报告的结果(即，腹痛、总体幸福感和排便频率)。

诱导期

对于14周诱导期，合格的患者将依次入选到三个队列之一(参见图3)。

在队列1中入选(双盲、安慰剂对照、探索性队列；n＝300)的患者将在14周诱导期内第0、第2、第4、第8和第12周按1:2:2比率随机分配以接受安慰剂、etrolizumab 105mg SCQ4W(低剂量)或etrolizumab 210mg SC(高剂量)(注意，随机分配接受低剂量etrolizumab的患者将在第2周接受安慰剂注射-参见下文)。在队列2中入选(etrolizumab剂量-设盲、有效治疗队列；n＝350)的患者将按1:1比率随机分配接受etrolizumab低剂量或高剂量方案。在队列3中入选(双盲、安慰剂对照、关键性队列；n＝600) 的患者将按2:3:3比率随机分配接受安慰剂或etrolizumab低剂量或高剂量。因为低剂量和高剂量的etrolizumab处于不同体积的注射器，为了确保盲态，全部三个队列中的患者将在第0周、第4第8和第12周接受二次注射。随机分配接受低剂量etrolizumab的患者将在每次施用时接受一次安慰剂注射(匹配高剂量预充式注射器)和一次低剂量etrolizumab注射，例外是在第2周，此时他们将接受一次安慰剂注射。随机分配接受高剂量etrolizumab的患者将在每次施用时接受一次安慰剂注射和一次高剂量etrolizumab注射，例外是在第2周，此时他们将接受一次高剂量注射。最后，随机分配接受安慰剂的患者将在每次施用时接受两次安慰剂注射，例外是在第2周，此时他们将接受一次安慰剂注射。

全部队列中的随机分配将依据伴同口服CS治疗(是与否)、伴同IS治疗(是与否)、基线CDAI≤330(是与否)和TNF-IR患者(是与否)分层。将管理入选过程以确保队列3中TNF-IR患者的比例大致不超过75％并且每个队列中CDAI评分在＞450和≤480之间的患者的比例大致不超过10％。

在诱导期期间，全部队列中的患者必须维持其CS治疗和IS治疗的剂量稳定(如果基线时需要CS/IS)。对这些药物的调整将视为救援疗法。救援疗法意指针对新的或加重的CD症状所开具的药物并且包括针对CD的任何新药物或基线CD药物的剂量或方案的任何增加。还，应当尽一切努力保持止泻药处于固定剂量，如果需要的话。尚未在中度至重度活动性CD群体中研究滴定止泻药对PRO2的安慰剂反应率的影响。

在第10周，存在任选的逃离至标签公开扩展(OLE)研究(第1部分)，其中患者可以接受标签公开etrolizumab。仅患者出现疾病加重(定义为第10周CDAI评分和PRO2评分均大于患者基线(第0周)评分)，才可以实施这一点。在第10周，出现病情进展并且尚未进入OLE的患者可以使用救援疗法。

在第14周，在不使用救援疗法情况下实现CDAI-70反应的患者将继续参与维持期。在美国研究中心参与的患者必须在第14周停止IS治疗。在第14周未实现CDAI-70反应和/或在诱导期期间使用救援疗法的患者将认定为非反应者并且将不符合参与维持期的资格。第14周时的非反应者将有进入标签公开扩展(OLE)研究(第1部分)的选择权，

维持期

在诱导期结束时(第14周)，将评估患者的CDAI评分并且患者将接受完整内窥镜检查(回结肠镜检查)，同时进行中心判读以确定SES-CD评分。必须尽一切努力安排在第14周访视或

在诱导期期间接受安慰剂并在第14周在不使用救援疗法的情况下实现CDAI-70反应的患者将在维持期期间接受假性随机分配以接受设盲安慰剂治疗。接受etrolizumab并在第14周在不使用救援疗法的情况下实现CDAI-70反应的患者将按1:1比率随机分配进入维持期以接受安慰剂或etrolizumab 105mg SC Q4W治疗(参见图4)。

维持期随机分配在第16周门诊访视进行，此时将施用首个维持剂量。随机分配通话可以在第14周(诱导期中的最后访视)和第16周之间进行，前提是患者已经评定为符合参与维持期的资格。随机分配将依据第10周和第14周时的CDAI缓解(是与否)、诱导给药方案(低剂量与高剂量)、伴同口服CS治疗(是与否)和既往TNF-IR患者(是与否)分层。

在维持期期间，美国的患者禁止在维持期期间采用任何伴同IS治疗，并且美国以外的患者必须在这项研究期间自始至终保持采用稳定剂量的IS治疗，除非因为药物相关的毒性要求减少剂量或停用。CS剂量将递减，始于第14周。CS剂量将根据以下方案递减：≤20mg/天泼尼松(或等同物)；借助2.5mg/周的剂量减幅滴定直至停用；和≤6mg/天口服布地奈德：借助每2周3mg的剂量减幅滴定直至停用。在无CD症状或类固醇停药症状复发的情况下不能耐受CS递减的患者可以接受CS剂量增加，但是这种增加禁止超过随机分配时施用的剂量。剂量递减方案必须在2周内再启动。

出现临床复发(定义为CDAI评分在2次连续访视(这可以包括计划外访视)时距第14周CDAI评分增加≥100分和CDAI评分≥220分)的患者将有在维持期期间逃离至OLE研究的选择权。

在第74周完成其最后维持期访视的患者可以入选OLE研究(第2部分)，如果合格的话，或进入12周安全性随访期，此后将要求其入选扩展的PML-监测期(OLE研究，第2部分)持续92周。因CD需要手术介入的患者将停止研究疗法，进入安全性随访期，并且将要求其进入OLE研究第2部分供PML监测。从试验自行退出或不符合OLE治疗合规标准的患者也将进入安全性随访期，并且将要求其进入OLE研究第2部分供PML监测。

结局指标

将评价独立的结局指标供FDA(FDA)和欧洲药品管理局(EMA)之用，以及可能供如下文进一步所述的美国以外(ex-U.S.)的其他卫生当局之用。

诱导期的主要疗效结局指标是第14周时的PRO2缓解。PRO2缓解定义为PRO2≤11。

第14周时实现PRO2缓解的患者当中，维持期的主要疗效结局指标是第66周时的PRO2缓解。PRO2缓解定义为PRO2≤11。

诱导期的主要疗效结局指标是第14周时的CDAI缓解。CDAI缓解定义为CDAI<150。

维持期的主要疗效结局指标是在第10周和第14周时实现CDAI缓解的患者当中，至少52周后维持CDAI缓解和自始至终未给予皮质类固醇。

上文描述的美国诱导期和维持期主要疗效结局指标分别是美国以外诱导和维持的次要疗效结局指标。上文描述的美国以外诱导期和维持期主要疗效结局指标分别是美国诱导和维持的次要疗效结局指标。

这项研究的诱导期的附加总体次要疗效结局指标是(1)在第14周内窥镜下改善，其中内窥镜下改善定义为基线SES-CD评分下降50％；(2)在第14周CDAI-100反应，其中CDAI-100反应定义为距CDAI基线评分下降至少100分；(3)在第10周和第14周CDAI缓解，其中CDAI缓解定义为CDAI评分<150；(4)患者报告的HRQOL从基线至第14周的变化，如通过IBDQ(HRQOL＝健康相关的生活质量；IBDQ＝炎性肠病问卷调查)所评估；和(5)CD体征和症状从基线至第14周的变化，如通过CD-PRO/SS指标(CD-PRO/SS＝Crohn病患者报告结果体征和症状)所评估的。

这项研究的维持期的附加总体次要疗效结局指标是(1)在第66周内窥镜下改善(与第0周相比)，其中内窥镜下改善定义为基线SES-CD评分下降50％；(2)第14周时实现CDA缓解的患者当中在第66周CDAI缓解，其中CDAI缓解定义为CDAI评分<150；(3)第14周时实现临床反应的患者当中在第66周CDAI缓解，其中CDAI缓解定义为CDAI评分<150；(4)在第66周CDAI-100反应(与第0周相比)，其中CDAI-100反应定义为距CDAI基线评分下降至少100分；(5)持久CDAI缓解(在以下各周：24、28、32、44、56、66、70和74中≥6周次实现)，其中持久CDAI缓解定义为维持期期间8次CDAI评估访视中至少6次访视时CDAI评分<150；(6)第14周时实现临床反应的患者当中在第66周未给予CS的CDAI缓解，其中未给予CS的CDAI缓解意指不使用皮质类固醇时CDAI缓解(CDAI评分<150)；(7)在第10周和第14周实现CDAI缓解的患者中，在第66周CDAI缓解(CDAI评分<150)和第66周之前24周未给予CS；(8)第14周实现内窥镜下改善和CDAI-70反应的患者当中在第66周维持内窥镜下改善，其中结局指标如上文定义；(9)在第66周粘膜炎症消散(SES-CD评分0)；(10)患者报告的HRQOL从第14周至第66周的变化，如通过IBDQ所评估；和(11)CD体征和症状从第14周至第66周的变化，如通过CD-PRO/SS指标所评估。

这项研究的总体探索性结局指标是(1)从第0周至第14周的粪便钙卫蛋白水平变化；(2)第14周时实现CDAI-70反应的患者当中，从第14周至第66周的粪便钙卫蛋白水平变化；(3)从第0周至第14周的CRP水平变化；(4)第14周时实现CDAI-70反应的患者当中，从第14周至第66周的CRP水平变化；和(5)第14周时实现CDAI-70反应的患者当中，从第14周的ime至重大CD相关事件(包括住院、肠手术和非研究程序)。

这项研究的安全性结局指标是：不良事件的发生率和严重程度、严重不良事件的发生率、感染相关不良事件的发生率和严重程度、感染相关的严重不良事件的发生率、注射部位反应的发生率和严重程度、超敏反应的发生率和严重程度、导致停用研究药物的不良事件的发生率、特定实验室异常的发生率、恶性肿瘤发生率和etrolizumab的抗治疗性抗体(ATA)的发生率。

这项研究的药代动力学结局指标是：在第14周和第66周的etrolizumab血清浓度和从第16周至第66周在给药时间期间指定的时间点处观测的给药前波谷血清浓度C

研究群体；患者

目标群体是患有中度至重度活动性CD(如下文定义)并且对皮质类固醇类和/或免疫抑制剂治疗和/或抗TNF类具有不充分反应、难治性反应或不耐受的患者。中度至重度活动性CD意指在筛选期中通过符合以下三个体征和症状指标中每一者而确定的中度至重度活动性疾病：

1.导致随机分配之前7天内计算的CDAI评分≥220至≤480的临床体征和症状；和

2.随机分配之前7天内计算的PRO2评分≥14；和

3.在孤立的回肠炎或回盲肠切除术后情况下，如通过中心判读员所评定的筛选性回结肠镜检查结果确定存在活动性炎症(定义为SES-CD评分≥7或≥4)。

患者必须符合以下进入研究标准：(1)能够并且愿意提供书面知情同意书；(2)18-80岁；(3)男性和非绝经后女性：在治疗期期间和末剂研究药物后至少24周使用有效避孕措施；(4)基于筛选访视前≥3个月建立的临床证据和内窥镜证据，诊断患有CD；(5)在筛选期确定的如上文定义的中度至重度活动性疾病；(6)涉及回肠和/或结肠，具有儿科内窥镜可穿过的至少四个结肠段或对于已经因CD而接受肠切除术的患者，三个肠段(结肠和/或回肠)；(7)如果筛选前结肠疾病的持续时间＞10年，则在筛选之前≤12个月完成监护结肠镜检查，或如果患者具有任何肠癌风险因素(可以在筛选期间进行监测)，则在筛选之前≤5年完成监护结肠镜检查；(8)从筛选起5年内已经对以下至少一种疗法出现不耐受、难治性疾病或无反应(如下文定义)：

将从研究进入过程排除符合任何以下标准的患者。与胃肠道健康相关的排除标准包括：(1)接受过结肠次全切除术伴回肠直肠吻合或接受过全结肠切除术；(2)短肠综合征；(3)接受了回肠造口术或结肠造口术；(4)具有瘘管病和/或固定狭窄或小肠狭窄迹象伴排除肠适当内窥镜评估的狭窄前扩张；(5)诊断患有UC或未定型结肠炎；(6)怀疑有缺血性结肠炎、放射性结肠炎或显微镜下结肠炎；(7)腹部或肛周脓肿迹象；(8)预计需要手术以管理研究期间的CD相关并发症；(9)过往或当下腺瘤结肠息肉；(10)疾病相关的过往或当下结肠粘膜异型增生(dysplasia)(年龄相关的既往息肉可接受)。

与既往或伴同疗法相关的排除标准包括：(1)在随机分配之前≤12周内因CD接受阿达木单抗、聚乙二醇培舍珠单抗或英夫单抗中任一者；(2)任何既往的etrolizumab或其他抗整联蛋白药(包括维多珠单抗、那他珠单抗和依法珠单抗)治疗；(3)在随机分配之前≤12个月内经T细胞-或B细胞-耗尽药(例如，利妥昔单抗、阿伦珠单抗(alemtuzumab)或维西珠单抗(visilizumab))既往治疗；(4)在本研究中随机分配之前12周或研究用产品的五个半衰期(以较长者为准)内接受任何研究性治疗(包括研究性疫苗)；(5)对嵌合抗体、人抗体或人源化抗体、融合蛋白或鼠蛋白的中度或重度变态反应史或过敏性/类过敏反应史或对etrolizumab(活性原料药)或任何赋形剂的超敏反应史；(6)随机分配之前≤2周经皮质类固醇灌肠剂/栓剂和/或局部用(直肠)5-氨基水杨酸酯(5-ASA)制剂治疗；(7)随机分配之前≥3周尚未停止管饲、限定膳食和/或肠胃外营养/营养作为CD治疗的患者；(8)预计研究期间需要管饲、限定膳食和/或肠胃外营养/营养作为CD治疗的患者；(9)随机分配之前≤4周接受任何活细胞或减毒疫苗；(10)筛选期间使用IV类固醇，例外在急诊科施用的单剂IV类固醇；(11)随机分配之前≤4周使用环孢菌素、他克莫司、西罗莫司(sirolimus)或吗替麦考酚酯；(12)长期使用非甾体类抗炎药(NSAID)。允许预防性使用阿司匹林直至325mg/天，也允许将NSAID偶尔用于诸如头痛、关节炎、肌痛和痛经的病状；(13)如果接受口服CS，除非紧邻随机分配之前剂量稳定在/＝2周，否则将排除患者；(14)如果接受持续的口服或直肠5-氨基水杨酸酯(5-ASA)治疗，若紧邻随机分配之前剂量未稳定>/＝4周，则将排除患者；(15)如果接受持续的ISS治疗，若紧邻随机分配之前剂量未稳定>/＝8周，则将排除患者；(16)如果接受持续的抗生素治疗以治疗CD，若紧邻随机分配之前剂量未稳定>/＝2周，则将排除患者。

与感染风险相关的排除标准包括：(1)先天性或获得性免疫缺陷；(2)通过蛋白质印迹法证实的HIV阳性ELISA检验结果；(3)阳性丙型肝炎病毒(HCV)抗体检验结果，除非已经记录到患者在成功完成HCV抗病毒治疗过程后HCV RNA不可检出＞6个月；(4)在筛选性乙型肝炎评估中，从本研究排除HBsAg检验阳性的患者；乙型肝炎核心抗体(HBcAb)检验阳性、但乙型肝炎表面抗原(HBsAg)阴性的患者必须具有确认的阴性乙型肝炎病毒(HBV)DNA检验结果以便符合研究资格并且将要求其在研究期间接受HBV DNA定期监测；(5)在筛选时，虫卵或寄生虫粪便检验结果阳性或病原体的粪便培养物阳性；(6)基线访视前8周内艰难梭菌感染迹象和/或针对艰难梭菌治疗或针对艰难梭菌感染的其他肠道病原体治疗；(7)活动性或潜伏性结核病史或在随机分配3个月内拍摄的胸片上疑似活动性结核病；(8)复发性机会性感染史和/或重度或弥散病毒性感染史；(9)在筛选之前

与总体安全性相关的排除标准包括：(1)怀孕或泌乳；(2)缺少外周静脉通路；(3)在随机分配之前8周内住院；(4)按照研究者的观点，不能遵守研究方案；(5)明显的未控制的共病、如神经学系统、心脏、肺、肾、肝、内分泌或GI疾病(除CD之外)；(6)可能干扰监测PML的神经系统病状或疾病；(7)筛选性神经系统检查时有临床意义的异常；(8)脱髓鞘病史；(9)重大神经系统疾病(包括卒中、MS、脑肿瘤、神经变性病或控制不良的癫痫)史；(10)在筛选之前≤6个月的酒精、药物或化学品滥用史；(11)在研究过程期间可能需要用＞20mg/天泼尼松(或等同物)治疗的除CD之外的病状；(12)筛选前5年内癌症史，包括血液学恶性病、实体瘤和原位癌；(13)在先前年份内或在筛选时尚未取得宫颈涂片的女性患者；(14)器官移植或细胞移植史；(15)因体内存在可能在任何潜在扫描期间带来危害的金属而认为对其进行磁共振成像(MRI)扫描不安全的患者。

材料和方法

Etrolizumab将作为一次性使用的PFS供应，所述PFS含有150mg/mL etrolizumab供皮下(SC)施用。取决于诱导期中的剂量分配情况，根据治疗方案，患者接受在1mL含有0.7mL etrolizumab(105mg剂量)的PFS中或2.25mL含有1.4mL etrolizumab(210mg剂量)的PFS中的研究药物。为了保护诱导期中研究药物分配的盲态，在第0、第4、第8和第12周，全部患者均接受二次注射：一次0.7mL剂量和第二次1.4mL剂量，并且任一次注射(如果在研究药物组之一中)或两次注射(如果在安慰剂组中)将含有安慰剂。在第2周，全部患者均将接受一次1.4mL剂量注射，对于低剂量etrolizumab组和安慰剂组中的患者，所述注射将含有安慰剂，并且对于高剂量etrolizumab组中的患者，将含有研究药物。在维持期，根据治疗方案，患者接受将含有etrolizumab或安慰剂的单个0.7mL剂量(105mg剂量)。

对于安慰剂，组成与不存在etrolizumab的有效药品的组成完全相同。

对于每位患者，将收集详细CD史，包括诊断日期、疾病严重程度、住院和筛选时的肠外临床表现。将使用如上文所述的CDAI、PRO2和SES-CD评价疾病严重程度。下表1中提供CDAI的附加详情并且下文在表2中提供SES-CD的附加详情。PRO2的附加详情如下。

如前及Khanna等人,Aliment Pharmacol Ther 41:77-86,2015中所述，PRO2评价了两项患者报告因素：液状粪或软粪便频率和腹痛。通过取得在7天时间内测量的平均频率和平均疼痛评分，将每个平均评分乘以指定的权重(相同的权重用于CDAI评分[参见下表1])并将加权的平均数加在一起)，计算PRO2评分。上文的Khanna等人鉴定评分中每种成分的临界值，所述临界值产生与临床缓解的最灵敏和最特异相关性，基准为CDAI评分<150。Khanna等人确定的最佳临界值是平均每日排便频率<1.5、腹痛≤1。基于Gasink等人[摘要]ACG Annual Meeting 2014中公开的结果，我们已经确定了不同于上文Khanna等人的平均每日排便频率临界值，临界值<3代表中度-重度CD群体中液状粪/软粪便的临床缓解(与上文Khanna等人中确定的≤1.5相比)。腹痛临界值是≤1。因此，依据PRO2评分确定的缓解是≤11(排便频率3x CDAI倍增因数2＝6+[腹痛≤1x CDAI倍增因数5]≤5；总和二项评分得到≤11)。我们认为，这项研究是在前瞻性研究中首次使用基于这些临界值的这种特定PRO2评分确定缓解。

表1.Crohn病活动指数(CDAI)

a如果血细胞比容小计<0，输入0。

b如果体重小计<-10，输入-10.

改编自：Best WR,Becktel JM,Singleton JW,Kem F,Jr.Development of aCrohn’s disease activity index.National Cooperative Crohn’s DiseaseStudy.Gastroenterology 1976；70(3):43SM4

表2.SES-CD的定义(Daperno等人,Gastrointest.Endosco.60:505,2004)

本研究设计成响应于这些机构单独推荐CD中适宜的治疗性主要结局指标，生成独立的EMA和FDA主要终点的数据(GREAT2 Workshop 2013October 21

使用多变量回归分析开发CDAI，以产生最佳预测出医师对患者的总体CD严重程度评定的方程(Best WR等人,Gastroenterology 77:843-6,1979)。历经25年时间在多个临床试验期间前瞻性实施仪器验证(就结构和内容正确性而言)，而CDAI以可复现方式表现并且响应于变化。已经始终如一地基于确定缓解的CDAI评分＜150评价适用与治疗中度至重度CD的全部注册生物疗法的治功功效。然而，已经出现如下方面的顾虑：CDAI标准效度低劣、据报道在炎症的CDAI指标和内窥镜下指标之间缺少相关性(这可能使得CDAI作为活动性CD和肠激惹综合征的不良判别物)和安慰剂报告率高(Korzenik等人,N Engl J Med.352:2193-201,2005；Sandborn WJ,等人,N Engl J Med 353:1912-25,2005；Sandborn WJ,等人,Ann Intern 19；146:829-38,2007,Epub 2007Apr 30；Kim等人,Gastroenterology146:(5supplement 1)S-368,2014)。为了解除这些顾虑，借助内窥镜评估，本研究设计针对具有活动性炎症的患者完善。与FDA推荐一致，CDAI将结合作为医学辅助措施供患者始终如一捕获粪便形式的布里斯托大便分类法一起使用(Lewis等人,Scandinavian Journal ofGastroenterology Vol 32(9):920-924,1997)(图5)。在一项为了评估执行CDAI的方法学变异所实施的调查中，将这报道为缺少共识的特定领域(Sands等人,Inflammatory BowelDisease 11:133-8,2005)。

与开发CD治疗用新医药产品的EMA指南相符，美国以外分析的主要研究目标是评价etrolizumab与安慰剂相比在维持期开始时处于消退状态的患者当中不给予CS的情况下维持CDAI缓解1年(52周)的功效。基于诱导期中第10周和第14周CDAI评分＜150，这项分析中纳入的患者将已经确认为处于缓解状态。先前尚未研究至少52周后维持CDAI缓解和自始至终未给予CS的结局，但鉴于长期使用CS与严重副作用如增重、白内障、高血糖症、骨质疏松症和感染风险升高相关，这是一项有临床意义的成功治疗指标。亚组分析将在基线时需要CS的患者组中评估这个结局。维持CDAI缓解52周和前24周未给予CS将被评定为继发性结局。

PRO2是评价溏便/液状粪频率和腹痛的PRO指标(Khanna等人,AlimentPharmacol.Ther.41:77-86,2015)。这些项因此从CDAI导出和加权并且连同总体幸福感一并是CDAI日记卡项，所述日记卡项最有助于依据CDAI测量的观测的临床获益(Sandler等人,J.Clin.Epidemiol 41:451-8,1988；Thia等人,Inflamm Bowel Dis 17:105-11,2011；Kim等人,Gastroenterology 146:(5supplement 1)S-368,2014)。≤11的缓解评分是7天时间中平均排便频率和疼痛评分的CDAI加权总和，该总和在II期CERTIFI研究的优特克单抗诱导治疗中度至重度CD的回顾性数据分析中产生最佳灵敏度和特异性供确定CDAI缓解(评分＜150)(Gasink等人,[摘要]ACG Annual Meeting 2014)。显示在依据CDAI测量的活动性CD中作为MTX治疗回顾性数据分析的连续结局指标使用时，PRO2灵敏和有反应性(Khanna等人,Aliment Pharmacol.Ther.41:77-86,2015)；当评分中并入总体幸福感时，治疗作用的估计值未改善。

PRO2的用途利用与CDAI缓解相关的溏便/液状粪频率和腹痛的7天评分。此外，作为复合评分，PRO2能够跨近端至远端疾病表现谱测量临床缓解，而溏便/液状粪和腹痛可以在其症状贡献作用方面不同。腹痛4分顺序量表的使用允许直接从CDAI推算这个评分并且避免一项研究方案中各异疼痛评分的内在复杂性。

内窥镜下改善，定义为SES-CD评分距基线评分的变化≥50％(Ferrante M等人,Gastroenterology 145:978-86,2013)，是关键次要终点。SES-CD由五个回结肠肠段中所评定的四个内窥镜下变量(溃疡、溃疡化表面、发炎表面和狭窄的存在)组成。SES-CD由Daperno等人,Gastrointest.Endosc.60(4):505-12,2004前瞻性开发并且在(根据CDAI)轻度至重度CD患者中验证。这个评定体系由FDA推荐并且通常相对于其他指标为医师优选，原因是对溃疡大小定量(而非定性评估溃疡特征)、测定肠段中的溃疡百分数(而非依据直观模拟标度尺测定)和更好的评分者间信度(对于SES-CD和Crohn病内窥镜严重程度指数，组间相关系数分别是0.83和0.71；Khanna等人,Aliment Pharmacol.Ther.41:77-86,2015)。因为该评分不修正可视肠段数目，所以仅基线时可见到的肠段将纳入终点评估结果中。这意味，因炎症所致的使得研究治疗后不可评价肠段评分的任何新狭窄将把患者限定为未实现用于次要终点分析的内窥镜下改善。类似地，研究疗法后使得可评价肠段评分的任何炎症改善将不反映于终点评估结果中。统计分析计划将描述规划成评估这些缺失数据对终点影响的任何灵敏度分析。鉴于一般胃肠病学实践中内窥镜评分系统的经验有限，将在研究中心记录本研究中的全部回结肠镜检查，但是中心判读员将确定SES-CD评分。

公开的研究已经使用多项内窥镜终点评估功效，这些终点似乎是任意定义的。已经将粘膜愈合(定性地定义为不存在粘膜溃疡)在多项IV期研究中作为主要终点或次要终点研究(Rutgeerts P等人,Gastro 126:1593-610,2004[那他珠单抗]；Rutgeerts P等人,Gastrointest Endosc 63:433-42,2006[英夫单抗]；Colombel JF,Sandborn WJ,ReinischW等人,Infliximab,azathioprine,or combination therapy for Crohn’s disease,NEngl J Med 362:1383-95,2010[英夫单抗和硫唑嘌呤]；Hebuterne等人,Gut 62:201-8,2013[培舍珠单抗]；Rutgeerts P等人,Gastroenterology 142(5):1047-9,2012[阿达木单抗])。一些研究已经确定了代表内窥镜下缓解的内窥镜阈值，而未澄清这些评分的临床意义(Hebuterne等人,上文[培舍珠单抗]；Rutgeerts等人，上文2012[阿达木单抗])。在这项研究中，内窥镜下改善定义为显示SES-CD评分相对于其治疗前基线评分降低≥50％的患者比例。在第14周时实现临床反应的患者当中，对于诱导，将在第14周测量这个终点，并且对于维持，将在第66周测量这个终点。该终点基于SONIC试验的最新事后分析，所述试验确定SES-CD评分降低≥50％预示生物治疗药治疗50周后未给予CS情况下的CDAI缓解(Ferrante,上文,2013)。当考虑到6周诱导期结束时在24名给予安慰剂的正参与二项新生物药剂试验之一的患者(患有中度至重度活动性CD)的样品中测量的SES-CD评分变化存在巨大变异性时，这个定义也是适宜的(Ferrante等人,Gastroenterology 138,第5期,增刊1,S-358,2010)时。数据集显示，6名患者实现SES-CD评分或CDEIS评分降低50％，和CDEIS评分或SES-CD评分降低至少5分。

患有未控制的中度至重度活动性CD的患者面临形成狭窄性或穿透性炎症并发症以及削弱生活质量之症状的风险。CD的治疗目标是引起并维持症状改善、引起粘膜愈合和改善生活质量。但是，对显著比例的患者而言，通过当前疗法并未达到这些目标。从而，研究群体将包括采用常规疗法(IS和/或CS)或抗TNF抑制剂时尚未实现或维持临床缓解的患者。来自溃疡性结肠炎中先前etrolizumab研究(Rutgeerts,PJ等人,Gut 62:1122-1130,2013；Vermeire等人,Lancet 384:309-18,2014)和维多珠单抗GEMINI 2和3研究(Sandborn WJ,等人,Aliment Pharmacol Ther 37:204-13,2013；Sands BE,等人,Gastroenterology147:618-27,2014)的数据已经在这些患者亚组中展示了抗α4β7作用机制的有利功效。将基于本文所述的难治性和不充分反应标准鉴定属于每个亚组的患者。

将研究年龄在18岁和80岁之间的中度至重度活动性CD患者。这个年龄范围是在CD的新研究药物临床试验中入选的患者常见的并且反映以下观察结果：成人CD可以在任何年龄变为中度至重度活动性疾病或作为中度至重度活动性疾病持续存在。鉴于etrolizumab的主要清除机制既非肾消除，亦非首过代谢，认为在＞65岁的患者中蓄积的风险低并且还通过与不良肾肝功能相关的实验室排除缓解该风险。

与EMA指南相符，合格的患者必须具有确立的CD诊断至少3个月，伴有依据炎症的内窥镜证据确证的中度至重度活动性疾病。这将允许改善CDAI评估和PRO2评估的特异性并且还允许评价内窥镜下改善终点。基于SES-CD评分的构造，可以预计与回结肠疾病患者相比，具有孤立回肠炎的患者或回盲肠切除术后的患者具有较低的基线评分，无论受累肠段中炎症和溃疡的范围是否相同。从而，针对这些亚组的患者拟定不同的SES-CD条目评分。

与EMA指南一致，随机分配进入诱导期将依据疾病活动度，基于CDAI评分≤330或＞330(预示生物治疗时CDAI反应率和缓解率；Sandborn WJ等人,Aliment Pharmacol Ther37:204-13,2013；Sands BE等人,Gastroenterology 147:618-27,2014)、CS使用情况、IS使用情况和既往抗TNF失效(疾病活动度的全部指标)分层。认为这些因素足以缓和各治疗组之间疾病严重程度不平衡的风险。

基于如下观察：抗整联蛋白疗法与抗TNF疗法相比起效较慢(Sandborn WJ等人,NEngl J Med 353:1912-25,2005；Sandborn WJ等人,Aliment Pharmacol Ther 37:204-13,2013)以及如下临床共识：一般在诱导治疗后16-24周观察到内窥镜下改善启动、尤其在治疗难治性患者时如此(一项得到观测数据支持的共识，所述观测数据显示在患有UC的TNF-IR患者中采用etrolizumab时梅奥诊所评分缓解开始出现至14周(参见Vermeire等人,Lancet 384:309-18,2014))，在第14周评估临床缓解和内窥镜下改善的诱导是合理的。14周诱导期的挑战是需要保持伴同CD疗法在持续阶段稳定，从而不致使终点分析混淆。在患者需要救援疗法以治疗骤起(flare)和患者对治疗有反应但不能逐渐减小其CS剂量的背景下，这是棘手的。通过允许在疾病加重情况下使用救援疗法(在这种情况下患者将划归为非反应者供初步分析)和限制最大基线CS至≤20mg/天泼尼松等同剂量，本研究设计解决了这个问题。尽管不禁止治疗性调整，应当避免增加抗腹泻药物剂量。患者应当尽可能保持其止泻药剂量稳定。与CDAI的安慰剂反应率相比，使用止泻药似乎并未产生PRO2的高得不相称的安慰剂反应率。在一项采用来自轻度至中度活动性CD中MTX随机对照试验的回顾性数据的PRO2灵敏度分析中，观察到这个结果，当通过PRO2或CDAI测量时，所述灵敏度分析检出相似的MTX反应率和安慰剂反应率(Khanna等人,Aliment Pharmacol.Ther.41:77-86,2015)。然而，在中度至重度活动性群体中，未知滴定止泻药对PRO2的安慰剂反应率的影响。

尽管PRO2缓解和内窥镜下改善并入FDA的方案以确定CD的新治疗性结局指标，但CDAI是CD的前瞻性验证的唯一终点。出于这个原因以及关键性诱导队列(队列3)，诱导期纳入一个适度确定大小的探索性队列(队列1)以评估针对所述新终点的统计规划假设的效果大小和准确度、二分终点定义的临床正确性和检验终点的层次。这项研究中还纳入有效治疗诱导队列(队列2)以产生每组大约160名临床缓解者，以便有统计把握地评估缓解状态的维持。最末队列(队列3)是一个关键性诱导队列，该队列将产生数据供诱导研究的终点分析。

根据EMA指导原则，将通过一个次要终点确认诱导期中缓解的维持，所述次要终点评估在第10周和第14周均处于CDAI缓解的患者的比例。在不使用救援疗法的情况下实现第14周时CDAI-70反应的患者将随机分配进入维持期。假设实现PRO2缓解和内窥镜下改善的患者属于这个组内的某个亚群。将利用疾病活动度(如对诱导期的疾病活动度描述，例外是将使用在第10周和第14周的CDAI缓解(评分＜150)替代CDAI≤330或＞330)对随机分配进入维持期的分层。此外，随机分配过程将依据低剂量或高剂量etrolizumab分配过程(允许评估低剂量或高剂量诱导治疗对维持终点的影响)而分层。鉴于层数大，将使用第66周内窥镜改善终点的协变量修正分析，处置第14周时内窥镜下改善者比例的任何潜在不平衡。

维持期的持续时间(60周)由FDA和EMA认定为适宜的时间，以确立临床缓解的维持。在维持期的前8周期间，诱导期期间接受CS的患者将接受与现行美国胃肠病学会指南和欧洲Crohn病和结肠炎组织指南中的CS递减建议相符并且遵循EMA建议的每周剂量减少，以避免迅速递减。递减方案将允许在第10周和第14周时实现CDAI缓解的患者当中评估患者的美国以外主要指标：至少52周后维持CDAI缓解和自始至终未给予CS。

因为已经在II期研究的中度至重度活动性UC患者中评价etrolizumab(Vermeire等人,Lancet 384:309-18,2014)，在所述研究中，在无明显安全顾虑的情况下在每四周(Q4W)施用的105mg(标称剂量0.7mL 150mg/mL etrolizumab制剂)(在第0周、第4周和第8周三剂)和315mg Q4W+负荷剂量(LD[LD在第0周为420mg，在第2周、第4周和第8周为315mg])实现有临床意义的病情缓解诱导过程，所以还提议该etrolizumab给药方案(105mg SC Q4W)作为本项研究中待检验的剂量之一。此外，在诱导期，患者将随机分配接受安慰剂、低剂量etrolizumab或高剂量etrolizumab。

低剂量etrolizumab(105mg)将Q4W SC(第0周、第4周、第8周和第12周)施用。基于以下考虑，指定按Q4W 105mg SC的低剂量方案用于诱导期中的剂量范围确定：(1)在II期UC试验中，Q4W SC施用的标称剂量100mg(借助小瓶和注射器的0.7mL 150mg/mL溶液)(实际剂量105mg)在UC患者中显示有临床意义的缓解诱导并且在II期试验中具备有利的安全性特征(Vermeire等人,Lancet 384:309-18,2014)；(2)显示Q4W SC施用的105mg暴露量足以在源于全部患者的血液和结肠组织中产生最大β7-受体占据，所述全部患者在同一II期试验中提供可评价样品，(3)群体PK/PD建模预测，低于105mg SC Q4W方案的剂量(例如，50mgQ4W SC)将在Q4W给药间隔期间导致大约44％患者丧失最大β7-受体占据，并且暴露可能处于非线性PK范围内。

除105mg Q4W剂量之外，基于以下考虑，指定在第0周、第2周、第4周、第8周和12周是210mg SC的更高剂量方案用于诱导期中的剂量范围确定：(1)尽管发病机制相似性，但是与UC比较时，CD在整个胃肠道显示更复杂的疾病解剖学表现(即，透壁性炎症、零散分布和狭窄)。最近在CD患者中III期临床试验的诱导期后报道了维多珠单抗(同类最佳的抗整联蛋白抗体)的积极暴露-反应关系。结果显示，诱导剂量足以在全部患者中实现全面受体占据(Rosario M等人,(摘要)Crohn’s and Colitis Foundation of America,Advances inInflammatory Bowel Diseases,摘要P-140,2013)，然而，在药物浓度更高的患者中观察到临床反应/缓解增加(Sandborn WJ等人,Aliment Pharmacol Ther 37:204-13,2013；Rosario M等人,(摘要),European Crohn’s and Colitis Organisation Congress,摘要P489,2014)。这些来自维多珠单抗研究的观察结果表明，更高的etrolizumab暴露量可能在这个患者群体中具有提供更多临床获益的潜力；(2)除Q4W 210mg剂量之外，在第2周的额外210 mg剂量意在事先加载etrolizumab暴露量，以允许暴露更快实现稳态。发现较早负荷剂量的抗TNF剂或抗整联蛋白抗体(Rutgeerts P等人,Gastro 126:1593-610,2004)有效诱导临床缓解，并且本项研究中也实施这种负荷剂量策略；(3)CD患者中拟议的更高剂量210mg×5剂SC(在第0周、第2周、第4周、第8周和12周)将导致2.5倍来自105mg Q4W×4给药方案的总剂量隔离并且预测其获得低于在具有可接受的安全性/耐受性特征的UC II期试验中来自315mg+420mg LD队列研究实现的暴露水平的30％(参见上文)。总之，鉴于etrolizumabUC II期研究的标称剂量100mg Q4W队列(实际剂量105mg)中观察到有利的安全性特征和积极的临床结局，评价CD诱导治疗的105mg Q4W剂量是适宜的。此外，鉴于CD的病理生理学复杂、尽管血液中受体完全饱和，但观察到维多珠单抗治疗的积极暴露-功效关系、etrolizumab的可用安全性覆盖率和可接受安全性特征，科学上合理的是，评价210mg(第0周、第2周、第4周、第8周和12周)的更高剂量方案以进一步理解诱导期期间CD患者中的剂量-反应关系。

在诱导期中响应于etrolizumab治疗(实现距CDAI基线评分下降至少70分，“CDAI-70反应”)的患者将在维持期再随机分配接受105mg etrolizumab或安慰剂Q4W；在诱导期响应于安慰剂的患者将在维持期续接受安慰剂。在维持期基于以下考虑指定按Q4W 105mg SC的低剂量方案：(1)(通过群体建模)预计，针对CD中III期研究计划的105mg Q4W SC剂量在＞85％的患者中总是均维持完全的β7-受体占据。UC II期研究中施用的标称剂量100mgQ4W SC(105mg实际剂量)展示可接受的安全性特征(参见上文)；(2)采用提供足以维持最大受体占据的平均稳态波谷血清浓度的每8周方案情况下，同类最佳的抗整联蛋白维多珠单抗成功维持缓解(Rosario M等人,(摘要)Crohn’s and Colitis Foundation of America,Advances in Inflammatory Bowel Diseases,摘要P-140,2013；Sandborn WJ等人.,Aliment Pharmacol Ther 37:204-13,2013)。

将采集PRO(IBDQ、CD-PRO/SS、EQ-5D、PRO2和CDAI的溏便频率、腹痛与总体幸福感成分)以辅助表征etrolizumab的患者报告临床特征。法律文件将按要求翻译成本地语言。使用电子PRO(ePRO)装置(即，电子日记和平板电脑)，以电子方式采集PRO数据。研究人员将为患者提供电子日记和说明书以按照电子方式完成需要在门诊部外部完成的那些PRO的PRO问卷调查。也将嘱咐患者如果在筛选期间或在研究期间任何时间对使用电子日记存有任何问题，迅速联系研究中心。例如，当PRO将在在门诊部完成时，患者将在平板电脑上填妥它们。在每次门诊访视时审查患者自先前研究访视患者以来所采集的电子数据。在访视时采集并评估ePRO数据。在筛选期间，将教授患者如何适当使用电子日记并完成其上的问题。必须在这项研究期间自始至终(包括筛选期)每天记录CD的体征和症状，尤其液状粪或软粪便次数、腹痛和总体幸福感。为了确保仪器正确性及数据标准符合卫生当局要求，在研究中心完成的PRO(IBDQ和EQ-5D)必须在研究中心在完成其他非PRO评估之前和在这个访视期间患者收到任何疾病状态信息或研究药物之前执行。

如上文讨论，CDAI对CD患者的体征和症状定量(表1)。CDAI由八个因数组成；每个因数用加权因子修正后加总(表1)。CDAI的成分包括液状或软粪便次数、腹痛、总体幸福感、存在并发症、因腹泻使用Lomitil或其他阿片剂、存在腹部肿块、血细胞比容和距标准权重的偏差百分数。患者将要在电子日记上以每日为基础报告其腹痛严重程度、溏便频率、和总体幸福感。向患者提供布里斯托大便分类法作为确定溏便的参考(图5)。因为回结肠镜检查准备过程可能干扰对其他临床参数的评估，用来计算完整CDAI的电子日记项不应当对应于肠道准备日期、内窥镜检查日期或内窥镜检查后日期。

如上文讨论，PRO2评价了两项患者报告的因素：液状粪或软粪便频率和腹痛。使用7天时间中平均频率评分和平均疼痛评分的CDAI加权总和，计算评分。患者将要在电子日记上以每日为基础报告其溏便频率(将提供布里斯托大便分类法[图5])和腹痛严重程度。与CDAI一样，PRO2评分不应当使用对应于肠道准备日期、内窥镜检查日期或内窥镜检查后日期的电子日记项，以避免与回结肠镜检查相关的干扰。

CD-PRO/SS指标将会用来评估患者报告的CD体征和症状。14项问卷调查(一些问题含有关于严重程度/频率的补充性提问)含有二个领域：CD体征和症状及全身症状。CD-PRO/SS评估CD体征和症状的存在，并且在一些情况下，评估症状的严重程度或频率。CD-PRO/SS指标具有24小时召回规范。在整个研究期间，患者在第0周伊始和此后每次门诊访视或电话访视之前连续9天在电子日记上完成CD-PRO/SS。

IBDQ评估患者的健康相关生活质量(HRQOL；Guyatt G等人,JClin Epidemiol 42(5):403-408,1989；Irvine EJ,J Pediatr Gastroenterol Nutr 28:S23–7,1999)。32项卷调查含有四个领域：肠症状(10项)、全身症状(五项)、情绪职能(12项)和社交职能(五项)。依据7分Likert量表评定各项，较高评分表示较好的HRQOL。IBDQ具有2周召回规范。患者在研究中心在平板电脑上，在基线时、在第0周、第14、第44周和第74周完成其他非PRO评估之前和这个访视期间患者收到任何疾病状态信息或研究药物之前完成IBDQ。

EuroQol五维问卷调查(EQ-5D)是基于类属偏好性的HRQOL，其提供健康状态的单一指标值(Rabin R等人,Enn Med 33:337-43,2001)。这个工具包括用来确立患者复合健康状态的关于活动性、自理、日常活动、疼痛/不适和焦虑/抑郁的提问。患者在研究中心在平板电脑上，在第0周、第14、第44周和第74周(或提前退出访视)完成其他非PRO评估之前和这个访视期间患者收到任何疾病状态信息或研究药物之前完成EQ-5D。

对于诱导期，总计大约1250名患者将随机分配进入三个诱导队列之一。表3中总结及下文描述了每个队列的样本量。

表3.每个队列的诱导期样本量。

NA＝不适用

队列1的样本量(参见表3)提供了大约90％把握度在每个etrolizumab组和安慰剂组之间的PRO2缓解率(remission rate)或CDAI缓解率方面检出≥20％差异(在安慰剂缓解率≤15％的假设下，类似于CD患者的维多珠单抗GEMINI2试验中报道的结果；Sandborn WJ,等人,Aliment Pharmacol Ther 37:204-13,2013)并提供大约80％把握度在内窥镜反应方面相对于安慰剂检出15％差异(在安慰剂反应率≤10％的假设下)和按0.1显著性水平双侧卡方检验。

期望队列3的样本量在安慰剂缓解率≤15％的假设下和按0.025显著性水平双侧χ

此外，这些样本量也将提供≥90％的把握度在安慰剂反应率≤10％的假设下和按0.025显著性水平双侧卡方检验相对于安慰剂，检出关键次要终点(内窥镜下改善)的15％差异。在第14周时安慰剂反应率是10％的假设，相对于安慰剂，检出≥15％差异的把握度(10％与25％)按0.025显著性水平估计是93％(参见表4)。

确定队列2的大小以提供足够患者供维持期分析。如果需要，额外的患者可以随机分配进入队列2，以实现全部诱导队列(1、2和3)之间第14周时PRO2缓解方面大约326名患者的目标人数。

表4.关键性诱导期和维持期中主要和关键次要功效分析的把握度评估。

CDAI＝Crohn病活动指数；PRO2＝患者报告结果-2评分。

对于维持期，维持期的主要终点是在第14周处于PRO2缓解的患者当中，第66周时PRO2缓解(仅FDA)，和在第10周和第14周均实现CDAI缓解的患者当中，未用类固醇至少52周的同时，至少52周维持治疗后未给予CS的情况下CDAI缓解。假定在第14周缓解者当中安慰剂PRO2第66周缓解率为至多30％，则按0.05显著性水平使用双侧卡方检验，总计大约326名第14周时处于PRO2缓解的etrolizumab患者将提供≥80％的把握度检出15％治疗差异。如果第14周时的PRO2缓解率是至少31％，则将用计划的etrolizumab诱导患者人数1040实现这个样本量。假定与CDAI缓解相比缓解率相似或更高，预计第14周时的PRO2缓解率将是至少30％。

假定未给予CS的情况下CDAI缓解维持主要终点的安慰剂缓解率为≤10％，则按0.05显著性水平使用双侧卡方检验，总计大约200名在第10周和第14周处于CDAI缓解的患者将提供≥80％的把握度检出15％治疗差异。假定采用etrolizumab的第10周和第14周时CDAI缓解率是至少20％，则预计用计划的etrolizumab诱导患者人数(n＝1040)实现这个样本量。

在至少50％在诱导期经etrolizumab治疗的患者(队列1、2和3)在第14周实现CDAI-70反应的假设下，总计大约520名患者(每组大约260名)将再随机分配进入关键性维持队列。这个样本量也将提供95％的把握度按0.05显著性水平检出继发性内窥镜下改善相对于安慰剂的≥15％差异(参见表4)。

出于统计分析目的，诱导期和维持期将作为独立的研究处理。在特定时间因缺失数据而无法评估功效的患者将视为全部分类性终点的非反应者。此外，将这样的患者视为该分析的非反应者，所述患者需要允许的救援药物，和/或没有在因CD加重所致任何CS增加和/或手术介入CD的2周内再启用类固醇递减方案，和/或服用禁用药物(例如，抗整联蛋白抗体、T细胞或B细胞耗尽剂、TNF拮抗剂、抗代谢药、环孢菌素、他克莫司和第14周后免疫抑制剂药物如AZA、6-MP和MTX)。将对主要疗效终点和关键次要疗效终点进行以下分析：(1)亚群分析，旨在评价事先规定的亚组之间结果(包括基线抗-TNF-状态[从未治疗与IR]、基线CS状态[在用CS与未在用CS]、基线IS状态[在用IS与未在用IS]、年龄、性别、人种/族裔等)的一致性；和(2)灵敏度分析，旨在评价初步分析方法的结果的稳健性(例如，处置中途退出)。

将对每个队列分别进行诱导期的功效分析，并且该分析将纳入经随机分配并接受至少一剂研究药物的全部患者(改良意向治疗人群[mITT])。患者将根据随机分配时分配的治疗分组。

队列1：当队列1中的全部患者(n＝300)已经完成第14周访视或如果没有完成，则已经停止参与该研究时，探索性分析终点将出现。此时，申办方将知晓队列1中的各个治疗分配情况。患者、研究中心监察员和研究者将保持盲知患者的特有治疗分配。

这项探索性分析将向关键性队列3告知分析计划，旨在评估PRO2终点定义和SES-CD终点定义的统计假设并旨在根据需要修正统计方法。对队列1的探索性分析不意在告知队列2或3的研究设计/实施或维持研究；它将因此在队列2正在进入时实施。

主要效力评估将使用Cochran-Mantel-Haenszel(CMH)检验，相对于安慰剂，检验第14周时每个etrolizumab剂量组中分别实现CDAI缓解和PRO2缓解的患者的比例的差异，分层根据随机分配时所用的分层因素按0.10显著性水平进行。将提供绝对治疗差异，连同90％双侧CI评估值。

将使用与主要终点相同的方法学，分析全部分类性次要终点。

将使用协方差(ANCOVA)分析模型以随机分配时所用的分层变量和所研究指标的基线值作为协变量，分析连续型终点。

将对每个治疗组就绝对变化和原始值而言计算连续型终点的汇总统计量。将报告均数、SD、中位数和下四分位数和上四分位及最小值和最大值。对于涉及距基线变化的全部总结，将从分析中排除无基线值的患者。除95％CI之外，还将报告全部次要疗效终点的双侧p-值。将不针对重复度进行修正。

队列2：将队列2视为“输入”队列以帮助实现维持研究的必需样本量。将对每个治疗组描述性总结全部的主要功效参数和次要功效参数。将通过使用描述性统计量，总结针对每个治疗组的人口统计特征和基线特征如年龄、性别、人种、地区、皮质类固醇类和免疫抑制剂使用情况、疾病持续时间和CD活性评分。

队列3：主要终点分析将相对于安慰剂组比较每个etrolizumab剂量组的第14周时实现PRO2缓解(分析供FDA)或CDAI缓解(分析供美国以外)的患者的比例。主要终点分析将相对于安慰剂组比较每个etrolizumab剂量组的第14周时实现PRO2缓解(分析供FDA)或CDAI缓解(分析供美国以外)的患者的比例。

将使用按随机分配时所用因素分层的CMH检验统计量，评价每个etrolizumab组和安慰剂组之间的差异。将提供绝对治疗差异，连同95％双侧CI评估值。

将使用与主要终点相同的方法学，分析全部分类性次要终点。对于全部疗效终点，将为每个治疗组提供描述性汇总统计结果。

将使用ANCOVA模型以随机分配时所用的分层变量和所研究指标的基线值作为协变量，分析连续型终点。

对于二次主要终点(低剂量与安慰剂和高剂量与安慰剂)比较的每一者，将使用Bonferroni修正的0.025双侧显著性水平。如果对主要终点宣布两种剂量均不显著，则全部其他假设检验将视为探索性。对于按双侧0.025水平显著的任何给药方案，将依次检验关键次要终点。将考虑剩余的次要终点和全部探索性终点以提供支持性信息并且将不进行多重比较的调整。

维持期的功效分析将纳入随机分配进入维持期并接受至少一剂研究药物(mITT群体)的全部etrolizumab诱导患者。患者将根据随机分配时分配的治疗分组进入维持期。

对于全部分类性终点，将使用按随机分配进入维持期时所用因素分层的CMH检验统计量，评价两个治疗组之间比例的差异。检验将按双侧0.05显著性水平进行。将提供绝对治疗差异，连同95％双侧CI评估值。将使用与主要终点相同的方法学，分析全部分类性次要终点。

将使用ANCOVA模型以随机分配时所用的分层变量和所研究指标的基线值作为协变量，分析连续型终点。

如果主要终点是统计显著的，将依次检验关键次要终点。

在特定时间点无法评估功效(例如，因为缺失数据或提早入选于OLE研究中)的患者将视为全部分类性终点的非反应者。

序列表

<110> 豪夫迈·罗氏有限公司

<120>治疗Crohn病的整联蛋白β7拮抗剂和方法

<130> P32628-WO

<140>

<141>

<150> 62/121,290

<151> 2015-02-26

<160> 32

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

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<221> 来源

<223> /注释=人工序列的描述: 合成的肽

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Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Thr Tyr Leu His

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<212> PRT

<213> 人工序列

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<223> /注释=人工序列的描述: 合成的肽

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Lys Tyr Ala Ser Gln Ser Ile Ser

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<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注释=人工序列的描述: 合成的肽

<400> 3

Gln Gln Gly Asn Ser Leu Pro Asn Thr

1 5

<210> 4

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注释=人工序列的描述: 合成的肽

<400> 4

Gly Phe Phe Ile Thr Asn Asn Tyr Trp Gly

1 5 10

<210> 5

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注释=人工序列的描述: 合成的肽

<400> 5

Gly Tyr Ile Ser Tyr Ser Gly Ser Thr Ser Tyr Asn Pro Ser Leu Lys

1 5 10 15

Ser

<210> 6

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注释=人工序列的描述: 合成的肽

<400> 6

Met Thr Gly Ser Ser Gly Tyr Phe Asp Phe

1 5 10

<210> 7

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注释=人工序列的描述: 合成的肽

<400> 7

Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Ser Leu Leu His

1 5 10

<210> 8

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注释=人工序列的描述: 合成的肽

<400> 8

Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Thr Leu Leu His

1 5 10

<210> 9

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注释=人工序列的描述: 合成的肽

<400> 9

Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Asp Leu Leu His

1 5 10

<210> 10

<211> 108

<212> PRT

<213> 鼠（Rattus sp.）

<400> 10

Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Thr Pro Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ile Ser Leu Ser Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Thr Tyr

20 25 30

Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asn Glu Ser Pro Arg Leu Leu Ile

35 40 45

Lys Tyr Ala Ser Gln Ser Ile Ser Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Ser Ile Asn Gly Val Glu Leu

65 70 75 80

Glu Asp Leu Ser Ile Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Asn Ser Leu Pro Asn

85 90 95

Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg

100 105

<210> 11

<211> 117

<212> PRT

<213> 鼠

<400> 11

Glu Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln

1 5 10 15

Ser Leu Ser Leu Thr Cys Ser Val Thr Gly Phe Phe Ile Thr Asn Asn

20 25 30

Tyr Trp Gly Trp Ile Arg Lys Phe Pro Gly Asn Lys Met Glu Trp Met

35 40 45

Gly Tyr Ile Ser Tyr Ser Gly Ser Thr Ser Tyr Asn Pro Ser Leu Lys

50 55 60

Ser Arg Ile Ser Ile Thr Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Phe Leu

65 70 75 80

Gln Leu Asn Ser Val Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala

85 90 95

Met Thr Gly Ser Ser Gly Tyr Phe Asp Phe Trp Gly Pro Gly Thr Met

100 105 110

Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 12

<211> 108

<212> PRT

<213> 人（Homo sapiens）

<400> 12

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Asn Tyr

20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn Ser Leu Pro Trp

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg

100 105

<210> 13

<211> 113

<212> PRT

<213> 人

<400> 13

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Val Ile Ser Gly Asp Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser

100 105 110

Ser

<210> 14

<211> 108

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注释=人工序列的描述: 合成的多肽

<400> 14

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Thr Tyr

20 25 30

Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Lys Tyr Ala Ser Gln Ser Ile Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Asn Ser Leu Pro Asn

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg

100 105

<210> 15

<211> 117

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注释=人工序列的描述: 合成的多肽

<400> 15

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Phe Ile Thr Asn Asn

20 25 30

Tyr Trp Gly Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Gly Tyr Ile Ser Tyr Ser Gly Ser Thr Ser Tyr Asn Pro Ser Leu Lys

50 55 60

Ser Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr Leu

65 70 75 80

Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala

85 90 95

Met Thr Gly Ser Ser Gly Tyr Phe Asp Phe Trp Gly Gln Gly Thr Leu

100 105 110

Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 16

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注释=人工序列的描述: 合成的肽

<400> 16

Ala Met Thr Gly Ser Ser Gly Tyr Phe Asp Phe

1 5 10

<210> 17

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注释=人工序列的描述: 合成的肽

<400> 17

Ala Arg Thr Gly Ser Ser Gly Tyr Phe Asp Phe

1 5 10

<210> 18

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注释=人工序列的描述: 合成的肽

<400> 18

Ala Gln Thr Gly Ser Ser Gly Tyr Phe Asp Phe

1 5 10

<210> 19

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注释=人工序列的描述: 合成的肽

<400> 19

Arg Thr Gly Ser Ser Gly Tyr Phe Asp Phe

1 5 10

<210> 20

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注释=人工序列的描述: 合成的肽

<400> 20

Arg Tyr Ala Ser Gln Ser Ile Ser

1 5

<210> 21

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注释=人工序列的描述: 合成的肽

<220>

<221> MOD_RES

<222> (1)..(1)

<223> Any amino acid

<400> 21

Xaa Tyr Ala Ser Gln Ser Ile Ser

1 5

<210> 22

<211> 108

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注释=人工序列的描述: 合成的多肽

<400> 22

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Ser Leu

20 25 30

Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Lys Tyr Ala Ser Gln Ser Ile Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Asn Ser Leu Pro Asn

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg

100 105

<210> 23

<211> 108

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注释=人工序列的描述: 合成的多肽

<400> 23

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Thr Leu

20 25 30

Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Lys Tyr Ala Ser Gln Ser Ile Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Asn Ser Leu Pro Asn

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg

100 105

<210> 24

<211> 108

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注释=人工序列的描述: 合成的多肽

<400> 24

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Asp Leu

20 25 30

Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Lys Tyr Ala Ser Gln Ser Ile Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Asn Ser Leu Pro Asn

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg

100 105

<210> 25

<211> 117

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注释=人工序列的描述: 合成的多肽

<400> 25

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Phe Ile Thr Asn Asn

20 25 30

Tyr Trp Gly Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Gly Tyr Ile Ser Tyr Ser Gly Ser Thr Ser Tyr Asn Pro Ser Leu Lys

50 55 60

Ser Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Thr Ser Lys Asn Thr Phe Tyr Leu

65 70 75 80

Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala

85 90 95

Met Thr Gly Ser Ser Gly Tyr Phe Asp Phe Trp Gly Gln Gly Thr Leu

100 105 110

Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 26

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注释=人工序列的描述: 合成的肽

<220>

<221> 变体

<222> (2)..(2)

<223> /置换="Gly"或"Ser"或"Thr"或"Val"

<220>

<221> 变体

<222> (3)..(3)

<223> /置换="Gly"或"Ile"或"Lys"或"Asn"或"Pro"或"Gln"或"Arg"或"Thr"

<220>

<221> 变体

<222> (4)..(4)

<223> /置换="Val"或"Gln"或"Ala"或"Asp"或"Gly"或"His" 或"Ile"或"Lys"或"Leu"或"Asn"或"Arg"

<220>

<221> 变体

<222> (5)..(5)

<223> /置换="Tyr"或"Ala"或"Asp"或"Gly"或"His"或"Ile" 或"Lys"或"Asn"或"Pro"或"Arg"或"Thr"或"Val"

<220>

<221> 变体

<222> (6)..(6)

<223> /置换="Arg"或"Ile"或"Ala"或"Gly"或"Lys"或"Leu"或"Met"或"Gln"

<220>

<221> 变体

<222> (7)..(7)

<223> /置换="Val"或"Ser"或"Ala"或"Glu"或"Gly"或"His"或"Ile"或"Lys"或"Leu"或"Asn"或"Pro"或"Ser"或"Thr"

<220>

<221> 变体

<222> (8)..(8)

<223> /置换="Gly"或"Asn"或"Glu"或"Thr"或"Pro"或"Ser"

<220>

<221> 变体

<222> (9)..(9)

<223> /置换="Tyr"或"Ile"或"Met"

<220>

<221> 变体

<222> (10)..(10)

<223> /置换="Ala"或"Ile"或"Met"或"Val"

<220>

<221> 变体

<222> (11)..(11)

<223> /置换="Tyr"或"Phe"或"Ser"

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (1)..(11)

<223> /注释=序列中给出的变体残基，就针对变体位置的注释中那些而言没有偏好

<400> 26

Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Asp Leu Leu His

1 5 10

<210> 27

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注释=人工序列的描述: 合成的肽

<220>

<221> MOD_RES

<222> (1)..(1)

<223> 任何氨基酸

<220>

<221> 变体

<222> (4)..(4)

<223> /置换="Asp"

<220>

<221> 变体

<222> (5)..(5)

<223> /置换="Ser"

<220>

<221> 变体

<222> (6)..(6)

<223> /置换="Asp"或"Leu"或"Arg"

<220>

<221> 变体

<222> (7)..(7)

<223> /置换="Val"或"Glu"或"Lys"

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (1)..(8)

<223> /注释=序列中给出的变体残基，就针对变体位置的注释中那些而言没有偏好

<220>

<223> 就置换的详细描述和具体实施方案参见提交的说明书

<400> 27

Xaa Tyr Ala Ser Gln Ser Ile Ser

1 5

<210> 28

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注释=人工序列的描述: 合成的肽

<220>

<221> 变体

<222> (8)..(8)

<223> /置换="Val"或"Trp"或"Tyr"或"Arg"或"Ser"或"Thr"或"Ala"或"Phe"或"His"或"Ile"或"Leu"或"Met"

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (1)..(9)

<223> /注释=序列中给出的变体残基，就针对变体位置的注释中那些而言没有偏好

<400> 28

Gln Gln Gly Asn Ser Leu Pro Asn Thr

1 5

<210> 29

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注释=人工序列的描述: 合成的肽

<220>

<221> 变体

<222> (2)..(2)

<223> /置换="Phe"或"Val"或"Asp"

<220>

<221> 变体

<222> (6)..(6)

<223> /置换="Gly"

<220>

<221> 变体

<222> (10)..(10)

<223> /置换="Tyr"

<220>

<221> 变体

<222> (12)..(12)

<223> /置换="Thr"或"Ala"或"Asp"

<220>

<221> 变体

<222> (13)..(13)

<223> /置换="His"或"Asp"或"Ala"

<220>

<221> 变体

<222> (15)..(15)

<223> /置换="Val"

<220>

<221> 变体

<222> (17)..(17)

<223> /置换="Gly"

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (1)..(17)

<223> /注释=序列中给出的变体残基，就针对变体位置的注释中那些而言没有偏好

<400> 29

Gly Tyr Ile Ser Tyr Ser Gly Ser Thr Ser Tyr Asn Pro Ser Leu Lys

1 5 10 15

Ser

<210> 30

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注释=人工序列的描述: 合成的肽”

<220>

<221> 变体

<222> (1)..(1)

<223> /置换=" "

<220>

<221> 变体

<222> (2)..(2)

<223> /置换="Met"或"Ala"或"Glu"或"Gly"或"Gln"或"Ser"

<220>

<221> 变体

<222> (11)..(11)

<223> /置换="Tyr"

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (1)..(11)

<223> /注释=序列中给出的变体残基，就针对变体位置的注释中那些而言没有偏好

<400> 30

Ala Arg Thr Gly Ser Ser Gly Tyr Phe Asp Phe

1 5 10

<210> 31

<211> 108

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注释=人工序列的描述: 合成的多肽

<400> 31

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Asp Leu

20 25 30

Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Lys Tyr Ala Ser Gln Ser Ile Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Asn Ser Leu Pro Asn

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg

100 105

<210> 32

<211> 117

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注释=人工序列的描述: 合成的多肽

<400> 32

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Phe Ile Thr Asn Asn

20 25 30

Tyr Trp Gly Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Gly Tyr Ile Ser Tyr Ser Gly Ser Thr Ser Tyr Asn Pro Ser Leu Lys

50 55 60

Ser Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Thr Ser Lys Asn Thr Phe Tyr Leu

65 70 75 80

Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala

85 90 95

Arg Thr Gly Ser Ser Gly Tyr Phe Asp Phe Trp Gly Gln Gly Thr Leu

100 105 110

Val Thr Val Ser Ser

115