一种流式细胞仪分析用溶血素及其制备方法

技术领域

本发明涉及体外诊断领域，具体涉及一种流式细胞仪分析用溶血素及其制备方法。

背景技术

流式细胞术是在细胞分子水平上通过单克隆抗体对单个细胞或其他生物粒子进行多参数、快速的定量分析。目前主要应用于免疫学、血液学、肿瘤学、细胞遗传学、细胞生物学、生物化学等临床医学和基础医学研究领域，如细胞表面分子的淋巴细胞及其亚群分析和细胞内细胞因子分析等。随着医疗诊断的不断发展，对于流式细胞术的应用也日渐增多，其配套使用的试剂的种类也越来越多。

溶血素作为在进行细胞表面分子的淋巴细胞及其亚群分析和细胞内细胞因子分析的过程中必不可少的配套试剂之一。溶血素的作用主要是裂解红细胞并释放出血红蛋白的物质，从而更加有利于白细胞分群、细胞表面分子的淋巴细胞及其亚群和细胞内细胞因子的分析。现有溶血素的配方中均有氯化铵的添加，甚至以其为主要成分，这种试剂缺点在于容易造成白细胞分群不明显，且容易对细胞本身形态造成破坏，使细胞大小发生改变。

因此，提高溶血素裂解效果的同时，减少对白细胞的损害，维持细胞原有状态，提高分群效果是亟待解决的问题

发明内容

为了解决上述问题，提高溶血素对红细胞的裂解效果，减少对白细胞的损害，维持白细胞原有状态，提高分群效果，本发明提供了一种流式细胞仪分析用溶血素，以甲醛为裂解红细胞的主要因子，通过添加柠檬酸三钠减缓红细胞的凝固、促进红细胞裂解，二乙二醇和乙二胺四乙酸二钠相互作用，在流式细胞分析过程中提高了白细胞的分散程度，使白细胞分群效果更好。本溶血素在在维持细胞稳定的同时，提高了对红细胞的裂解效果和分群效果。

具体的，本发明技术方案如下：

流式细胞仪分析用溶血素，所述溶血素的成分包括甲醛、柠檬酸三钠、二乙二醇、乙二胺四乙酸二钠和防腐剂的磷酸盐缓冲液。

进一步的，所述溶血素包括如下含量的成分：

进一步的，所述溶血素包括如下含量的成分：

进一步的，防腐剂为Proclin 300或叠氮钠。

进一步的，所述溶血素在25℃下的pH值为7.2～7.4。

本发明还提供一种制备上述流式细胞仪分析用溶血素的方法，包括以下步骤：

1)取柠檬酸三钠和乙二胺四乙酸二钠溶于磷酸盐缓冲液中，得到混合液；

2)混合液中加入甲醛、二乙二醇和防腐剂，混合均匀后，将pH值调为7.2～7.4；

3)以磷酸盐缓冲液将步骤2)得到的溶液定容至100mL；

4)将步骤3)中得到的溶液经过0.22微米的滤膜过滤后得到浓缩型溶血素；

5)将步骤4)中的浓缩型溶血素以去离子水稀释10倍，混匀，得到流式细胞仪分析用溶血素。

本发明一种流式细胞仪分析用溶血素及其制备方法的有益效果是，添加柠檬酸三钠，减缓了全血中血细胞的凝固同时促进了红细胞的裂解。乙二胺四乙酸二钠和二乙二醇相互作用在流式细胞分析过程中提高了白细胞的分散程度，使白细胞分群效果更好。本溶血素未添加氯化铵，较添加氯化铵的试剂相比，本溶血素在流式细胞分析中，使得淋巴细胞、单核细胞和中性粒细胞的分群效果更好，尤其是使淋巴细胞和单核细胞的分群更加明显；本溶血素在流式细胞检测中减少了在运用溶血素裂解红细胞过程中对白细胞造成的损害，使细胞碎片数量显著降低，提高了淋巴细胞、单核细胞和中性粒细胞的检出比例，使白细胞维持在一个稳定的状态，提高了检测的准确度和精密度。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。

图1为实施例1和对比例对照样本(全血)检测结果图；

图2为对比例1溶血素红细胞裂解效果检测结果图；

图3为实施例1制备的溶血素红细胞裂解效果检测结果图；

图4为实施例1制备的溶血素裂解红细胞后白细胞分群效果图；

图5为对比例1溶血素裂解红细胞后白细胞分群效果图；

图6为实施例1制备的溶血素作用下CD8-PE检测结果图；

图7为对比例1溶血素作用下CD8-PE检测结果图。

具体实施方式

下面通过具体的实施方案叙述本发明。除非特别说明，本发明中所用的技术手段均为本领域技术人员所公知的方法。另外，实施方案应理解为说明性的，而非限制本发明的范围，本发明的实质和范围仅由权利要求书所限定。对于本领域技术人员而言，在不背离本发明实质和范围的前提下，对这些实施方案中的物料成分和用量进行的各种改变或改动也属于本发明的保护范围。

实施例1

一种流式细胞仪分析用溶血素，包括甲醛、柠檬酸三钠、二乙二醇、乙二胺四乙酸二钠和防腐剂的磷酸盐缓冲液，

所述试剂成分和含量如下：

按更优配方进行溶血素制备，制备步骤如下：

1)分别称取2.5g柠檬酸三钠和0.2g乙二胺四乙酸二钠溶于90mL磷酸盐缓冲液中，溶解混匀。

2)在步骤1)得到的混合溶液中加入15mL甲醛、40mL二乙二醇和0.05mL Proclin300，混合均匀后，将pH值调为7.2～7.4。

3)运用磷酸盐缓冲液将步骤2)得到的混合溶液体积定容至100mL。

4)将步骤3)中得到的混合溶液经过0.22微米的滤膜过后最终得到浓缩型溶血素。

5)将步骤4)中的浓缩型溶血素吸取1mL，加入9mL去离子水稀释混匀后即可使用。

对比例1

按最优比例对实施例1制备的溶血素进行配制，与添加氯化铵的溶血素进行对比，该溶血素配方为：

制备步骤如下：

1)分别称取8g氯化铵、0.84碳酸氢钠和0.37g乙二胺四乙酸二钠溶于90mL磷酸盐缓冲液中，溶解混匀，将pH值调为7.2～7.4。

2)运用去离子水将步骤2)得到的混合溶液体积定容至100mL。

3)将步骤2)中得到的混合溶液经过0.22微米的滤膜过后最终得到溶血素。

实施例1制备的溶血素与对比例1溶血素红细胞裂解效果对比。

实验步骤:

取20μL EDTA抗凝全血于1.5mL离心管中，加入480μL溶血素，混匀，裂解15min。取裂解后溶液20μL于载玻片上，涂片后用瑞氏-姬姆萨染液进行细胞染色，冲洗后观察效果。以全血加入无菌水稀释后的溶液为对照。

实验结果如图1、图2和图3所示，通过瑞氏-姬姆萨染液染色后，实施例1制备的溶血素和对比例1溶血素对红细胞的裂解效果运用显微镜观察后差异并不明显，均能够完全裂解血液中的红细胞。因此我们进行上机检测，对其分群情况进行检测。

实施例2

实施例1制备的溶血素与对比例1溶血素裂解红细胞后白细胞分群效果对比。

实验步骤：

取4μL CD45-PerCP荧光标记抗体，加入50μL EDTA抗凝全血，振荡混匀3-5s，避光孵育15min。加入450μL溶血素，振荡混匀，避光孵育15min；将待测样本经流式细胞仪分析，查看白细胞分群情况。

实验结果如图4和图5所示(图中A、B、C和D分别表示细胞碎片、中性粒细胞、单核细胞和淋巴细胞)，实施例1制备的溶血素和对比例1溶血素裂解红细胞后，实施例1中白细胞分群明显，尤其是淋巴细胞和单核细胞(图4和5中B和C)分群情况明显优于对比例1；实施例1中的细胞碎片比例为3.05％显著少于对比例1细胞碎片比例48.57％；实施例1中淋巴细胞、单核细胞和中性粒细胞(图4和5中A、B和C)的比例显著高于对比例1，尤其是流式分析中检测白细胞分化抗原所设门用的淋巴细胞比例显著高于对比例1(实施例22.64％，对比例14.51％)。综上实施例1溶血素对红细胞的裂解效果要显著优于对比例1。

实施例3

实施例1制备的溶血素和对比例1溶血素对蛋白靶标的检测效果对比。

取10μL CD8-PE/CD45-PerCP荧光标记抗体，加入50μL EDTA抗凝全血，振荡混匀3-5s，避光孵育15min。加入450μL溶血素，振荡混匀，避光孵育15min。将待测样本经流式细胞仪分析，查看检测结果。

实验结果如图6和图7所示，从图6中也可看出实施例1中CD8-PE的阳性比例为32.95％，而图7中对比例阳性比例为23.85％，要显著低于实施例1。因此实施例1效果要显著优于对比例1。

通过上述三个实施例，可以看出以甲醛为裂解红细胞的主要因子，通过添加柠檬酸三钠减缓红细胞凝固并且促进红细胞裂解，二乙二醇和乙二胺四乙酸二钠相互作用，在流式细胞分析过程中提高了白细胞的分散程度，使白细胞分群效果更好。与添加氯化铵的溶血素相比，本溶血素在维持细胞稳定性、减少细胞损伤和提高分群效果的作用要更加显著。